ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Bu protokol, multipl sklerozun bir hayvan modelinde pozitron emisyon tomografisi (PET) görüntüleme ile in vivo miyelin değişikliklerini (demiyelinasyon ve remiyelinasyon) izlemeyi amaçlamaktadır.
Abstract
Multipl skleroz (MS), merkezi sinir sisteminde genişleyen aksonal ve nöronal dejenerasyon ve demyelinasyon ile MS ilerlemesi sırasında motor işlev bozukluklarına, psişik engellilik ve bilişsel bozulmaya yol açan nöroinflamatuar bir hastalıktır. Pozitron emisyon tomografisi (PET), in vivo hücresel ve moleküler değişiklikleri ölçebilen bir görüntüleme tekniğidir.
Miyelin sağlamlığına yakınlığa sahip radyotracers, zaman içinde miyelin içerik değişikliklerinin in vivo görüntülenmesi için kullanılabilir. Miyelin içeriğinde bir artış veya azalma tespit etmek mümkündür, bu görüntüleme tekniğinin merkezi sinir sisteminin demiyelinasyon ve remiyelinasyon süreçlerini tespit edebileceği anlamına gelir. Bu protokolde, fokal demiyelinasyon lezyonunun (stereotaktik enjeksiyonla indüklenen) (yani multipl skleroz hastalığının bir modeli) bir modeli olan lesolesitilin sıçan modelinde miyelin değişikliklerini tespit etmek için PET görüntülemenin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. 11 C-PIB PET görüntüleme taban çizgisine ve sıçan beyninin sağ striatumunda (4 μL) ve korpus callosumunda (3 μL) %1 oranında stereotaksik enjeksiyondan 1 hafta ve 4 hafta sonra yapıldı ve fokal demiyelinasyon (1 hafta sonra enjeksiyon bölgesi) ve remiyelinasyon sürecinin (4 haftada enjeksiyon bölgesi) ölçülmesini sağladı.
Myelin PET görüntüleme, miyelin içeriğindeki in vivo değişiklikleri izlemek için ilginç bir araçtır ve bu da demiyelinasyon hastalığının ilerlemesini ve terapötik yanıtı izlemek için yararlı olabilir.
Introduction
Multipl skleroz (MS), merkezi sinir sistemini etkileyen, iltihaplanma, demyelinasyon ve aksonal kayıp1ile karakterize nöroinflamatuar bir hastalıktır. Bu hastalığın prognozu, tedavideki gelişmelerle bile değişkendir ve gençlerde nörolojik açıkların en yaygın nedenlerinden biridir1. MS tanısı manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ile karakteristik lezyonların klinik bulguları ve görselleştirilmesi kriterlerine dayanmaktadır2,3.
Pozitron emisyon tomografisi (PET), MS ilerlemesinin ve terapötik etkilerin in vivo izlenmesi için yararlı bir araç olabilir. Karbon-11 (11C-PIB) ile etiketlenmiş Pittsburgh bileşik B radyotracer (PIB), β-amiloid plaklarını ölçmek için yaygın olarak kullanılır; ancak, son on yılda, miyelin içeriğini ölçmek ve dinamik demiyelinasyon ve remiyelinasyon göstermek için çalışılmıştır4,5,6.
Farklı amiloid PET izleyiciler (11C-PIB, 18F-florbetaben,18F-florbetapir, 18F-flütemetamol) miyelin ölçmek ve hastalık ilerlemesi ve terapötik yanıt hakkında önemli bilgiler sağlamak için kullanılabilir, demiyelinasyon ve remiyelinasyon süreçlerinin tanımlanmasına izin verir, nöroinflamasyonun müdahalesi olmadan, geleneksel manyetik rezonans görüntüleri (MRG)7ile ortaya çıkabilir. Amiloid PET görüntüleme, aktif hastalarda erken beyaz madde hasarı ile açıklanabilen aktif olmayan hastalara kıyasla aktif MS hastalarında izleyici alımında azalma olduğunu göstermiştir8. Alt amiloid izleyici alımı, bir takip çalışmasında bilişsel düşüşle de ilişkilendirildi ve bu tekniğin hastalığın patofizyolojisini ve klinik sonuçlarını incelemek için değerli bir araç olduğunu gösterdi9.
Lysolecithin (LPC) sıçan modeli, enjekte edilen toksin LPC'nin, iltihaplanmanın artmasına ve sonuç olarak demyelinasyon10,11ile sonuçlanan makrofajların yüksek bir tepkisine neden olduğu multipl sklerozun kimyasal kaynaklı bir modelidir. Demyelinasyon, yaklaşık 4 hafta içinde hızla tersine çevrilir, bu da bunu kemirgenlerdeki demyelinasyon ve remyelinasyon süreçlerini değerlendirmek için iyi bir model haline getirir. Bu model zaten PET görüntüleme kullanılarak değerlendirildi, iyi sonuçlar ve ölüm sonrası denemelerle korelasyon12.
