Una guía paso a paso para la electroantenografía de mosquitos
Summary
El presente artículo detalla un protocolo paso a paso para electroantennogramas exitosos y de bajo ruido en varios géneros de mosquitos, incluyendo hembras y machos.
Abstract
Los mosquitos hembra son los animales más mortales de la tierra, cobrando la vida de más de 1 millón de personas cada año debido a los patógenos que transmiten al adquirir una harina de sangre. Para localizar un huésped del que alimentarse, los mosquitos dependen de una amplia gama de señales sensoriales, incluidas visuales, mecánicas, térmicas y olfativas. El estudio detalla una técnica, la electroantenografía (EAG), que permite a los investigadores evaluar si los mosquitos pueden detectar sustancias químicas individuales y mezclas de sustancias químicas de una manera dependiente de la concentración. Cuando se combina con cromatografía de gases (GC-EAG), esta técnica permite exponer las antenas a una mezcla completa de espacio de cabeza / complejo y determina qué productos químicos presentes en la muestra de interés, el mosquito puede detectar. Esto es aplicable a los olores corporales del huésped, así como a los ramos florales de plantas u otros olores ecológicamente relevantes (por ejemplo, odorantes de sitios de oviposición). Aquí, describimos un protocolo que permite largas duraciones de tiempo de respuesta de preparación y es aplicable tanto a mosquitos hembras como machos de múltiples géneros, incluidos los mosquitos Aedes, Culex, Anopheles y Toxorhynchites . Como el olfato juega un papel importante en las interacciones mosquito-huésped y la biología del mosquito en general, los EAG y GC-EAG pueden revelar compuestos de interés para el desarrollo de nuevas estrategias de control de vectores de enfermedades (por ejemplo, cebos). Complementado con ensayos de comportamiento, se puede determinar la valencia (por ejemplo, atrayente, repelente) de cada sustancia química.
Introduction
Los mosquitos son los organismos más mortales de la tierra, cobran la vida de más de un millón de personas por año y ponen a más de la mitad de la población mundial en riesgo de exposición a los patógenos que transmiten, mientras pican1. Estos insectos dependen de una amplia gama de señales (es decir, térmicas, visuales, mecánicas, olfativas, auditivas) para localizar un huésped del que alimentarse (tanto vegetal como animal), para aparearse y oviponerse, así como para evitar depredadores tanto en la etapa larvaria como en la adulta 2,3. Entre estos sentidos, el olfato juega un papel crítico en los comportamientos antes mencionados, en particular para la detección de moléculas odoríferas de mediano a largo alcance 2,3. Los olores emitidos por un huésped o un sitio de oviposición son detectados por varios receptores olfativos específicos (por ejemplo, GRs, ORs, IRs) localizados en los palpos del mosquito probóscide, tarso y antenas 2,3.
Como el olfato es un componente clave de sus comportamientos de búsqueda de huéspedes (plantas y animales), apareamiento y oviposición, constituye un objetivo ideal para estudiar el desarrollo de nuevas herramientas para el control de mosquitos4. La investigación sobre repelentes (por ejemplo, DEET, IR3535, picaridina) y cebos (por ejemplo, señuelo humano centinela BG) es extremadamente prolífica5, pero debido a los desafíos actuales en el control de mosquitos (por ejemplo, resistencia a insecticidas, especies invasoras), es esencial desarrollar nuevos métodos de control eficientes informados por la biología del mosquito.
Se han utilizado muchas técnicas (por ejemplo, olfatómetro, ensayos de aterrizaje, electrofisiología) para evaluar la bioactividad de compuestos o mezclas de compuestos en mosquitos. Entre ellos, la electroantennografía (o electroantennogramas (EAG)) se puede utilizar para determinar si los olores son detectados por las antenas del mosquito. Esta técnica fue desarrollada inicialmente por Schneider6 y se ha utilizado en muchos géneros de insectos diferentes desde entonces, incluidas las polillas 7,8,9, los abejorros 10,11, las abejas melíferas 12,13 y las moscas de la fruta 14,15, por nombrar algunas. La electroantennografía también se ha empleado utilizando varios protocolos, incluyendo antenas únicas o múltiples en mosquitos 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
Los mosquitos son insectos relativamente pequeños y delicados con antenas bastante delgadas. Si bien realizar EAG en insectos más grandes como polillas o abejorros es relativamente fácil debido a su mayor tamaño y antenas más gruesas, la realización de EAG en mosquitos puede ser un desafío. En particular, mantener una buena relación señal-ruido y una preparación receptiva duradera son dos requisitos principales para la reproducibilidad y fiabilidad de los datos.
