Summary
מאמר זה מתאר שיטות לדור, טיפול תרופתי וניתוח של explants נגזרים על ידי המטופל להערכת תגובות לתרופות גידול במערכת מודל חי, רלוונטי למטופל, פרה-קלינית.
Abstract
הבנה של עמידות לתרופות ופיתוח אסטרטגיות חדשניות לחש סרטן עמיד מאוד מסתמכים על זמינותם של מודלים פרה-אקליניים מתאימים שיכולים לחזות במדויק את תגובות המטופלים. אחד החסרונות של מודלים פרה-קליניים קיימים הוא חוסר היכולת לשמר בהקשר את מיקרו-וירוס הגידול האנושי (TME) ולייצג במדויק הטרוגניות תוך-אנושית, ובכך להגביל את התרגום הקליני של נתונים. לעומת זאת, על ידי ייצוג התרבות של שברים חיים של גידולים אנושיים, פלטפורמת explant נגזרת המטופל (PDE) מאפשרת לבחון תגובות סמים בהקשר תלת מימדי (3D) המשקף את התכונות הפתולוגיות והארכיטקטוניות של הגידולים המקוריים מקרוב ככל האפשר. דיווחים קודמים עם PDEs תיעדו את היכולת של הפלטפורמה להבחין בין כימוס רגישים לבין גידולים עמידים chemore, והוכח כי הפרדה זו מנבאת את תגובות המטופל לאותן כימותרפיות. במקביל, PDEs מאפשרים את ההזדמנות לחקור תכונות מולקולריות, גנטיות והיסתולוגיות של גידולים המנבאים תגובות לתרופות, ובכך לזהות סמנים ביולוגיים עבור ריבוד מטופלים, כמו גם גישות התערבותיות חדשניות לחש גידולים עמידים. מאמר זה מדווח על מתודולוגיית PDE בפירוט, מאיסוף דגימות מטופלים ועד לניתוח נקודות קצה. הוא מספק תיאור מפורט של שיטות נגזרות ותרבות, המדגיש תנאים מותאמים לגידולים מסוימים, במידת הצורך. לניתוח נקודות קצה, יש דגש על אימונופלואורסצנטיות מרובת מולטיפלקסים והדמיה רב-ספקטרלית ליצירת פרופיל מרחבי של סמנים ביולוגיים מרכזיים בתוך אזורים גידוליים ושטרומליים כאחד. על ידי שילוב שיטות אלה, ניתן לייצר נתוני תגובה כמותית ואיכותית לתרופות שיכולים להיות קשורים לפרמטרים קליניאופתולוגיים שונים ובכך עשויים לשמש לזיהוי סמן ביולוגי.
Introduction
הפיתוח של סוכני נגד נגדים יעילים ובטוחים דורש מודלים פרה-אקליניים מתאימים שיכולים גם לספק תובנה על מנגנוני פעולה שיכולים להקל על זיהוי של סמנים ביולוגיים חזויים ופרמקודינמיים. בין-1,2,3,4,5 ו- TME6,7,8,9,10,11,12 ידועים כמשפיעים על תגובות תרופות נגד סרטן, ומודלים קיימים רבים של סרטן פרה-אקליני כגון קווי תאים, אורגנוידים ומודלים של עכבר אינם מסוגלים להכיל באופן מלא את אלה חיוניים תכונות. מודל "אידיאלי" הוא מודל שיכול לשחזר את האינטראקציות המרחביות המורכבות של ממאיר עם תאים לא ממאירים בתוך גידולים, כמו גם לשקף את ההבדלים האזוריים בתוך גידולים. מאמר זה מתמקד PDEs כפלטפורמה מתפתחת שיכולה למלא רבים מדרישות אלה13.
הדוגמה הראשונה לשימוש ב- PDEs אנושי, הידוע גם בשם היסטוקולטורות, מתוארכת לסוף שנות השמונים כאשר הופמן ואח 'יצרו פרוסות של גידולים אנושיים שנכרתו טריים ותרבלו אותם במטריצה קולגן14,15. זה היה כרוך בהקמת מערכת תרבית תלת-ממדית ששימרה את ארכיטקטורת הרקמות, והבטיחה שמירה על רכיבים סטרומיים ואינטראקציות תאים בתוך ה- TME. מבלי לפרק את הגידול המקורי, הופמן ואח '16 מבשרים על גישה חדשה של מחקר תרגום, ומאז, קבוצות רבות מיטבו שיטות הסבר שונות במטרה לשמור על שלמות הרקמה ולייצר נתוני תגובה מדויקים לתרופות17,18,19,20,21,22,23,24 למרות כמה הבדלים בין פרוטוקולים ניכרים., באטלר ואח ' explants תרבותית ספוגי ג'לטין כדי לעזור דיפוזיה של חומרים מזינים ותרופות באמצעות הדגימה20,21,25, ואילו מג'ומדר ואח 'יצר מערכת אקולוגית גידול על ידי culturing explants על גבי מטריצה המורכבת של גידול וחלבונים סטרומיים בנוכחות סרום אוטולוגי נגזר מאותו חולה22, 23.
