Un guide étape par étape de l’électroanténnographie des moustiques
Summary
Le présent article détaille un protocole étape par étape pour des électroantennogrammes réussis et à faible bruit dans plusieurs genres de moustiques, y compris les femelles et les mâles.
Abstract
Les moustiques femelles sont les animaux les plus meurtriers sur terre, coûtant la vie à plus de 1 million de personnes chaque année en raison des agents pathogènes qu’ils transmettent lors de l’acquisition d’un repas de sang. Pour localiser un hôte dont se nourrir, les moustiques s’appuient sur un large éventail d’indices sensoriels, notamment visuels, mécaniques, thermiques et olfactifs. L’étude détaille une technique, l’électroantennenographie (EAG), qui permet aux chercheurs d’évaluer si les moustiques peuvent détecter des produits chimiques individuels et des mélanges de produits chimiques d’une manière dépendante de la concentration. Lorsqu’elle est associée à la chromatographie en phase gazeuse (GC-EAG), cette technique permet d’exposer les antennes à un mélange complet d’espace de tête / complexe et détermine quels produits chimiques présents dans l’échantillon d’intérêt le moustique peut détecter. Cela s’applique aux odeurs corporelles de l’hôte ainsi qu’aux bouquets floraux végétaux ou à d’autres odeurs pertinentes sur le plan écologique (p. ex. odeurs des sites de ponte). Ici, nous avons décrit un protocole qui permet de longues durées de temps de réactivité de préparation et qui est applicable aux moustiques femelles et mâles de plusieurs genres, y compris les moustiques Aedes, Culex, Anopheles et Toxorhynchites . Comme l’olfaction joue un rôle majeur dans les interactions moustique-hôte et la biologie des moustiques en général, les EAG et les GC-EAG peuvent révéler des composés d’intérêt pour le développement de nouvelles stratégies de lutte contre les vecteurs de maladies (par exemple, les appâts). Complété par des tests comportementaux, la valence (par exemple, attractif, répulsif) de chaque produit chimique peut être déterminée.
Introduction
Les moustiques sont les organismes les plus meurtriers sur terre, tuant plus d’un million de personnes par an et exposant plus de la moitié de la population mondiale au risque d’exposition aux agents pathogènes qu’ils transmettent, tout en piquant1. Ces insectes dépendent d’un large éventail d’indices (c.-à-d. thermiques, visuels, mécaniques, olfactifs, auditifs) pour localiser un hôte dont se nourrir (tant végétal qu’animal), pour l’accouplement et la ponte, ainsi que pour éviter les prédateurs aux stades larvaire et adulte 2,3. Parmi ces sens, l’olfaction joue un rôle essentiel dans les comportements mentionnés ci-dessus, en particulier pour la détection à moyenne et longue portée des molécules odorantes 2,3. Les odeurs émises par un hôte ou un site de ponte sont détectées par divers récepteurs olfactifs spécifiques (p. ex. GR, OR, IR) situés sur les palpes des moustiques proboscis, les tarses et les antennes 2,3.
L’olfaction étant un élément clé de leurs comportements de recherche d’hôtes (végétaux et animaux), d’accouplement et de ponte, elle constitue donc une cible idéale à étudier pour développer de nouveaux outils de lutte contre les moustiques4. La recherche sur les répulsifs (p. ex. DEET, IR3535, picaridine) et les appâts (p. ex. leurre humain sentinelle BG) est extrêmement prolifique5, mais en raison des défis actuels dans la lutte contre les moustiques (p. ex. résistance aux insecticides, espèces envahissantes), il est essentiel de mettre au point de nouvelles méthodes de lutte efficaces fondées sur la biologie des moustiques.
De nombreuses techniques (p. ex., olfactomètre, essais d’atterrissage, électrophysiologie) ont été utilisées pour évaluer la bioactivité de composés ou de mélanges de composés chez les moustiques. Parmi eux, l’électroantennographie (ou électroantennogrammes (EAG)) peut être utilisée pour déterminer si les odorants sont détectés par les antennes des moustiques. Cette technique a été initialement développée par Schneider6 et a été utilisée dans de nombreux genres d’insectes depuis lors, y compris les mites 7,8,9, les bourdons 10,11, les abeilles mellifères 12,13 et les mouches des fruits 14,15 pour n’en nommer que quelques-uns. L’électroantennenographie a également été utilisée en utilisant divers protocoles, y compris des antennes simples ou multiples chez les moustiques 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
Les moustiques sont des insectes relativement petits et délicats avec des antennes plutôt minces. Bien qu’il soit relativement facile d’effectuer des EAG sur des insectes plus gros tels que les mites ou les bourdons en raison de leur plus grande taille et de leurs antennes plus épaisses, la réalisation d’EAG chez les moustiques peut être difficile. En particulier, le maintien d’un bon rapport signal sur bruit et une préparation réactive durable sont deux exigences majeures pour la reproductibilité et la fiabilité des données.