Burada, lesolesithin sıçan modelinde 11C-PIB ile miyelin PET görüntüleme protokolünü sunuyoruz ve bu görüntüleme tekniğinin miyelin içeriğinin in vivo ölçümü için yararlı bir araç olduğunu gösteriyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler, Ulusal Hayvan Deneyleri Konseyi'nin (CONCEA, Brezilya) yönergelerine uygun olarak yürütüldü ve Sao Paulo Üniversitesi Tıp Fakültesi Hayvan Araştırmaları Etik Komitesi tarafından onaylandı (CEUA-FMUSP, Brezilya - protokol numarası: 25/15).
NOT: Bu protokolde, multipl sklerozun lysolecithin sıçan modelinin nasıl indüklendiğini ve miyelin PET görüntülerinin nasıl elde edilir ve analiz edilir.
1. Lysolecithin çözelti hazırlığı
- Konik plastik bir tüp (1,5 mL) kullanarak analitik ölçekte lizolsitin (L-α-Yumurta sarısından L-α-Lizosfatidylcholine) tartın.
- % 1 çözelti yapmak için tüpe steril salin ekleyin (örneğin: 1 mg lysolecithin tartın ve 100 μL salin ile çözün) ve tüpü sallayarak (bir yandan diğer yana sallayarak ve yukarıdan aşağıya dönmeyerek) lysolecithin'i çözün.
- Hayvan modeli indüksiyonunu başlatmadan hemen önce çözeltiyi hazırlayın (nihai hazır çözeltiyi stoklayın).
2. Lysolecithin sıçan modeli - Stereotaksik cerrahi
- 220 - 270 g ağırlığında erkek Wistar sıçanları kullanın. Tüm prosedürler sırasında eldiven ve maske kullanın.
- İndüksiyon kutusu kullanarak %100 O2 'de (1 L/dk) karıştırılan %5 izofluran ile anesteziye neden olur. Hareket yokluğunu gözlemleyerek hayvanın uyuşturulup uyuşturulmamış olup olmadığını kontrol edin (sadece solunum gözlenmelidir).
- Hayvanı bir ısıtma yastığına stereotaksik aparatlara yerleştirin. Hayvanın burnunu ve kulaklarını ekipmana sabitle.
NOT: Stereotaksik cerrahinin nasıl yapılacağının ayrıntıları JoVE Science Education Database'de bulunabilir. Sinirbilim. Kemirgen Stereotaksik Cerrahisi. JoVE, Cambridge, MA, 2021.- Anesteziyi tüm prosedür için izleyin (ameliyat ve görüntü alımı dahil). İzofluran konsantrasyonu ayarlamak için hayvan solunum hızını gözlemleyin. Hızlı nefes alma hızı daha yüksek konsantrasyon gerektirir ve yavaş nefes alma hızı daha düşük anestezik konsantrasyon gerektirir.
- Analjezik (ketoprofen - 5 mg / kg) deri altından enjekte edin (ilacı salin içinde 1 mL'ye seyreltin, bu hayvanı nemlendirmeye yardımcı olacaktır).
- Dehidrasyondan korunmak için hayvanın gözlerine göz kremi koyun.
- Kesi alanını temizlemek için% 0,5 klorheksidin çözeltisi kullanın.
- Kesi bölgesinde 100 μL lidokrin hidroklorür% 2 deri altından enjekte edin.
- Kafatası bölgesini tıraş et.
- Bu işlem için steril aletler kullanın.
- Neşter kullanarak, kafatası üzerinde deride yaklaşık 2 cm'lik bir kesi yapın.
- Kafatasını Bulldog kıskaçlarıyla ortaya çıkar.
- Kafatası bölgesini% 1 hidrojen peroksidaz ile temizlemek için bir çubuk kullanın.
- Bregma'yı bulun ve işaretleyin (stereotaksik sıçan beyin atlası Bregma'nın kimliğinin tespit edilmesine yardımcı olabilir).
- Hamilton şırıngını (μL nöros şırıng) bregma'ya yerleştirin.
- Bregma ve stereotaksik atlası referans olarak kullanarak Hamilton şırıngını aşağıdaki koordinatlara yerleştirin: Antero-posterior: -0.30 mm, latero-lateral: -3.0 mm ve kafatası kemiğine dokunana kadar ventral, kafatasını işaretleyin ve koordinatların yönünü kağıda not edin.
- Kafatasını işaretli koordinatta del. Dura mater'e dikkat et (dura mater'e zarar vermek çok fazla kanamaya neden olabilir).
- Hamilton şırındını 7 μL lysolecithin çözeltisi (%1 salin) ile doldurun. Şırıng içine daha büyük bir hacim yerleştirilecektir, ancak sadece 7 μL enjekte edilecektir (hacmi doğru ölçmek için kabarcıkları şırınnadan alın).
- Hamilton şırıngını ilaç enjeksiyonunu başlatmak için önceki koordinatlara yerleştirin (3 farklı ventral stereotaktik koordinata toplam 7 μL). Daha önce belirtilen koordinatları göz önünde bulundurarak, Hamilton şırındıcını ventral koordinat -5.0 mm'ye düşürün.
- Çok yavaşça 2 μL lysolecithin çözeltisi (1 μL / 10 dk) enjekte edin. 3 dakika bekleyin.
- İğneyi bir sonraki ventral stereotaksik koordinata (-4,2 mm) alın ve yavaşça 2μL lysolecithin çözeltisi (1 μL / 10 dk) enjekte edin. 3 dakika bekleyin.