לאחרונה, הקבוצה שלנו הקימה פרוטוקול לפיו explants נוצרים על ידי פיצול של גידולים לתוך 2 - 3 מ"מ3- חתיכות בגודל כי הם ממוקמים לאחר מכן ללא רכיבים נוספים על ממברנות חדירים בממשק אוויר נוזלי של מערכת תרבות24. יחד, מחקרים רבים אלה הוכיחו כי PDEs מאפשרים את התרבות של שלם, שברים חיים של גידולים אנושיים השומרים על הארכיטקטורה המרחבית וההטרוגניות האזורית של הגידולים המקוריים. בניסויים מקוריים, explants או histocultures היו בדרך כלל נתון הומוגניזציה בעקבות טיפול תרופתי, ולאחר מכן בדיקות קיימא שונות הוחלו על דגימות הומוגניות כגון אסאי תגובת התרופה היסטוקולטורה20,21, MTT (3-(6)-2,5-דיפנילטטרזוליום ברומיד) אסי, ההסתה של הלקטט דהידרוגנאז, או אסאי מבוסס רסזורין26,27,28 . ההתקדמות האחרונה בטכניקות ניתוח נקודות קצה, במיוחד פתולוגיה דיגיטלית, הרחיבו כעת את הרפרטואר של בדיקות נקודת קצה ובדיקות שניתן לבצע על explants29,30. כדי ליישם טכנולוגיות חדשות אלה, במקום הומוגניזציה, explants קבועים פורמלין, מוטבע פרפין (FFPE) ולאחר מכן מנותח באמצעות טכניקות חיסוניות, המאפשר פרופיל מרחבי. דוגמאות לגישה זו תועדו עבור סרטן ריאות תאים לא קטנים (NSCLC), סרטן השד, סרטן המעי הגס, ו explants mesothelioma לפיה כתמים אימונוהיסטוכימיים עבור סמן ההתפשטות, Ki67, ואת הסמן אפופטוטי, פולי-ADP פולימראז (cPARP), שימש לניטור שינויים התפשטות התא ומוות תאים24,31,32,33,34.
אימונופלואורסצנטיות מרובת קסים נוחה במיוחד ליצירת פרופיל מרחבי של תגובות סמים ב explants בנקודת קצה35. לדוגמה, ניתן למדוד את ההקצאה מחדש ואת ההתפלגות המרחבית של סוגים ספציפיים של תאים חיסוניים, כגון מקרופאגים או תאי T, בתוך TME על טיפול תרופתי13,36,37,38, ולחקור אם סוכן טיפולי יכול להעדיף את המעבר מ"גידול קר "ל"גידול חם"39 . בשנים האחרונות, קבוצה זו התמקדה בהפקת PDEs מסוגי גידולים שונים (NSCLC, סרטן כליות, סרטן השד, סרטן המעי הגס, מלנומה) ובדיקה של מגוון של חומרים נגד סרטן כולל כימותרפיה, מעכבי מולקולות קטנות, ומעכבי מחסום חיסוני (ICIs). שיטות ניתוח נקודות קצה עברו אופטימיזציה כדי לכלול אימונופלואורסצנטיות מרובת-קסים כדי לאפשר יצירת פרופיל מרחבי של סמנים ביולוגיים לצורך כדאיות, כמו גם סמנים ביולוגיים עבור מרכיבים שונים של TME.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. איסוף רקמות
- לאחר הניתוח, העבר דגימות גידול אנושי שנפלטו טריות לתוך צינור המכיל 25 מ"ל של מדיום תרבות טרי (המדיום הנשר שונה של Dulbecco בתוספת 4.5 גרם / L גלוקוז ו L-גלוטמין + 1% (v / v) סרום עגל עוברי + 1% פניצילין-סטרפטומיצין) ומאוחסן על קרח. לעבד את explant בתוך 2 שעות של ניתוח בברדס סטרילי בכיתה II.
2.הכנת E xplant
- נקה את כל הציוד הכירורגי (להבי שתל / משטח שעווה דנטלי / פינצטה) עם 70% פתרון רוח מתילציה תעשייתית (IMS).
- מלאו צלחת תרבות של 10 ס"מ (ראו את שולחן החומרים)בכ-25 מ"ל של מדיום טרי, ומניחים אותה על מצע קרח.
- בעזרת פינצטה, מעבירים את הדגימה על משטח שעווה דנטלי (ראו טבלת החומרים) ופורסיםאת הרקמה לרסיסים של כ-2-3 מ"מ3 באמצעות שני להבי שתל עור.
הערה: לקבלת הביצועים הטובים ביותר, להתחיל לחתוך את הרקמה כדי לקבל רצועה בודדת של 2-3 מ"מ של עובי, ולאחר מכן לחתוך את הרצועה לאורך כדי לקבל את explants הסופי. חוזרים על התהליך עד שכל הדגימה קצוצה. - מעבירים את המסלקים מיד למדיום התרבות הקר כקרח בצלחת 10 ס"מ. קח חלק מהגורמים (6-9 חתיכות), מקם אותם בצינור 1 מ"ל המכיל 10% מפתרון הפורמלין הלא-חוצץ, ועזוב בטמפרטורת החדר (RT) למשך 24 שעות.
הערה: קטעים אלה ייצגו את מסבירי השליטה עבור המצב "לא תרבותי". - מלאו את מספר הברכות הרצוי של צלחות 6-well עם 1.5 מ"ל של מדיום טרי לכל באר, ומניחים דיסק הכנסת תרבות אורגנוטיפית (ראה טבלת החומרים) בכל באר, כך שהוא צף על גבי המדיום, תוך הימנעות בזהירות מבועות אוויר בממשק הכנסת המדיה.
- בחר explants באופן אקראי, וממקם אותם אחד בכל פעם על גבי דיסק ההוספה. כדי להפוך את המצב "לא תרבותי", להשתמש 6-9 explants לבאר. מניחים את הצלחת multiwell בחממה CO2 ב 37 °C ו 5% CO2, ולאפשר explants להתאושש במשך 16 שעות.
הערה: כדי למנוע ריסוק הרקמה, מומלץ מאוד לטפל בעדינות של פינצטה.
