Um guia passo-a-passo para eletroantennografia de mosquitos
Summary
O presente artigo detalha um protocolo passo-a-passo para eletroantennogramas bem sucedidos e de baixo ruído em vários gêneros de mosquitos, incluindo fêmeas e machos.
Abstract
As fêmeas de mosquitos são os animais mais mortais do planeta, ceifando a vida de mais de 1 milhão de pessoas todos os anos devido aos patógenos que transmitem ao adquirir uma refeição de sangue. Para localizar um hospedeiro para se alimentar, os mosquitos dependem de uma ampla gama de pistas sensoriais, incluindo visuais, mecânicas, térmicas e olfativas. O estudo detalha uma técnica, a eletroantennografia (EAG), que permite aos pesquisadores avaliar se os mosquitos podem detectar produtos químicos individuais e misturas de produtos químicos de maneira dependente da concentração. Quando acoplada à cromatografia gasosa (GC-EAG), esta técnica permite expor as antenas a uma mistura completa de headspace/complexo e determina quais produtos químicos presentes na amostra de interesse, o mosquito pode detectar. Isso é aplicável a odores corporais do hospedeiro, bem como buquês florais de plantas ou outros odores ecologicamente relevantes (por exemplo, locais de oviposição, odorantes). Aqui, descrevemos um protocolo que permite longas durações de tempo de resposta ao preparo e é aplicável a mosquitos fêmeas e machos de vários gêneros, incluindo mosquitos Aedes, Culex, Anopheles e Toxorhynchites . Como o olfato desempenha um papel importante nas interações mosquito-hospedeiro e na biologia do mosquito em geral, EAGs e GC-EAG podem revelar compostos de interesse para o desenvolvimento de novas estratégias de controle de vetores de doenças (por exemplo, iscas). Complementado com ensaios comportamentais, a valência (por exemplo, atrativo, repelente) de cada produto químico pode ser determinada.
Introduction
Os mosquitos são os organismos mais mortais do planeta, ceifando a vida de mais de um milhão de pessoas por ano e colocando mais da metade da população mundial em risco de exposição aos patógenos que transmitem, ao picar1. Esses insetos dependem de uma ampla gama de pistas (térmicas, visuais, mecânicas, olfativas, auditivas) para localizar um hospedeiro para se alimentar (tanto vegetal quanto animal), para acasalamento e oviposição, bem como para evitar predadores nas fases larval e adulta 2,3. Dentre esses sentidos, o olfato desempenha um papel crítico nos comportamentos acima mencionados, em particular para a detecção de moléculas odorantes de médio a longo alcance 2,3. Odores emitidos por um hospedeiro ou um sítio de oviposição são detectados por vários receptores olfatórios específicos (por exemplo, RGs, ORs, IRs) localizados nos palpos do mosquito, probóscide, tarsos e antenas 2,3.
Como o olfato é um componente-chave de seus comportamentos de busca de hospedeiros (vegetais e animais), acasalamento e oviposição, constitui-se, portanto, um alvo ideal a ser estudado para o desenvolvimento de novas ferramentas para o controle de mosquitos4. A pesquisa de repelentes (por exemplo, DEET, IR3535, picaridina) e iscas (por exemplo, isca humana sentinela BG) é extremamente prolífica5, mas devido aos desafios atuais no controle de mosquitos (por exemplo, resistência a inseticidas, espécies invasoras), é essencial desenvolver novos métodos de controle eficientes informados pela biologia do mosquito.
Muitas técnicas (por exemplo, olfatômetro, ensaios de aterrissagem, eletrofisiologia) têm sido usadas para avaliar a bioatividade de compostos ou misturas de compostos em mosquitos. Entre eles, a eletroantenografia (ou eletroantennogramas (EAGs)) pode ser usada para determinar se os odorantes são detectados pelas antenas do mosquito. Esta técnica foi inicialmente desenvolvida por Schneider6 e tem sido utilizada em diversos gêneros de insetos desde então, incluindo mariposas 7,8,9, mamangavas 10,11, abelhas 12,13 e moscas-das-frutas 14,15, entre outras. A eletroantenografia também tem sido empregada por meio de vários protocolos, incluindo antenas únicas ou múltiplas em mosquitos16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
Os mosquitos são insetos relativamente pequenos e delicados com antenas bastante finas. Embora a realização de EAGs em insetos maiores, como mariposas ou abelhas, seja relativamente fácil por causa de seu tamanho maior e antenas mais espessas, conduzir EAGs em mosquitos pode ser um desafio. Em particular, manter uma boa relação sinal-ruído e uma preparação responsiva duradoura são dois requisitos principais para a reprodutibilidade e confiabilidade dos dados.