- Üçüncü ventral koordinatı -3,0 mm (3 μL lysolecithin çözeltisi - 1 μL / 10 dk) enjekte edin.
- 5 dakika bekleyin ve hamilton şırındıcını beyinden çıkarın.
- Cildi dikin.
- Hayvanı stereotaktik aparattan çıkarın ve hayvanın uyanmasına izin verin.
- Hayvanı ev kafesine geri koyun, rahatsızlık belirtilerini kontrol etmek için hayvanı yalnız ve gözetim altında tutun.
- Ameliyattan sonra 24 saat ve 48 saat salin seyreltilmiş deri altı analjezik (ketoprofen - 5 mg / kg) enjekte edin.
3. PET satın alma
- Bir şırında 7 ila 20 MBq 11C-PIB radyoaktivite alın (1 mL sıçanlarda intravenöz enjeksiyon için izin verilen maksimum hacimdir).
- İndüksiyon kutusunu kullanarak% 100 O 2 'de (1 L / dk) karıştırılan%5 izofluran ile hayvanı uyuşturun.
- Penis damarına veya sıçanın kuyruk damarına 11C-PIB (yukarıdaki madde 4.1'de tanımlanan radyoaktivite) enjekte edin (her iki yönetim bölgesi de iyidir, karar kişisel bir seçimdir). Sadece retro-orbital enjeksiyon kullanmamanızı tavsiye ediyoruz, çünkü konum ilgi alanına (beyin) çok yakın ve görüntü kalitesini bozabilir.
NOT: Stereotaksik enjeksiyondan önce taban çizgisi zaman noktasının görüntü alımı, diğer 2 zaman noktası ise ameliyattan 1 hafta 4 hafta sonra gerçekleştirilir. - Hayvanın uyanmasını sağlamak için hayvanı anesteziden çıkarın (hayvanı tamamen uyanana kadar ılık bir ped üzerinde bırakın).
- Hayvanı ev kafesine geri verin.
- Bir sonraki adım için 30 dakika bekleyin.
- Bir indüksiyon kutusu kullanarak% 100 O 2 'de (1 L / dk) karıştırılan%5 izofluran ile sıçanları uyuşturun.
- PET tarayıcı yazılımını açın.
- Tarama > Evcil Hayvan Hazır 'ıseçin.
- Tam baş araştırmacı ayrıntıları, Çalışma Kimliği, Seri Kimliği, Hayvan Kimliği, Hayvan ağırlığı (g) ve Ek notlar. İleri 'yiseçin.
NOT: Hayvan ağırlığındaki ondalık sayı için nokta (.) kullanın. - Yatırım getirisi alanını tarama için düzenleyin (genellikle 3 ile 8 arasında). Bu, görüntüye dahil edilecek alandır (yatak örtüsünün 3 ve 8 numaraları arasındaki alanlar son görüntüde görünecektir).
- Anestezi yapılan sıçanı PET tarayıcısının standart bir sıçan yatağına yerleştirin ve anesteziyi açın (%100 O2'de % 3 izofluran iyi bir başlangıçtır ve daha sonra anestezi oranı gerektiği gibi ayarlanmalıdır). Anesteziyi ayarlamak için, hayvanın sabit ve yavaş bir ritimde nefes aldığını doğrulamak için tarayıcı yazılımının izleme verilerini kontrol edin.
NOT: Isoflurane gazı fazlalığını toplamak için (pompa varsa) aktif karbon filtresine bağlı vakum pompasını açın. - Hayvanın gözlerini korumak için göz kremi uygulayın.
- Hayvan yatağını PET tarayıcının içine itin.
- Tam Etkinlik ayrıntıları, Etkinlik Kalibrasyon Süresi, İzotop (C-11) ve Tarama süresi (20 dakika). Taramayı Başlat 'ıseçin.
NOT: Evcil Hayvan Hareketli Yatak mesajı görünecek ve hayvan yatağı ekipmana taşınacak ve daha önce seçilen yatırım getirisi konumunda duracaktır. Edinme zamanı geri sayıma başlar ve saniye başına sayım sayısı (CPS) görünür. - Tarayıcı yazılımında, ekranın solundaki Monitör sekmesine gidin, Eşiği Solunum parametreleri değişikliğine (BPM) değiştir'i kontrol edin.
NOT: Eşik parametresi (500) ile tamamlanan bir pencere açılır. Tamam 'ıseçin. - Tarama sırasında hayvanı ısıtmak için sıcaklık parametrelerini değiştirmek için % 0 GÜÇ'e gidin. Bir pencere açılır; parametreyi tamamlayın (80 - 100). Tamam 'ıseçin.
NOT: Oda sıcaklığı koşullarına göre %80 ila %100 güç seçin (ne kadar fazla güç, o kadar ısınır). - SCAN sekmesine geri dönün.
- Yapılandırma aracına (dişli simgesi) gidin ve Enjeksiyon Süresi, Kalan Etkinlik, Kalan Etkinlik Kalibrasyon Süresi 'nitamamlayın. Kaydet 'iseçin.
NOT: "Protokol meta verilerini değiştirmek istediğinizden emin misiniz?" > EVET - Monitör sekmesine geri dönün (hayvanın solunum parametrelerini kontrol edin ve gerekirse izofluran konsantrasyonu artırın veya azaltın - genellikle% 100 O2'de% 3 yeterlidir).