3. טיפול תרופתי
- לאחר 16 שעות, לקחת לוחות חדשים 6-באר, להוסיף 1.5 מ"ל של בינוני טרי לכל באר, להוסיף את התרופות הרלוונטיות בריכוזים הרצויים, ולכלול באר לשליטה ברכב. בעזרת פינצטה, להעביר כל תוספת המכילה את explants ללוחות 6 באר שהוכנו לאחרונה המכילים את התרופות. מניחים את הצלחות בחממה CO2 ב 37 °C (5°F) ו 5% CO2 עבור 24-48 שעות.
- העבר את explants לא תרבותי קבוע בעבר פורמלין לתוך קלטת היסתולוגיה (ראה סעיף 4 להלן), ולאחסן 70% IMS עד סוף הניסוי.
4. עיבוד היסתולוגי
- קיבוע רקמות
- לאחר טיפול תרופתי, להעביר את דיסקי הכנס המכילים explants לתוך לוחות חדשים 6-באר המכיל 10% פורמלין, ולהוסיף כמה טיפות של 10% פורמלין על החלק העליון של explants כדי להבטיח כיסוי מלא עם הקיבוע.
זהירות: פורמרין מסוכן. יש להימנע מכל מגע עם העור, ולטפל בו בתוך מזון אדים למניעת שאיפה. - אפשר לגולמים להישאר ללילה (20-24 שעות) בפורמלין של 10%.
- למחרת, להשרות את המספר הרלוונטי של ספוגים היסתולוגיים קטנים ב 70% IMS, ולהניח אותם בתוך קלטות היסתולוגיה. מעבירים בעדינות את כל המסלקים ממצב טיפול תרופתי נתון על ספוג יחיד (לשמור על כיוון הגוזל כך שהצדדים של explants במגע עם דיסקים הכנס, ולכן האזורים שטופלו בסמים, ממוקמים במגע עם הספוג). מניחים עוד ספוג ספוג מראש על גבי explants, ומאובטח בתוך קלטת היסתולוגיה (קלטת אחת לכל טוב / טיפול).
- תטביעו את הקלטות ב-70% IMS, והשאירו ב-RT למשך 24 שעות.
- לאחר טיפול תרופתי, להעביר את דיסקי הכנס המכילים explants לתוך לוחות חדשים 6-באר המכיל 10% פורמלין, ולהוסיף כמה טיפות של 10% פורמלין על החלק העליון של explants כדי להבטיח כיסוי מלא עם הקיבוע.
- הטמעת פרפין וחתך רקמות
- למחרת, להעביר את קלטות ההיסתולוגיה המכילות את explants לתוך סל לדוגמה של מעבד הרקמות (ראה טבלת החומרים), ולאבטח את המכסה. מניחים את הסל בתשובה וסוגרת בעדינות. בחר את התוכנית הרצויה והפעל את המעבד. מסננים את התשובה, פותחים אותה כדי להסיר את הסל ומעבירים את הסל לאמבט השעווה המרכזי.
- לאחר ההטבעה, מעבירים את מכסי קלטות המתכת לסל, וחוזרים לתשובה של מעבד הרקמות לתוכנית הניקוי. נגב את החיישן עם רקמה יבשה, הסר כל שעווה עודפת ממכסה התשובה, והמשיך עם תוכנית הניקוי.
- מקם בלוק פרפין במיקרוטומיה הסיבובית, חתוך כמה חלקים ב-4 מיקרומטר, והחזיר את הבלוק לקרח. מקם מחדש את הבלוק, וחתוך מקטעים נוספים של 4 מיקרומטר. מעבירים את המקטעים עם מברשת צבע קטנה ומלקחיים על אמבט מים כדי להסיר קמטים ובועות.
- מקם את המקטעים באופן מרכזי על שקופיות מיקרוסקופ, לנקז את השקופיות במשך כמה דקות, ולהניח אותם לתוך מתלה שקופיות להתייבש לילה באינקובטור ב 37 °C (50 °F). כאשר המקטעים יבשים, אחסן אותם ב- RT בתיקיה או בתיבה שקופית כדי להגן מפני אבק.
5. ההכתמה המטוקסילין ואוסין (H&E)
- מלא את הכתם (ראה טבלת החומרים) עם ריאגנטים, ולהגדיר את התוכנית הנדרשת עבור H&E כתמים: זמן הדגירה המטוקסילין: 5 דקות; זמן הדגירה של אאוזין: 3 דקות.
- חבר את ארון התקשורת של השקופיות למנשא, מקם אותו במיכל הראשון עם קסילן והפעל את התוכנית. הסר את מנשא השקופיות מארון התקשורת והסר את הגורם המכיל עם ארון התקשורת של השקופיות לאזור הטעינה.
- הר את השקופיות עם דיבוטיל פתלט קסילן (DPX) מתחת למכסה המנוע. הנח את DPX על כל כיסוי, והנמיך את השקופית על כיסוי עם המקטע כלפי מטה, מה שמאפשר ל- DPX להתפשט.
הערה: DPX הוא מסוכן. יש להימנע מכל מגע עם העור ולהשתמש במכסה אדים ייעודי.
6. חיסון
הערה: השלבים הבאים צריכים להתבצע ב- RT אלא אם צוין אחרת.
- דפראפיזציה והידרציה
- מניחים את השקופיות בארון שקופיות, ומחממים ב-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני שמגדירים את המקטעים בקסילן למשך 3 דקות (פי 2). מזער את כמות פתרון הנשיאה.
הערה: קסילן דליקה, מסוכנת ומרגיז. יש לטפל בתוך מכסה המנוע של האדים תוך שימוש בכפפות דו-שכבתיות. יש להימנע ממגע עור ועיניים. להיפטר מפסולת בתוך מיכל אטום. - הייבשו את השקופיות בשיפוע אלכוהול כדלקמן: 99% IMS עבור דקה אחת (2x) ו-95% IMS למשך דקה אחת. מזער את כמות פתרון הנשיאה.