La guía paso a paso para los EAG de bajo ruido propuesta aquí ofrece directamente soluciones a estas limitaciones y hace que este protocolo sea aplicable a varias especies de mosquitos de varios géneros, incluidos Aedes, Anopheles, Culex y Toxorhynchites, y describe la técnica tanto para hembras como para machos. La electroantennografía ofrece una forma rápida pero confiable de detectar y determinar compuestos bioactivos que luego pueden aprovecharse en el desarrollo del cebo después de que se haya determinado la valencia con ensayos de comportamiento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los comportamientos mediados olfativos se ven afectados por muchos factores, incluidos los fisiológicos (por ejemplo, edad, hora del día) y ambientales (por ejemplo, temperatura, humedad relativa)30. Por lo tanto, al realizar EAGs, es esencial utilizar insectos que se encuentren en el mismo estado fisiológico (es decir, monitorear la edad, morir de hambre, aparearse)31 y también mantener un ambiente cálido y húmedo alrededor de la preparación para evitar la desecaci?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradezco al Dr. Clément Vinauger y al Dr. Jeffrey Riffell por sus útiles discusiones. Los siguientes reactivos se obtuvieron a través de BEI Resources, NIAID, NIH: Anopheles stephensi, Strain STE2, MRA-128, contribución de Mark Q. Benedict; Aedes aegypti, Strain ROCK, MRA-734, contribución de David W. Severson; Culex quinquefasciatus, cepa JHB, huevos, NR-43025. El autor agradece al Dr. Jake Tu, a la Dra. Nisha Duggal, al Dr. James Weger y a Jeffrey Marano por proporcionar huevos de mosquito Culex quinquefasciatus y Anopheles stephensi (cepa: Liston). Aedes albopictus y Toxorhynchites rutilus septentrionalis se derivan de mosquitos de campo recolectados por el autor en el área de New River Valley (VA, EUA). Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Bioquímica y el Instituto de Ciencias de la Vida Fralin.
Materials
| Air table Clean Bench | TMC | https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess | Noise reducer |
| Analog-to-digital board | National Instruments | BNC-2090A | |
| Benchtop Flowbuddy Complete | Genesee Scientific | 59-122BC | To anesthesize mosquitoes |
| Borosillicate glass capillary | Sutter Instrument | B100-78-10 | To make the recording and references capillaries |
| Chemicals | Sigma Aldrich | Benzaldehyde: 418099-100 mL; Butyric acid: B103500-100mL; 1-Hexanol: 471402-100mL; Mineral oil: M8410-1L | Chemicals used for the experiments presented here |
| CO2 | Airgas or Praxair | N/A | To anesthesize mosquitoes |
| Cold Light Source | Volpi | NCL-150 | |
| Disposable syringes | BD | 1 mL (309628) / 3 mL (309657) | |
| Electrode cables | World Precision Instruments | 5371 | |
| Electrode gel salt free | Parkerlabs | 12-08-Spectra-360 | |
| Faraday cage | TMC | https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages | Noise reducer |
| Flowmeters | Bel-art | 65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075) | One of each |
| GCMS vials and caps | Thermo-fisher scientific | 2-SVWKA8-CPK | To prepare odorant dilutions |
| Glass syringes (Fortuna) | Sigma Aldrich | Z314307 | For odor delivery to the EAG prep |
| Humbug | Quest Scientific | http://www.quest-sci.com/ | Noise reducer |
| 2 mm Jack Holder, Narrow, 90 deg., With Wire | A-M Systems | 675748 | Electrode holder |
| Magnetic bases | Kanetec | MB-FX | x 2 |
| MATLAB + Toolboxes | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | For delivering the pulses |
| Medical air | Airgas or Praxair | N/A | For main airline |
| Microscope | Nikkon | SMZ-800N | |
| Micromanipulators Three-Axis Coarse/Fine Compact Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | x 2 |