- PET alımı tamamlandığında, Pet Ready mesajı Tarama sekmesinde görünecektir, hayvan yatağını taşımak için Ok Dışarı Simgesi'ni (yapılandırma aracının solunda) işaretleyin.
- Hayvanı anesteziden çıkarın ve ılık bir ped üzerinde uyanmaya bırakın.
- Görüntüyü yeniden oluşturmak için Yeniden Yapılandır sekmesine gidin.
- Ekranın sol alt kısmındaki artı simgesini kontrol edin ve yeniden inşa edilecek çalışma dosyasını seçin. İleri 'yiseçin.
- Enerji Çözünürlüğü aracına gidin. Bir pencere açılacak. Enerji zirvesini (keV) ekipman parametresine göre yapılandırın (aylık kalite kontrolüne göre). Kapat 'ıseçin.
NOT: Aylık ekipman kalibrasyonu yapılırken enerji zirvesi her ay değişebilir. - Diğer tüm parametreleri varsayılan olarak saklayın (İzometrik voksel boyutu: 400 mm; yineleme sayısı: 30; Enerji çözünürlüğü: %30; Yalnızca son yinelemeyi kaydet; ikili verileri koru) seçeneğinin işaretini kaldırın.
- Ekle 'yi denetleyin.
NOT: "Yeniden yapılandırma kuyruğa eklendi ve diğerleri bittikten sonra başlayacak" penceresi açılır. Tamam 'ıseçin. Yeniden yapılandırma sekmesindeki yeniden yapılandırma listesinde bir dosya görüntülenir ve durum bekleme veya % (ilerleme) veya tamamlandı olarak görünür.
4. Görüntü Analizi
NOT: Özel görüntü analizi yazılımı kullanarak görüntü analizi yapın. Geçerli protokolde gösterim belirli bir yazılım programı kullanır, ancak kullanılamıyorsa, başka seçenekler de kullanılabilir.
- PMOD > Fuse it 'iaçın.
- Ekranın üst kısmındaki Eşleşen sekmesine gidin.
- Ekranın sağ ortasındaKi Yükleme Girişi menüsünü açın ve Dosyaları Otomatik Algıla'yı seçin, PET dosyasını (DICOM, Interfile veya NifTI) seçin, seçilene ekleyin, İşlemlerle tıklatın, Standart Yönlendirmeye Yeniden Yönlendir,Yükle ve Kapat'ı tıklatın.
- Hayvan Türlerinin ekranın(RAT)altında doğru olup olmadığını doğrulayın.
- Ekranın sağ alt kısmındaki Kırp kutusunu işaretleyin.
- Tüm beyni almak için PET görüntüsündeki sarı kutu boyutunu ayarlayın.
- Ekranın sağındaki Sert düğmeye tıklayın. Onay penceresinde Evet'i tıklatın.
- Referans Atlası'nı açmak için ekranın sağ ortasındaki beyin aracına tıklayın. Px Rat (W.Schiffer) - T2'yi seçin.
- Sağ üst sekmeden Sonuçları Eşleştir'i seçin (İşlem aşaması sekmesini seçin).
- Veri yeniden dilimleme 'ye tıklayın (sağ üst menüdeki4.sekme).
- Döndürme aracını (PET görüntüsünün ortasındaki beyaz simge) kullanarak PET görüntüsünü referans şablonuyla hizalayın. 3 anatomik düzlem için hizalamayı kontrol edin.
- Ortak kayıt dosyasını kaydedin (ekranın sağ yan menüsü).
- Çıktı biçimi (DICOMor NifTI), dizin ve dosya önekini seçin. Kaydet 'itıklatın.
NOT: Birlikte kaydedilen çıktı NifTi olarak kaydedilirse, üstbilgi görüntüsü bilgileri kaybolur. - Ekranın altındaki VOIs menüsünü tıklatın.
- Ekranın altındaki Şablon > Atlas'a gidin (VOI penceresinin altında).
- Açılan menüden Px Rat(W.Schiffer) öğesini seçin.
NOT: Yalnızca belirli VOI'leri analiz etmeniz gerekiyorsa, yalnızca ilgi çekici beyin alanlarını seçebilirsiniz. Beyin atlasının tüm beyin bölgelerini istiyorsanız, harekete gerek yoktur. - Ekranın altındaki Anahat'ı tıklatın.
NOT: Beyin bölgelerinin VOI'leri VOI penceresinde görünecektir. - VOI'yi lezyon bölgesinde ve kontralateyal beyin yarımküre bölgesinde (sırasıyla11C-PIB düşük alım alanı ve kontralateteral beyin yarımküresi) manuel olarak çizin.
- 11C-PIB düşük alım ile PET görüntü alanına tıklayın.
- Yeni VOI > Tamam 'ıseçin.
NOT: Bir elektronik tablo görünecektir - Ekranın orta kısmındaki SPHERE simgesine gidin (VOI penceresinin solunda)
NOT: Bir elektronik tablo görünecektir. - VOI adını seçin: lezyon ve Uygula 'yıseçin.