הערה: IMS הוא דליק מאוד, נדיף, ומעצבן. יש לטפל בתוך מכסה המנוע של האדים ולהימנע ממגע עור ועיניים. - שקוע לחלוטין במתלה השקופיות במים אולטרה-תפותיים (UP) למשך 5 דקות.
- מניחים את השקופיות בארון שקופיות, ומחממים ב-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני שמגדירים את המקטעים בקסילן למשך 3 דקות (פי 2). מזער את כמות פתרון הנשיאה.
- אחזור אנטיגן
- הכן מאגר אחזור אנטיגן בהתאם להנחיות היצרן עבור הנוגדן המסוים המשמש.
הערה: חוצץ סיטראט 0.2 M, pH 6, או טריס(הידרוקסימתיל)אמינומטן (טריס)-אתילנדיאמין חומצה טטראצטית (EDTA) 0.1 M, pH 9, הם המאגרים הנפוצים המשמשים לתנאים חומציים או אלקליין, בהתאמה. חומצת לימון מונוהידראט וטרי הם סוכנים מגורה. הכן את כל פתרונות המלאי במכסה האדים. יש להימנע ממגע עם העור והעיניים. - הטביע את ארון התקשורת המכיל את השקופיות במאגר אחזור אנטיגן, ומיקרוגל (ראה טבלת החומרים) בעוצמה מלאה (800 W) למשך 20 דקות.
הערה: שמור את השקופיות שקועות לחלוטין במאגר במהלך כל התהליך. כדי למנוע הקטנה מופרזת של אמצעי האחסון של המאגר, הנח מכסה על גבי הגורם המכיל בו נעשה שימוש.
- הכן מאגר אחזור אנטיגן בהתאם להנחיות היצרן עבור הנוגדן המסוים המשמש.
- אימונופלואורסצנטיות מולטיפלקס (mIF)
הערה: תהליך זה אורך 1-2 ימים.- מלא מיכל נקי עם 250 מ"ל של מים UP, ולהטביע לחלוטין את מתלה השקופיות במשך 2 דקות (2x). המשך בהרכבת כל שקופית לתוך לוחית כיסוי לשקופית (עיין בטבלת החומרים).
- כדי להרכיב שקופית על לוחית, הכינו שוקת זכוכית עם מים. שקועים הן את לוחית הכיסוי והן מחליקים במים, ומניחים את צד מקטע הרקמה מול לוחית הכיסוי.
- מקם את הקצה התחתון של השקופית על גבי הבלטות בתחתית לוחית הכיסוי, ולבסוף ליישר את השקופית אל לוחית הכיסוי, ומאפשר למים למלא את הפער שביניהם ללא אוויר לכוד. החזק את לוחית הכיסוי והחליקו יחד, והצב אותם בארון טיוח.
- מלאו את לוחית הכיסוי עם תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS), והמתינו עד שהמאגר ישטוף את השקופיות, הזורם החוצה בכוח המשיכה (פי 2). Pipet 110 μL של חוצץ חסימה (ראה את טבלת החומרים)על כל טייפ ודגרה במשך 10 דקות.
- הכן את דילול הנוגדנים העיקרי הרצוי ב- PBS או חסימת מאגר בהתאם להמלצות היצרן. לדגור את השקופיות עם נוגדן ראשוני (110 μL כל שקופית) במשך 30 דקות. לשטוף את השקופיות עם 5 מ"ל של PBS (2x), כמתואר ב 6.3.2.
- לדגור את השקופיות עם 110 μL של פולימר peroxidase חזרת במשך 30 דקות. לשטוף את השקופיות עם 5 מ"ל של PBS (2x), כמתואר ב 6.3.2.
- הכן דילול פלואורופור בדלל הגברה 1:100 (v/v), ודגר את השקופיות עם פלואורופור (110 μL כל שקופית) במשך 10 דקות. לשטוף את השקופיות עם 5 מ"ל של PBS (2x), כמתואר ב 6.3.2.
הערה: לשימוש פלואורופור 780, בצע את הנחיות היצרן. הניסוי עשוי להיות מושהה כאן אם השקופיות הם דגירה בשטיפה הסופית של PBS ומאוחסנים ב 4 °C (50 °F) לילה. - פתחו את השקופיות מהחלליות, וחזרו לשלב אחזור האנטיגן כדי להתחיל את הכתמים בנוגדן אחר. חזור על הכתמים עבור מספר הנוגדנים הרצוי לבדיקה.
- לאחר שלב 6.3.5 עבור פלואורופור האחרון בשימוש, לשמור את השקופיות על לוחות הכיסוי, להכין פתרון 6 מיקרומטר של 4'-6-diamidino-2-פנילינדול (DAPI) להתרחב עם מים UP, ונגד המגלשות במשך 5 דקות (110 μL כל שקופית). לשטוף את המגלשות עם מים UP (2x), ולהסיר מים עודפים על ידי ייבוש הקצוות של המגלשות. הרכב את כיסויי המכסים בשקופיות באמצעות מדיום הרכבה, ואחסן ב- RT בחושך.
- מלא מיכל נקי עם 250 מ"ל של מים UP, ולהטביע לחלוטין את מתלה השקופיות במשך 2 דקות (2x). המשך בהרכבת כל שקופית לתוך לוחית כיסוי לשקופית (עיין בטבלת החומרים).
7. סריקה
הערה: סריקת שקופיות בוצעה באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית רב-ספקטרלית (ראה טבלת החומרים).