O guia passo-a-passo para EAGs de baixo ruído proposto aqui oferece diretamente soluções para essas limitações e torna este protocolo aplicável a várias espécies de mosquitos de vários gêneros, incluindo Aedes, Anopheles, Culex e Toxorhynchites, e descreve a técnica para fêmeas e machos. A eletroantennografia oferece uma maneira rápida e confiável de selecionar e determinar compostos bioativos que podem ser aproveitados no desenvolvimento de iscas após a valência ter sido determinada com ensaios comportamentais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os comportamentos mediados pelo olfato são afetados por muitos fatores, incluindo fisiológicos (por exemplo, idade, hora do dia) e ambientais (por exemplo, temperatura, umidade relativa)30. Assim, ao realizar EAGs, é essencial utilizar insetos que estejam no mesmo estado fisiológico (i.e., monitoramento da idade, fome, acasalamento)31 e também manter um ambiente quente e úmido ao redor da preparação para evitar a dessecação. Uma temperatura em torno de 25 °C é i…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sou grato ao Dr. Clément Vinauger e ao Dr. Jeffrey Riffell pelas discussões úteis. Os seguintes reagentes foram obtidos através da BEI Resources, NIAID, NIH: Anopheles stephensi, Strain STE2, MRA-128, contribuição de Mark Q. Benedict; Aedes aegypti, Strain ROCK, MRA-734, contribuição de David W. Severson; Culex quinquefasciatus, Cepa JHB, Ovos, NR-43025. O autor agradece ao Dr. Jake Tu, Dr. Nisha Duggal, Dr. James Weger e Jeffrey Marano pelo fornecimento de ovos de mosquito Culex quinquefasciatus e Anopheles stephensi (cepa: Liston). Aedes albopictus e Toxorhynchites rutilus septentrionalis são derivados de mosquitos de campo coletados pelo autor na área de New River Valley (VA, EUA). Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Bioquímica e pelo Fralin Life Science Institute.
Materials
| Air table Clean Bench | TMC | https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess | Noise reducer |
| Analog-to-digital board | National Instruments | BNC-2090A | |
| Benchtop Flowbuddy Complete | Genesee Scientific | 59-122BC | To anesthesize mosquitoes |
| Borosillicate glass capillary | Sutter Instrument | B100-78-10 | To make the recording and references capillaries |
| Chemicals | Sigma Aldrich | Benzaldehyde: 418099-100 mL; Butyric acid: B103500-100mL; 1-Hexanol: 471402-100mL; Mineral oil: M8410-1L | Chemicals used for the experiments presented here |
| CO2 | Airgas or Praxair | N/A | To anesthesize mosquitoes |
| Cold Light Source | Volpi | NCL-150 | |
| Disposable syringes | BD | 1 mL (309628) / 3 mL (309657) | |
| Electrode cables | World Precision Instruments | 5371 | |
| Electrode gel salt free | Parkerlabs | 12-08-Spectra-360 | |
| Faraday cage | TMC | https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages | Noise reducer |
| Flowmeters | Bel-art | 65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075) | One of each |
| GCMS vials and caps | Thermo-fisher scientific | 2-SVWKA8-CPK | To prepare odorant dilutions |
| Glass syringes (Fortuna) | Sigma Aldrich | Z314307 | For odor delivery to the EAG prep |
| Humbug | Quest Scientific | http://www.quest-sci.com/ | Noise reducer |
| 2 mm Jack Holder, Narrow, 90 deg., With Wire | A-M Systems | 675748 | Electrode holder |
| Magnetic bases | Kanetec | MB-FX | x 2 |
| MATLAB + Toolboxes | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | For delivering the pulses |
| Medical air | Airgas or Praxair | N/A | For main airline |
| Microscope | Nikkon | SMZ-800N | |
| Micromanipulators Three-Axis Coarse/Fine Compact Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | x 2 |
| Microelectrode amplifier with headstage | A-M Systems | Model 1800 | |
| Mosquito rearing supplies | Bioquip | https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp | |
| Needles | BD | 25G (305127) / 21G (305165) | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | For odor delivery to the EAG prep |
| PTFE Tubing of different diameters | Mc Master Carr | N/A | To connect solenoid valve, flowmeter, airline ect. |
| 30V/5A DC Power Supply | Dr. Meter | PS-305DM | |
| R version 3.5.1 | R project | https://www.r-project.org/ | For data analyses |
| Relay for solenoid valve | N/A | Custom made | |
| Silver wire 0.01” | A-M Systems | 782500 | |
| Solenoid valve (3-way) | The Lee Company | LHDA0533115H | |
| WinEDR software | Strathclyde Electrophysiology Software | WinEDR V3.9.1 | For EAG recording |
| Whatman paper | Cole Parmer | UX-06648-03 | To load chemical in glass syringe / Pasteur pipette |
Referências
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