NOT: Ortak kayıtlı görüntüde bir küre görünecektir. - Lezyon bölgesindeki küreyi hizalayın ve VOI'yi tüm anatomik düzlemler için ayarlayın.
- Kapat'ı tıklatın (elektronik tablonun alt kısmında).
- Lezyon VOI'yi seçin (VOI listesinden).
- VOI yansıtma işlemleri simgesine gidin (VOI penceresinin sağ üst kısmında) ve Klonla'yı seçin ve sola/sağa yansıtın.
- VOI listesi penceresinin en üstünde seçili VOI İstatistiklerini Hesapla'ya gidin. Çıktı verilerini seçmek için Hesaplanacak istatistikleri seç simgesine gidin (VOI istatistikleri simgesinin sağ tarafında). Genellikle miyelin içeriği için VOI grubu istatistiklerini kontrol edin, Ortalama, SD, Min, Max).
NOT: Bir elektronik tablo görünecektir. Veri Birimi varsayılan ayarı kBq/cc'dir. Elektronik tablonun (VOI İstatistikleri) sol üst kısmında Veri Birimini SUV (Standartlaştırılmış Alım Değeri) olarak kontrol edebilirsiniz. Tarayıcı yazılımında radyotracer yönetimini ve görüntü alma ayrıntılarını doğru bir şekilde tamamladıysanız, daha önce açıklandığı gibi, SUV verileri PMOD yazılımı tarafından otomatik olarak hesaplanır, değilse, ayrıntıları düzenleyebilirsiniz. - Sistem yerel konumu numarası biçimini kullanarak kopyala 'yagidin.
NOT: Çıktı olarak kopyalamak için tüm istatistiklerin seçili olup olmadığını doğrulayın (Ekranın sağ üst kısmındaki Kontrol simgesi). Kopyalanacak veriler seçilen Veri Birimi'ne bağlıdır. - Çıktı verilerini not defterine veya elektronik tabloya yapıştırın.
NOT: Sayılar arasındaki nokta ve virgül sembolleri için yazılım ayarlarına dikkat edin. Bu, dil yapılandırmaları arasında farklı olabilir. - Dosyayı çalışma adı ve ayrıntılarıyla kaydedin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1' de zaman içinde miyelin değişiklikleri olan açıklayıcı 11C-PIB PET görüntüsü gösterilmektedir. Taban çizgisi taramasında miyelin içeriğinde herhangi bir fark görülemez (yani demyelinasyon yoktur). 1 haftalık zaman noktası görüntüsünde, beyaz okla belirtildiği gibi fokal demiyelinlenmiş lezyonu (sağ yarımkürede) görmek mümkündür. Görüntüler 3 anatomik düzlemde (koronal, eksenel ve sagittal) sunulur ve hepsinde demiyelinlenmiş lezyonu tanımlamak mümkündür. 1 haftalık görüntü, enjeksiyon yerinde doğru model indüksiyonunu ve görüntü algılamayı temsil eden iyi sınırlandırılmış bir lezyonun illüstrasyonudur. 4 haftalık görüntüde, remiyelinasyonun meydana geldiğini ve miyelin içeriğinin normale döndüğünü (veya ona yakın olduğunu) gösteren hiçbir lezyon artık görünmez.
Temsili grafikler, 3 farklı zaman noktasındaki 4 hayvanın görüntülerinin nicelliğini göstermektedir. İlk grafik, lezyonun nicelleştirilmesinden (manuel VOI) lysolecithin enjeksiyonunun yapıldığı daha fazla odak miyelin değişikliği gösteren kontrallateral yan orana kadar sonuçları göstermektedir. İkinci grafik aynı niceliği gösterir, ancak striatumda (kontraseptif orana enjekte edilen striatum) ve bu durumda fark istatistiksel olarak anlamlı değildir, bu da küçük örnek boyutu ile açıklanabilir ve VOI daha büyük olduğu ve radyoaktivite konsantrasyonu sadece lisolesitinin enjekte edildiği yerde ölçülmez.
Gruplar arasındaki farklar Kruskal Wallis testi ile analiz edildi, ardından Dunn'ın birden fazla karşılaştırma testi yapıldı ve sonuçlar SD ± ortalama olarak sunuldu. VOI lezyonunda (H = 7.063; P=0.017), 1 haftalık görüntüde izleyici alım oranı (0.90±0.07) taban çizgisine göre %16 daha düşüktü (1.07±0.06), istatistiksel anlamlıydı (p=0.024). 4 haftalık görüntüde (1.01±0.06) önemli bir fark bulunmadı.
Striatumda istatistiksel farklılık bulunmadı (H =1.412; P=0.5393). Görüntülerin alım oranları taban çizgisi için 1.07±0.07, 1 hafta için 1.02.07±07 ve 4 hafta boyunca 1.01±0.08 olarak belirlendi.
Üçüncü grafik (alt çizgi, sol grafik) kontralateral striatumun (enjekte edilmemiş taraf) nicelliğini sunar. Bu grafikte, zaman noktaları arasında bir fark (P=9397) olmadığını gözlemlemek mümkündür, yani enjekte edilen taraftaki varyasyon miyelin değişikliklerini ve zaman içinde izleyici alımı varyasyonu nedeniyle değildir.