- הרכב את השקופיות לתוך המוביל, וטען אותן לסורק בסדר הרצוי.
הערה: מומלץ לכלול שקופית בקרה שבה לא נעשה שימוש בפלואורופור או DAPI במהלך כתמים אימונוהיסטוכימיים. שקופית זו תשמש כשליטה לפלורסנס מהותי (autofluorescence (AF)) של הרקמה. - לאחר הפעלת תוכנת סורק השקופיות, בחר ערוך פרוטוקול מדף הבית. צור פרוטוקול חדש המתייחס לשם, מצב הדמיה, סוג הסריקה הרב-ספקטרלית שיש לבצע (4-7 ערוצים)ולמד (מדריךכתובות).
הערה: כדי לשנות את הגדרות ברירת המחדל של רצועות שנותחו, בחר/בטל את הבחירה במסננים הרצויים באמצעות הפונקציה בחר סרוק רצועות - המשך עם ספק החשיפה והטעינה של סריקה , ולבסוף בחר את המפעיל עבור הגדרת הפרוטוקול. בחר 'קח מבט כולל' כדי לזהות את הרקמה בשקופית. בחר שקופית המוצגת במנשאובחר אזור מסוים של הרקמה עם הסמן האדום כדי להביא אותה לתצוגה חיה בחלון הימני של המסך.
- בחר את מסנן DAPIולחץ על מיקוד אוטומטי או התאם באופן ידני את המחוון גובה שלב כדי למקד את שדה העניין. לחץ על חשיפת אוטומטית כדי לאפשר למערכת למצוא את החשיפה הטובה ביותר עבור מסנן / להקה זו.
הערה: זמן החשיפה עבור כל מסנן מוגדר על 12 ms. לאחר חשיפת המערכת באופן אוטומטי, מקד את זמן החשיפה להערכה טובה יותר. ניתן גם לעקוף את ערך ההחלמה האוטומטית על-ידי הקלדת ערך באופן ידני בתא המסומנת. - חזור על השלבים לעיל עבור כל המסננים בפרוטוקול. במידת הצורך, שנה את המיקומים ו/או השקופיות כדי למצוא את האותות הטובים ביותר להגדרת החשיפות.
הערה: אם הרקמה מסומנת באדום בתצוגה חיה, האות הפלואורסצנטי של המסנן שנותח רווי, ויש לחזור על חשיפת אוטומטית. - לאחר קביעת הגדרות החשיפה, לחץ על לחצן הקודם ושמור את הפרוטוקול. מדף הבית של התוכנה (ראה טבלת החומרים), בחר סרוק שקופיות.
- עורם את כל הספקים שיש לסרוק לתוך מלון Slide Carrier, ושים לב לסדר השקופיות כדי להקצות את המזהה שלהם למערכת.
הערה: במסך התוכנה, כל מפעיל יהיה קשור לחריץ המכיל 4 שקופיות. - כדי לקבוע תצורה של שקופיות מרובות עם אותם פרמטרים, לחץ על קביעת תצורה של משימותובחר חריץ אחד או יותר עם האפשרות Uלשיר אתאותם כללים עבור אותן שקופיות. לאחר פתיחת השקופיות, קבע את תצורת: משימות, לימוד ופרוטוקולולחץ על אישור.
- סמן כל שקופית על-ידי לחיצה על סמל חריץ והקלד שם בתא Slide ID. לחץ על סריקה כדי להתחיל בסריקה.
הערה: לאחר שסמל חריץ הופך לכחול והשקופיות מסומנות בחץ כחול, למפעיל יש את כל הכללים והוא מוכן לסריקה. ניתן לשמור את מזהי השקופיות, המחקרים, הפרוטוקולים והמשימות על-ידי לחיצה על לחצן שמור התקנה.
8. ניתוח
הערה: הפרוטוקול שלהלן ממחיש את השיטה לניתוח פנוטיפ.
- הכנת תמונה
- כדי להכין את התמונות לניתוח, פתח את תוכנת המציג (עיין בטבלת החומרים)ובחר טען שקופיות. בחר את הסריקות הרצויות עבור פרוייקט האימון בצד ימין של המסך.
- עבור כל סריקה, לחץ על חותמתובחר Project בתיבה בחר עבור: הגדר חותמת בגודל 1 x 1 בשדה התמונה שתשמש מאוחר יותר כתבנית לניתוח האימון. שים לב כי חותמת זו תסומן ריבוע אדום.
הערה: מספר הביאורים של בולים עבור הפרוייקט הוא שרירותי. מומלץ ליצור אחד עבור סריקת פלואורסצנטיות מהותית ועוד כמה כי הם בדרך כלל מייצגים את התפלגות האות בתוך הרקמה. - לבסוף, פתח את כל הסריקות של הניסוי. עבור כל אחד מהם, לחץ על חותמת, והפעם, בחר את האפשרות אצווה בתיבה בחר עבור: מקם חותמת הנימקה כל הסבר.
הערה: הפעם, הבולים יסומנו ריבועים ירוקים ויידרשו לאחר הפעלת ניתוח האצווה. בחר את הגודל המתאים עבור הבולים (1 x 1, 2 x 2, 3 x 3) והימנע מחפיפה של הבולים, אשר יפיק נתונים כפולים בקובץ המיוצא.
- ניתוח הדרכה
- הפעל את התוכנה לניתוח (ראה טבלת החומרים) וצור פרוייקט חדש: בחר קובץ | ניו | פרוייקט.
- הקלד שם בתיבה שם פרוייקט וקבע את תצורת סוג הפרוייקט.