| Microelectrode amplifier with headstage | A-M Systems | Model 1800 | |
| Mosquito rearing supplies | Bioquip | https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp | |
| Needles | BD | 25G (305127) / 21G (305165) | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | For odor delivery to the EAG prep |
| PTFE Tubing of different diameters | Mc Master Carr | N/A | To connect solenoid valve, flowmeter, airline ect. |
| 30V/5A DC Power Supply | Dr. Meter | PS-305DM | |
| R version 3.5.1 | R project | https://www.r-project.org/ | For data analyses |
| Relay for solenoid valve | N/A | Custom made | |
| Silver wire 0.01” | A-M Systems | 782500 | |
| Solenoid valve (3-way) | The Lee Company | LHDA0533115H | |
| WinEDR software | Strathclyde Electrophysiology Software | WinEDR V3.9.1 | For EAG recording |
| Whatman paper | Cole Parmer | UX-06648-03 | To load chemical in glass syringe / Pasteur pipette |
Referências
- World Health Organization. World health statistics 2019: monitoring health for the SDGs, sustainable development goals. World Health Organization. , (2019).
- Takken, W. The role of olfaction in host-seeking of mosquitoes: a review. International Journal of Tropical Insect Science. 12 (1-2-3), 287-295 (1991).
- Zwiebel, L. J., Takken, W. Olfactory regulation of mosquito-host interactions. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 645-652 (2004).
- Potter, C. J. Stop the biting: targeting a mosquito’s sense of smell. Cell. 156 (5), 878-881 (2014).
- Paluch, G., Bartholomay, L., Coats, J. Mosquito repellents: a review of chemical structure diversity and olfaction. Pest Management Science. 66 (9), 925-935 (2010).
- Schneider, D. Electrophysiological investigation on the antennal receptors of the silk moth during chemical and mechanical stimulation. Experientia. 13 (2), 89-91 (1957).
- Raguso, R. A., Light, D. M., Pickersky, E. Electroantennogram responses of Hyles lineata (Sphingidae: Lepidoptera) to volatile compounds from Clarkia breweri (Onagraceae) and other moth-pollinated flowers. Journal of Chemical Ecology. 22 (10), 1735-1766 (1996).
- Schweitzer, E. S., Sanes, J. R., Hildebrand, J. G. Ontogeny of electroantennogram responses in the moth, Manduca sexta. Journal of Insect Physiology. 22 (7), 955-960 (1976).
- Martel, V., Anderson, P., Hansson, B. S., Schlyter, F. Peripheral modulation of olfaction by physiological state in the Egyptian leaf worm Spodoptera littoralis (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Physiology. 55 (9), 793-797 (2009).
- Spaethe, J., Brockmann, A., Halbig, C., Tautz, J. Size determines antennal sensitivity and behavioral threshold to odors in bumblebee workers. Naturwissenschaften. 94 (9), 733-739 (2007).
- Suchet, C., et al. Floral scent variation in two Antirrhinum majus subspecies influences the choice of naïve bumblebees. Behavioral Ecology and Sociobiology. 65 (5), 1015-1027 (2011).
- De Jong, R., Pham-Delègue, M. H. Electroantennogram responses related to olfactory conditioning in the honeybee (Apis mellifera ligustica). Journal of Insect Physiology. 37 (4), 319-324 (1991).
- Patte, F., Etcheto, M., Marfaing, P., Laffort, P. Electroantennogram stimulus-response curves for 59 odourants in the honeybee, Apis mellifica. Journal of Insect Physiology. 35 (9), 667-675 (1989).
- Alcorta, E. Characterization of the electroantennogram in Drosophila melanogaster and its use for identifying olfactory capture and transduction mutants. Journal of Neurophysiology. 65 (3), 702-714 (1991).
- Park, K. C., Ochieng, S. A., Zhu, J., Baker, T. C. Odor discrimination using insect electroantennogram responses from an insect antennal array. Chemical Senses. 27 (4), 343-352 (2002).