Sağ alttaki son grafik, modelin iyi indüklenmediği hayvanlarda enjekte edilen bölgenin (lezyon VOI) nicelliğini gösterir (muhtemelen hızlı lisolesitikin enjeksiyonu, yanlış stereotaksik manipülasyon ve / veya yanlış çözelti hazırlığı nedeniyle). Bu durumda, alt alım 1 haftalık zaman noktasında görülmez, yani demyelinasyon işlemi gerçekleşmedi ve 4 haftadaki düşük alım daha sonraki bir demyelinasyon süreci veya doku hasarı ile ilgili olabilir, her iki durum da kötü hayvan modeli indüksiyonu ile ilgilidir. Bu grafik, hayvan indüksiyonu iyi gerçekleştirilmediğinde sonuçların görünümünü örneklendirmek ve protokolün başından sonuna kadar her adımının önemini vurgulamak için protokole eklenmiştir. İzleme çekmesinde (H = 2.745, P = 0.267) 1.06.05±0.05, 1.02±.0.14 ve taban çizgisi, 1 hafta ve 4 haftalık PET görüntüleri için 0.96±0.10 arasında fark yoktur.
Şekil 2, MRI şablonu referansı ve Şekil 2B'ye dayanarak manuel VOI'nin çizildiği Yerde Şekil 2A ayrıntılarının, stereotaksik enjeksiyondan 7 gün sonra enjekte edilen taraftan ve enjekte edilmeyen taraftan luxol hızlı mavi boyamayı (lüks hızlı mavi boyama protokolü hakkında ayrıntılar için bkz. De Paula Faria ve ark.13)gösterdiği sonuçlara daha fazla bilgi ekler.
Şekil 1: Stereotaktik enjeksiyondan 1hafta ve 4 hafta sonra taban çizgisinin görüntülerini gösteren açıklayıcı 11 C-PIB PET görüntüsü. Şeklin altındaki grafikler, izleyici alımının (n=4) farklı zaman noktalarındaki nicelliğini temsil eder. İlk iki grafik, enjekte edilen tarafta lezyonda kontrallateral tarafa ve iyi indüklenmiş bir modelde striatumda (yani, lezyon sunan sıçanlar lysolecithin enjeksiyonundan sonra) alım oranını temsil eder. Üçüncü grafik (sol altta) enjekte edilmemiş striatumun (negatif kontrol) nicemini gösterir ve son grafik (sağ altta), demiyelinlenmiş lezyon (kötü indüklenmiş model) sunmayan hayvanların enjeksiyon yerindeki 11C-PIB alımını temsil eder. Sonuçlar ortalama olarak sunulmaktadır±SD. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Lezyon konum detayları. A)Stereotaktik enjeksiyon sonrası 1 haftada MRI şablonuna (corpus callosum ve striatum bölgesi) göre elle çizilen enjekte edilen tarafın (kesik çizgi) ve enjekte edilmeyen tarafın (beyaz çizgi) açıklayıcı VOI'leri. B) Enjekte edilmeyen tarafa kıyasla enjekte edilen yarımkürede demyelinasyon gösteren Luxol hızlı mavi lekeleme (Üst: 40x büyütme, alt: 100x büyütme). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Multipl skleroz çalışması için lysolecithin modelini kullanmanın en büyük avantajı, demyelinasyon (yaklaşık 1 hafta) ve remyelinasyon (yaklaşık 4 hafta) için hızlı zaman çizelgesi14. Bu model farelerde de indüklenebilir15, ancak, sıçanlarda indüksiyon, fare beyninin farelere kıyasla daha büyük boyutu nedeniyle in vivo PET görüntüleme için daha avantajlıdır.
İndüksiyon modelinin ilk adımı son derece dikkatli olmaktır. Bu model,2014 yılında de Paula Faria ve ark. 10 tarafından miyelin PET görüntüleme için doğrulandı ve beynin içindeki lysolecithin enjeksiyonunun hızının iyi indüklenmiş bir model için çok önemli olduğu gösterildi. Enjeksiyon, doku hasarını önlemenin bir yolu olarak her 10 dakikada bir 1 μL olmak üzere çok yavaş yapılmalıdır. Lysolecithin çözeltisi de stereotaktik enjeksiyonla aynı gün, tercihen ameliyat prosedürüne başlamadan hemen önce hazırlanmalıdır. Model ilk kez bir araştırma grubunda kullanılacaksa, PET görüntüleme ile herhangi bir miyelin nicelemesi yapmadan önce modelin doğrulanmasını öneririz. Doğrulamanın miyelin lekelenmesi ile ölüm sonrası doku analizini içermesi gerekir, örneğin: Şekil 2'degösterildiği gibi Luxol hızlı mavi histolojisi ve miyelin temel proteini (MPB) immünhistokimyası, in vivo analizde kullanılması amaçlanan farklı zaman noktalarında. Sonuçlar bölümünde lezyon indüksiyonunun iyi başarılı olmadığı radyotracer alımının nicelliğini gösterdik ve bu nedenle 11C-PIB PET görüntüleme ile farklılıklar saptanamadı.
Bu teknikle ölçülecek lezyon PET tarayıcı çözünürlüğünden daha büyük olmalıdır (klinik öncesi ekipmanda yaklaşık 1 mm ve klinik ekipmanlarda yaklaşık 5 mm).