הערה: הניסויים בוצעו באמצעות המפרטים הבאים: פילוח רקמות ניתן לאימון; פילוח תאים אדפטיבי; פנוטיפינג. - טען את הסריקות המכילות את הבולים לאימון: | פתח | תמונה. בתצוגת מצב יחיד, נווט בין התמונות ובחר את הסריקות עם פלואורסצנטיות מהותית.
- לחץ על לחצן Autofluorescence (AF), ועם בורר Autofluorescence, לצייר על חלק לא נגוע של רקמה. לחץ על הכן תמונות כדי לאפשר לתוכנה להפחית את עוצמת הפלואורסצנטיות המהותית מכל התמונות שהועלו לאימונים.
- לחץ על לחצן ערוך סמנים וצבעים והזן את שמות הסמנים בתיבה המשויכת לפלורופור שלהם. לחץ על שלב רקמת פלח השוק בחלק העליון של המסך כדי לפתוח את חלון האימון פילוח רקמות.
- בחלון קטגוריות רקמות, הקלד את שם קטגוריות הרקמות כדי לפלח את התמונות לתוך (למשל, גידול, סטרומה, רקע, נמק).
- בחלון האימון של פילוח רקמות, לחץ על לחצן צייר וצייר אזורים סביב קבוצות תאים כדי להגדיר קטגוריית רקמות של עניין. לדוגמה, כדי להגדיר אזור גידול, לצייר אזור סביב קבוצה של תאים סרטניים. עבור לקטגוריה הבאה וחזור על תהליך הציור.
הערה: מומלץ לצייר אזורים ברוב התמונות שהועלו לאימונים. ניתן גם למקד את ההכשרה על ידי עריכת סולם התבנית ורזולוציית הפילוח שפרטיהם מתוארים טוב יותר במדריך למשתמש. - לאחר שהגדר את אזורי האימון, המשך עם רכבת מקטע הרקמות.
הערה: במהלך תהליך האימון, התוכנה מציגה את אחוז הדיוק של פילוח רקמות. לקבלת תוצאות אופטימליות, מומלץ כי פילוח רקמות להיות לפחות 90% מדויק. לאחר שהמקטע התייצב, לחץ על לחצן סיום. - כדי לראות את מסיכת קטגוריית הרקמות בכל התמונות, לחץ על לחצן פלח הכל.
- לאחר אימות איכות פילוח הרקמות, צייר מחדש את אזורי האימון סביב האזורים שסווגו באופן שגוי, ואמן מחדש את מקטע הרקמות עד שהתהליך יצליח.
- לחץ על שלב פילוח התאים בסרגל השלבים בחלק העליון של החלון כדי להמשיך בניתוח.
- בחר את התאים התאיים לפלח: גרעינים, ציטופלסמה, ו / או ממברנה.
הערה: מכיוון שסגמנטציה של תאים אדפטיביים יכולה לזהות רק תאים עם אות גרעיני, אל תבחר גרעינים. למרות שניתן גם לפלח ציטופלסמה ו/או ממברנה, מומלץ לבחור תחילה את הרכיב הגרעיני החזק והשופע ביותר (למשל, DAPI). - קבע את תצורת הרכיב הגרעיני באמצעות המחוון 'עוצמה אופיינית' להתאמת הסף המשמש לזיהוי פיקסלים גרעיניים. שים לב לחלון התצוגה המקדימה שנפתח ומספק משוב חי כאשר הסף מותאם.
הערה: סף זה הוא אדפטיבי ונמדד ביחס לרקע שמסביב. הגדל ערך זה אם יותר מדי רקע מזוהה כגרעין. תנמיך את הערך הזה אם חסרים גרעינים קלושים. השתמש בלחצן הצג/הסתר אזורים כדי להבהב במסיכות הפילוח לסירוגין, ובדוק אם הפיקסלים הנכונים מזוהים כגרעין. - לפיצול אשכולות של פיקסלים גרעיניים, השתמש בלוח פיצול רכיבים גרעיניים. בחר את הלחצן המתאר בצורה הטובה ביותר את איכות הכתמים של הגרעינים. לאחר מכן, השתמש בסרגל המחוון כדי להתאים את רגישות הפיצול, תוך התחשבות שערכים נמוכים יותר יביאו לפיצול רב יותר.
- לחץ על לחצן פלח שוק הכל כדי לפלח את כל התמונות. אם התוצאה אינה מדויקת, שנה את ההגדרות ואמן מחדש את התוכנה עד להשגת פילוח מספק.
- המשך לשלב האחרון של הניתוח: פנוטיפינג. בחלונית Phenotypes, הוסף את רשימת הפנוטיפים שיש לזהות, והקלד את השם בתיבת הטקסט המתאימה. לחץ על לחצן ערוך Phenotypes, בחר תא מסוים כדי להעלות תפריט נפתח, ובחר את הפנוטיפ המתאים.
הערה: לפחות חמישה תאים עבור כל פנוטיפ יש צורך לאמן את המסווג. כיבוי ההדמיה של הגרעינים מאפשר הדמיה טובה יותר של פנוטיפ התא כי צריך להיות מוקצה. - לאחר השלמת הבחירה להכשרה, לחץ על לחצן מסווג הרכבת.
הערה: התוכנה תסווג כל תא בודד בתמונה, ובכל פעם שמתרחשות שגיאות בסיווג, ניתן לערוך את הפנוטיפ של התאים ולחזור על האימון של המסווג. שמור את הפרוייקט לפני שתמשיך לניתוח אצווה ולחץ על הייצוא בסרגל הכלים בחלק העליון של המסך. - בחר בכרטיסיה ניתוח אמבטיה בתפריט הימני וטען את הפרוייקט בתיבה אלגוריתם אצווה או פרוייקט.