Le guide étape par étape des EAG à faible bruit proposé ici offre directement des solutions à ces limitations et rend ce protocole applicable à plusieurs espèces de moustiques de différents genres, y compris Aedes, Anopheles, Culex et Toxorhynchites, et décrit la technique pour les femelles et les mâles. L’électroantennenographie offre un moyen rapide mais fiable de dépister et de déterminer les composés bioactifs qui peuvent ensuite être exploités dans le développement d’appâts après que la valence a été déterminée avec des tests comportementaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les comportements à médiation olfactive sont influencés par de nombreux facteurs, notamment physiologiques (par exemple, l’âge, l’heure de la journée) et environnementaux (par exemple, la température, l’humidité relative)30. Ainsi, lors de la réalisation d’EAG, il est essentiel d’utiliser des insectes qui sont dans le même état physiologique (c.-à-d. surveillance de l’âge, famine, accouplement)31 et de maintenir un environnement chaud et humide autou…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Je remercie le Dr Clément Vinauger et le Dr Jeffrey Riffell pour leurs discussions utiles. Les réactifs suivants ont été obtenus par l’intermédiaire de BEI Resources, NIAID, NIH : Anopheles stephensi, souche STE2, MRA-128, contribution de Mark Q. Benedict; Aedes aegypti, Strain ROCK, MRA-734, contribution de David W. Severson; Culex quinquefasciatus, souche JHB, Oeufs, NR-43025. L’auteur remercie le Dr Jake Tu, la Dre Nisha Duggal, le Dr James Weger et Jeffrey Marano d’avoir fourni des œufs de moustiques Culex quinquefasciatus et Anopheles stephensi (souche : Liston). Aedes albopictus et Toxorhynchites rutilus septentrionalis sont dérivés de moustiques de terrain collectés par l’auteur dans la région de New River Valley (VA, États-Unis). Ce travail a été soutenu par le Département de biochimie et l’Institut des sciences de la vie Fralin.
Materials
| Air table Clean Bench | TMC | https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess | Noise reducer |
| Analog-to-digital board | National Instruments | BNC-2090A | |
| Benchtop Flowbuddy Complete | Genesee Scientific | 59-122BC | To anesthesize mosquitoes |
| Borosillicate glass capillary | Sutter Instrument | B100-78-10 | To make the recording and references capillaries |
| Chemicals | Sigma Aldrich | Benzaldehyde: 418099-100 mL; Butyric acid: B103500-100mL; 1-Hexanol: 471402-100mL; Mineral oil: M8410-1L | Chemicals used for the experiments presented here |
| CO2 | Airgas or Praxair | N/A | To anesthesize mosquitoes |
| Cold Light Source | Volpi | NCL-150 | |
| Disposable syringes | BD | 1 mL (309628) / 3 mL (309657) | |
| Electrode cables | World Precision Instruments | 5371 | |
| Electrode gel salt free | Parkerlabs | 12-08-Spectra-360 | |
| Faraday cage | TMC | https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages | Noise reducer |
| Flowmeters | Bel-art | 65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075) | One of each |
| GCMS vials and caps | Thermo-fisher scientific | 2-SVWKA8-CPK | To prepare odorant dilutions |
| Glass syringes (Fortuna) | Sigma Aldrich | Z314307 | For odor delivery to the EAG prep |
| Humbug | Quest Scientific | http://www.quest-sci.com/ | Noise reducer |
| 2 mm Jack Holder, Narrow, 90 deg., With Wire | A-M Systems | 675748 | Electrode holder |
| Magnetic bases | Kanetec | MB-FX | x 2 |
| MATLAB + Toolboxes | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | For delivering the pulses |
| Medical air | Airgas or Praxair | N/A | For main airline |
| Microscope | Nikkon | SMZ-800N | |
| Micromanipulators Three-Axis Coarse/Fine Compact Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | x 2 |
| Microelectrode amplifier with headstage | A-M Systems | Model 1800 | |
| Mosquito rearing supplies | Bioquip | https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp | |
| Needles | BD | 25G (305127) / 21G (305165) | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | For odor delivery to the EAG prep |
| PTFE Tubing of different diameters | Mc Master Carr | N/A | To connect solenoid valve, flowmeter, airline ect. |
| 30V/5A DC Power Supply | Dr. Meter | PS-305DM | |
| R version 3.5.1 | R project | https://www.r-project.org/ | For data analyses |
| Relay for solenoid valve | N/A | Custom made | |
| Silver wire 0.01” | A-M Systems | 782500 | |
| Solenoid valve (3-way) | The Lee Company | LHDA0533115H | |
| WinEDR software | Strathclyde Electrophysiology Software | WinEDR V3.9.1 | For EAG recording |
| Whatman paper | Cole Parmer | UX-06648-03 | To load chemical in glass syringe / Pasteur pipette |
Referências
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