Model iyi indüklendikten sonra, 20 dakikalık kısa bir yarı ömrü olan karbon-11 ile etiketlenmiş radyotracer nedeniyle görüntüleme prosedürü iyi planlanmalıdır. Preklinik görüntüleme laboratuvarı personelinin gerekli tüm malzemeleri hazırlaması, anestezi sistemini doldurması, her şeyin düzgün çalışıp çalışmadığını kontrol etmesi ve deney sırasında tamamlanacak formları yazdırması gerekir. PET tarayıcı, tarayıcının iyi çalıştığını kontrol etmek için ekipmanda (her ülkeye bağlı olarak) gerekli tüm kalite kontrolleri gerçekleştirildiğinde, deneyden önce de doğrulanmalıdır. Enjeksiyon için izleyiciyi aldıktan sonra, aktivite ölçümü, doğru enjekte edilen dozu ve formda yazılan bilgilerin (şırıngdaki aktivite, enjeksiyondan önce ve sonra) yanı sıra ölçümün yapıldığı ilgili zamanı garanti etmek için kalibre edilmiş bir doz kalibratöründe de ölçülmelidir. Hangi saatin kullanılacağını belirleyin, çünkü doğru zaman PET tarayıcısının iş istasyonundaki zamandır, görüntülerin çürüme düzeltmesinde dikkate alınacak süredir, bu nedenle deney sırasında kullanılan tüm saatler tarayıcı iş istasyonu saatiyle senkronize edilmelidir.
Hayvan görüntüsü alımı sırasında, sıcaklık ve hayvan solunumları izlenmeli ve anestezi gerektiği gibi ayarlanmalıdır. Sıcaklık konuma bağlıdır ve hayvan refahı için ayarlanmalıdır. Görüntü alımı bittikten sonra, kafese geri dönmeden önce iyileşmek için hayvanı sıcak bir pedde tutmak önemlidir.
Görüntü işleme, PET görüntüleme kullanarak yapılan deneylerden güvenilir sonuçlar elde etmek için çok önemlidir. İdeal olan, analizörün hayvan gruplarının ve/veya tedavisinin farkında olmaması ve PET görüntüleme ve MRI şablonu arasında mükemmel kaydı garanti etmek için kullanılan PET izleyici ile PET görüntülerinde zaten deneyime sahip olmasıdır. Bu protokolde PMOD yazılımını kullandık, ancak bu yazılım mevcut değilse, iyi beyin bölgesi tanımı ve nicelik elde edilmesine dikkat edilmesi gerekmesine rağmen alternatif görüntü niceleme yazılımı kullanılabilir. Lezyon yerinin tanımlanması için, enjekte edilen bölgenin çizilen lezyon VOI'nin içinde olduğundan emin olmak için ekstra özen belirtilmelidir (sıçan beyin anatomisi bilgisi gereklidir).
Myelin PET görüntülemenin diğer MS hayvan modellerinde de yapılabileceğini söylemek önemlidir, öngörülemeyen lezyonları gösterir, grubumuz tarafından Deneysel Otoimmün Ensefalomyelit (EAE) marmoset model5'te gösterildiği gibi. Daha önce de belirtildiği gibi, lezyon nicelemesinde dikkate alınması gereken önemli parametre, çok küçük olan lezyonların tespiti için sınırlama olan PET tarayıcı çözünürlüğüdür. PET görüntüleme, MRI gibi diğer tekniklerle karşılaştırıldığında zayıf çözünürlüklü bir görüntüleme tekniğidir, ancak son derece spesifik bir modalitedir ve bu nedenle, PET görüntülerinin nicelemesi, yukarıdaki protokolde gösterildiği gibi ilgi çekici bölgeyi çizmeye yardımcı olmak için MRI gibi anatomik bir şablon kullanır.
VOI'lerin manuel çizimi operatöre bağlı olmasına rağmen, lezyon hayvanlar arasında değişken olabileceğinden, LPC hayvan modeli için en iyi seçenektir. Nicelik sürecindeki önyargıyı azaltmak için, protokolde açıklandığı gibi, enjekte edilen tarafla aynı bölgede ve aynı boyutta olacak bir ayna VOI'si gerçekleştirmek önemlidir. Doğru beyin bölgesinin dikkate alındığından emin olmak için MRI şablonunda VOI'yi çizirken stereotaksik koordinatların göz önünde bulundurulmasını sağlamak da önemlidir. Miyelin lekesini demiyelinlenmiş alanı tanımlamak için bir kılavuz olarak kullanmak, de Paula Faria12'deaçıklandığı gibi çizimde de yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbiri.