- לחץ על אפשרויות ייצוא כדי ליצור ספריות נפרדות עבור כל תמונה, ועם לחצן עיון, נווט כדי למצוא את המיקום לייצוא הנתונים. לחץ על כל האפשרויות של תמונות וטבלאות לייצוא.
- בצד שמאל של המסך, לחץ על הוסף שקופיות וטען את כל התמונות המכילות בולים עבור אצוות שהוכנו בעבר (שלב 7.3). לחץ על לחצן הפעל כדי להתחיל את ניתוח האצווה ולעבד חותמת אחת בכל פעם, ייצוא הנתונים המתאימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הדמיה רב-ספקטרלית של קטעים היסתולוגיים מוכתמים MIF מאפשרת זיהוי ופנוטיפינג של אוכלוסיות תאים בודדים וזיהוי של רכיבים סרטניים וסטרומליים ב- TME המהולל (איור 2). הדמיה רב-ספקטרלית שימושית במיוחד לניתוח רקמות עם אוטופלואורסצנטיות פנימית גבוהה, כגון רקמות עם תכולת קולגן גבוהה, שכן היא מאפשרת לאות autofluorescence להיות דה-סובב מאותות אחרים ולא נכלל בניתוח הבא. לאחר מכן, רקמת סיליקו וסגמנטציה של תאים מאפשרת כימות של תגובת התרופה עם שפע של יציאות כולל, אך לא רק, מספרי תאים גולמיים (למשל, אחוז חיוביות), עוצמת האות, גודל התא, אזור הרקמה והמיקום המרחבי של תאים בודדים.
פילוח רקמות ותאים הוא אפוא שימושי ביותר לניתוח כמותי של תוצאות הטיפול התרואטי ולזיהוי תגובות ספציפיות לגידולים ולסטרומיים. לדוגמה, כתמים עבור Ki67 ו- cPARP לצד סמן גידול מאפשרים את כמות ההתפשטות ורמות המוות של תאים, בהתאמה, ב explants (איור 3). בדוגמה שניתנה, רמות Ki67 ו- cPARP הן כמות עבור אזורים סטרומיים וגידולים ב- PDEs בתגובה לחלבון המוות התאי אנטי מתוכנת 1 (PD-1) מעכב מחסום חיסוני (ICI), nivolumab. בנוסף, היכולת לחלץ מידע מרחבי ממקטעים מוכתמים מאפשרת חישוב של מרחקים בין-תאיים כמו גם מרחקים לגבולות הגידול ומבנים אחרים. לכן, ניתן לנתח באופן כמותי שינויים בהפצה הסלולרית לאחר טיפול תרופתי (איור 4). הדוגמה המוצגת מייצגת טיפול PDE עם nivolumab.
איור 1: זרימת עבודה לדור וניתוח של PDEs. (A)דגימות גידול אנושי שנקטפו זה עתה מעובדות ומסודרות על תרבות חדירה להכניס דיסק צף במדיום תרבות. (B)לאחר טיפול תרופתי, explants נקצרים, נתון FFPE, ולאחר מכן חתך לניתוח היסתולוגי, למשל, עבור כתמי H&E. (C)כתמי mIF וסריקה של מקטעי הרקמה מבוצעים כדי ליצור תמונות רב-ספקטרליות שמהן ניתן לפענח אותות בודדים ולנתח בנפרד. (D)ניתוח של תמונות מרוכבים מאפשר הפרדה של גידול ואזורים סטרומה והערכה של פנוטיפ של סוגי תאים שונים. קיצורים: PDE = explant נגזר המטופל; FFPE = קבוע בפורמלין, מוטבע בפרפין; H&E = המטוקסילין ואוסין; mIF = אימונופלואורסצנטיות מולטיפלקס; HRP = פרוקסידז חזרת; H2O2 = מי חמצן; Ab = נוגדן; TSA = הגברת אות טירמיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דוגמה למקטע רקמות מוכתם MIF. רקמת explant NSCLC היה מוכתם עבור סמנים של הכדאיות התא, כלומר, cPARP (אדום) ו Ki67 (ירוק) כמו גם סמן פאן-ציטוקרטין (צהוב) ו DAPI (כחול) כדי לסמן גרעינים. הדמיה רב-ספקטרלית בוצעה כדי לפענח את אותות הפלואורסצנטי ולהסיר את ההפלה האוטומטית. התמונות מציגות הגדלה של שדה שנבחר פי 20. סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: mIF = אימונופלואורסצנטיות מולטיפלקס; NSCLC = סרטן ריאות תאים לא קטנים; cPARP = פולי-ADP פולימראז פולי-ADP; CK = ציטוקרטין; DAPI = 4'-6-דימידינו-2-פנילינדול; AF = autofluorescence. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: כימות מוות תאים והתפשטות ב-PDEs. דוגמה של חלקות תיבה ושפם מראה אינדוקציה אפופטוזיס PDEs NSCLC לאחר 24 שעות של טיפול עם 5 מיקרוגרם / מ"ל nivolumab לעומת שליטה בינונית. אחוז ההתפשטות (Ki67) ואחוז אירועי המוות של תאים אפופוטוטיים (cPARP) מוצגים באזור הגידול ובסטרומה, בהתאמה. כל נקודה מייצגת הסבר יחיד, הקו המרכזי של התיבה מייצג את החציון של ההתפלגות, וצידי התיבה (למטה ולמעלה) מייצגים את המחצבה הראשונה והשלישית, בהתאמה. קווי שגיאה מייצגים את הטווח הבין-קווי (יותר מ- 1.5 x IQR). קיצורים: PDE = explant נגזר