- Du, Y. J., Millar, J. G. Electroantennogram and oviposition bioassay responses of Culex quinquefasciatus and Culex tarsalis (Diptera: Culicidae) to chemicals in odors from Bermuda grass infusions. Journal of Medical Entomology. 36 (2), 158-166 (1999).
- Costantini, C., et al. Electroantennogram and behavioural responses of the malaria vector Anopheles gambiae to human-specific sweat components. Medical and Veterinary Entomology. 15 (3), 259-266 (2001).
- Collins, L. E., Blackwell, A. Electroantennogram studies of potential oviposition attractants for Toxorhynchites moctezuma and T. amboinensis mosquitoes. Physiological Entomology. 23 (3), 214-219 (1998).
- Seenivasagan, T., Sharma, K. R., Sekhar, K., Ganesan, K., Prakash, S., Vijayaraghavan, R. Electroantennogram, flight orientation, and oviposition responses of Aedes aegypti to the oviposition pheromone n-heneicosane. Parasitology Research. 104 (4), 827-833 (2009).
- Puri, S. N., Mendki, M. J., Sukumaran, D., Ganesan, K., Prakash, S., Sekhar, K. Electroantennogram and behavioral responses of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) females to chemicals found in human skin emanations. Journal of Medical Entomology. 43 (2), 207-213 (2014).
- Cooperband, M. F., McElfresh, J. S., Millar, J. G., Carde, R. T. Attraction of female Culex quinquefasciatus Say (Diptera: Culicidae) to odors from chicken feces. Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1184-1192 (2008).
- Dekker, T., Ignell, R., Ghebru, M., Glinwood, R., Hopkins, R. Identification of mosquito repellent odours from Ocimum forskolei. Parasites & Vectors. 4 (1), 183 (2011).
- Choo, Y. M., et al. Reverse chemical ecology approach for the identification of an oviposition attractant for Culex quinquefasciatus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 714-719 (2018).
- Wolff, G. H., Lahondère, C., Vinauger, C., Riffell, J. A. Neuromodulation and differential learning across mosquito species. bioRxiv. , 755017 (2019).
- Lahondère, C., et al. The olfactory basis of orchid pollination by mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (1), 708-716 (2020).
- Beyenbach, K., Masia, R. Membrane conductances of principal cells in Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 48, 375-386 (2002).
- Oesterle, A. . The Pipette Cookbook. , (2018).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2018).
- Afify, A., Betz, J. F., Riabinina, O., Lahondère, C., Potter, C. J. Commonly used insect repellents hide human odors from Anopheles mosquitoes. Current Biology. 29 (21), 3669-3680 (2019).
- Martin, F., Riveron, J., Alcorta, E. Environmental temperature modulates olfactory reception in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 57 (12), 1631-1642 (2011).
- Qiu, Y. T., Gort, G., Torricelli, R., Takken, W., van Loon, J. J. Effects of blood-feeding on olfactory sensitivity of the malaria mosquito Anopheles gambiae: application of mixed linear models to account for repeated measurements. Journal of Insect Physiology. 59 (11), 1111-1118 (2013).
- Taylor, B., Jones, M. D. R. The circadian rhythm of flight activity in the mosquito Aedes aegypti (L.): the phase-setting effects of light-on and light off. Journal of Experimental Biology. 51 (1), 59-70 (1969).
- Eilerts, D. F., VanderGiessen, M., Bose, E. A., Broxton, K., Vinauger, C. Odor-specific daily rhythms in the olfactory sensitivity and behavior of Aedes aegypti mosquitoes. Insects. 9 (4), 147 (2018).
- Krishnan, B., Dryer, S. E., Hardin, P. E. Circadian rhythms in olfactory responses of Drosophila melanogaster. Nature. 400 (6742), 375-378 (1999).
- Pelletier, J., Guidolin, A., Syed, Z., Cornel, A. J., Leal, W. S. Knockdown of a mosquito odorant-binding protein involved in the sensitive detection of oviposition attractants. Journal of Chemical Ecology. 36 (3), 245-248 (2010).