Acknowledgments
β küpü ekipmanı (Molecubes NV, Belçika), São Paulo Araştırma Vakfı, FAPESP - Brezilya (#2018/15167-1) tarafından desteklendi. LES, FAPESP - Brezilya'dan (#2019/15654-2) doktora öğrencisi bursuna sahiptir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analytical Balance | Marte | AUWZZOD | max: 220 g- min: 1 mg |
| Anestesia vaporizer | Nanitech | 15800 | |
| Beta-cube | Molecubes | ||
| Bulldog clamp | Stoelting | 5212043P | |
| clorexidine | Rioquimica | 0.5%/100 mL | |
| Cotton swabs | johnson e johnson | ||
| Dose calibrator | Capintech | ||
| Drill | Kinzo powertools | 352901 | Model Q0M-DC3C |
| Eppendorf tube | Eppendorf | 30125150 | 1.5 mL |
| Eye lubricant | ADVFARMA | 30049099 | vaseline 15 g (pharmaceutical purity) |
| Fine forceps | Stoelting | 52102-38P | |
| Gloves | Descarpack | 212101 | 6.5 size |
| Heating pad | Softhear | ||
| Injection Syringe | Hamilton | 80314 | 10µ, 32ga, model 701 |
| Insuline syringe | BD | 328328 | 1 mL insulin syringes with needle |
| Isoflurane | Cristália | 410525 | 100 mL , concentration 1 mL/1 mL |
| Ketoprofen or other analgesic | Sanofi | 100 mg/2 mL | |
| lidocaine | Hipolabor | 1.1343.0102.001-5 | 2%/20mL |
| L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk | Sigma-aldrich | L-4129 | 25 mg - ≥99%, Type I, powder |
| Needle holder | Stoelting | 5212290P | |
| Oxygen | White Martins | 7782-44-7 | Compressed gas |
| PMOD software | PMOD technologies | Version 4.1 | module fuse it |
| Rat anesthesia mask | KOPF | Model 906 | |
| Saline | Farmace | 0543325/ 14-8 | 0.9% sodium chloride for injection, 10 mL |
| Scapel blades | Stoelting | 52173-10 | |
| Scapel handles | Stoelting | 52171P | |
| Scissor | Stoelting | 52136-50P | |
| Semi-analytical Balance | Quimis | BK-3000 | max:3,100 g; min:0.2 g |
| shaver | Mega profissional | AT200 model | |
| Stereotactic Apparatus | KOPF | Nodel 900 | |
| Universal holder with needle support | KOPF | Model 1772-F1 | Hamilton support for 5 and 10 µL |
References
- Oh, J., Vidal-Jordana, A., Montalban, X.
- Sand, I. K. Classification, diagnosis, and differential diagnosis of multiple sclerosis. Current Opinion in Neurology. 28 (3), 193-205 (2015).
- Thompson, A. J., et al. Diagnosis of multiple sclerosis: 2017 revisions of the McDonald criteria. Lancet Neurology. 17 (2), 162-173 (2018).
- Veronese, M., et al. Quantification of C-11 PIB PET for imaging myelin in the human brain: a test-retest reproducibility study in high-resolution research tomography. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 35 (11), 1771-1782 (2015).
- Carvalho, R. H. F., et al. C-11 PIB PET imaging can detect white and grey matter demyelination in a non-human primate model of progressive multiple sclerosis. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 35, 108-115 (2019).
- Stankoff, B., et al. Imaging central nervous system myelin by positron emission tomography in multiple sclerosis using [methyl-(1)(1)C]-2-(4'-methylaminophenyl)- 6-hydroxybenzothiazole. Annals of Neurology. 69 (4), 673-680 (2011).
- Faria, D. D. Myelin positron emission tomography (PET) imaging in multiple sclerosis. Neural Regeneration Research. 15 (10), 1842-1843 (2020).
- Pietroboni, A. M., et al. Amyloid PET as a marker of normal-appearing white matter early damage in multiple sclerosis: correlation with CSF -amyloid levels and brain volumes. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 46 (2), 280-287 (2019).
- Pytel, V., et al. Amyloid PET findings in multiple sclerosis are associated with cognitive decline at 18 months. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 39, (2020).
- Faria, D. dP., et al. PET imaging of glucose metabolism, neuroinflammation and demyelination in the lysolecithin rat model for multiple sclerosis. Multiple Sclerosis Journal. 20 (11), 1443-1452 (2014).
- Rinaldi, M., et al. Galectin-1 circumvents lysolecithin-induced demyelination through the modulation of microglial polarization/phagocytosis and oligodendroglial differentiation. Neurobiology of Disease. 96, 127-143 (2016).
- Faria, D. dP., et al. PET imaging of focal demyelination and remyelination in a rat model of multiple sclerosis comparison of [C-11]MeDAS, [C-11]CIC and [C-11]PIB. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 41 (5), 995-1003 (2014).
- Faria, D. dP., et al. PET imaging of focal demyelination and remyelination in a rat model of multiple sclerosis: comparison of [11C]MeDAS, [11C]CIC and [11C]PIB. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 41 (5), 995-1003 (2014).
- vander Star, B. J., et al. In Vitro and In Vivo Models of Multiple Sclerosis. CNS & Neurological Disorders-Drug Targets. 11 (5), 570-588 (2012).
- Najm, F. J., et al. Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo. Nature. 522 (7555), 216 (2015).
Tags
Nörobilim Sayı 168 11C-PIB PET görüntüleme miyelin multipl skleroz moleküler görüntüleme lysolecithin sıçan modeli VOI analiziErratum
Formal Correction: Erratum: Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis
Posted by JoVE Editors on 02/16/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. The citation was updated.
The citation was updated from:
de Paula Faria, D., Cristiano Real, C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).
to:
de Paula Faria, D., Real, C.C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).