המטופל; NSCLC = סרטן ריאות תאים לא קטנים; cPARP = פולי-ADP פולימראז פולי-ADP; IQR = טווח בין-קווירטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ארגון מרחבי לאחר טיפול תרופתי. (A)תמונות מייצגות המציגות כתמי mIF של סמני תאי T-CD4, FOXP3, CD8 (פאנל שמאלי) - מבוצעות על מוסף מלנומה, וניתוח פנוטיפ מתאים (מימין) המזהה מרחקים בין תאי CD8+ לתאי Treg (CD4+/FOXP3+). סרגלי קנה מידה = 200 מיקרומטר. (B)חלקת היסטוגרמה המציגה מרחק מוגבר בין תאי T ציטוטוקסיים (CD8+) ותאי Treg (CD4+/FOXP3+) לאחר טיפול ב- PDEs מלנומה עם 5 מיקרוגרם / מ"ל של nivolumab, המאשר השפעות על היעד של התרופה IO. יחידת צפיפות מתבטאת כמספר התאים המחולק בסכום של כל התאים לכל רוחב פס. קיצורים: mIF = אימונופלואורסצנטיות מולטיפלקס; CD = אשכול של בידול; FOXP3 = תיבת מזלג P3; PDE = הסבר שמקורו במטופל; NSCLC = סרטן ריאות תאים לא קטנים; IO = אימונונקולוגיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מתאר את שיטות הדור, הטיפול התרותי והניתוח של מחשבי כף יד ומדגיש את היתרונות של הפלטפורמה כמערכת מודל פרה-קלינית. פולחן Ex vivo של גידול שנפלט טרי, שאינו כרוך בפירוקו, מאפשר שימור של ארכיטקטורת הגידול13,24 ולכן, את האינטראקציות המרחביות של רכיבים תאיים ב- TME, כמו גם הטרוגניות תוך-מוראלית. שיטה זו מדגימה כיצד באמצעות סמן ספציפי לגידול ניתן לזהות אזורים ברקמת הגידול לעומת אזורים של סטרומה ולכן להפריד תגובות סמים בתוך תאים אלה (איור 3). בנוסף, ניתן ליצור פרופיל של סמנים ביולוגיים מרובים בו זמנית כדי להעריך, למשל, את התנועה על היעד של תאי מערכת החיסון בתוך ה- TME (איור 4).
פרסום קודם תיעד את היישום של פלטפורמת PDE זו כדי ריבוד של PDEs NSCLC עבור הסטנדרט של טיפול כימותרפיה, ציספלטין, מראה כי ניתן להפרך צ'מורים מן אוכלוסיות chemosensitive24. ממצאים אלה הקשורים ל-PDE משקפים את תגובות המטופלים. על ידי ביצוע השיטות המתוארות כאן, ניתן לבצע גישות דומות לסוגי גידולים אחרים ועם סוגים שונים של תרופות, כימותרפיה או אחרת. ההפרדה של PDEs לאוכלוסיות רגישות לתרופות ועמידות לתרופות יוצרת משאב רב ערך ליצירת תובנות מכניות נוספות על עמידות לתרופות. לדוגמה, מכיוון שניתן לעבד PDEs עבור בידוד RNA, DNA, חלבון או מטבוליט, הדבר יכול לאפשר הטמעה של טכנולוגיות "omic" כדי לזהות סמנים ביולוגיים מרכזיים המנבאים תגובה. לחלופין, מקטעי FFPE שנוצרו מ- PDEs מטופלים יכולים לשמש ליצירת פרופיל מרחבי נרחב כדי להבין כיצד סוגי תאים שונים ב- PDE תורמים להתנגדות לתרופות.
זה עשוי להיות קל על ידי התפתחויות נוספות בהדמיה רב ספקטרלית ו ציטומטריה המוניתמתקרב 35,40,41,42,43, אשר יאפשר מאות סמנים ביולוגיים להיות פרופיל בו זמנית. מודלים פרה-אקליניים המעריכים יעילות חיסונית מבוקשים מאוד, ומסמך זה מדגים כי PDEs יכולים למלא את הנישה הקריטית הזו (איור 3 ואיור 4). נוגדנים חד שבטיים המתמקדים במחסומים חיסוניים, כגון אנטיגן T-לימפוציטים ציטוטוקסי 4 ו- PD-1/מתוכנת ליגנד-1 (PD-L1), פותחו44,45,46,47 עם כמה שיפורים מדהימים בהישרדות החולה הכוללת במספר רב של גידולים מוצקים בהשוואה לכימותרפיה סטנדרטית. עם זאת, ICIs יעילים במספר מוגבל של חולים מסיבות שאינן ברורות, המחייבות זיהוי של סמנים ביולוגיים חזויים48. התכונה הבולטת של PDEs-שמירה על הארכיטקטורה 3D של רקמת הגידול - מקלה על הערכת היעילות ICI (איור 3) וניטור של תאי מערכת החיסון בתגובה לטיפול ICI (איור 4). לפיכך, PDEs הם פלטפורמה אידיאלית להבחנה בין מקרים רגישים ל- ICI לעומת ICI ולחקירת המנגנונים העומדים בבסיס הבחנה זו.
טכנולוגיית PDE סובלת מכמה חסרונות. הדור של תוצאות מדויקות, ניסיוניות מ PDEs מסתמך על שלמות הגידול, ומדי פעם, דגימות גידול לאחר הניתוח הם נמק מדי כדי לעבד עבור PDEs. יתר על כן, למרות כמה דוגמאות ספציפיות של שמירה על שלמות הרקמה לאחר תרבות ממושכת25, עבור רוב המקרים שדווחו, שלמות ושמיה אבד לאחר 72 שעות בתרבית, התפוררות רקמות מתרחשת. חלון הזמן לביצוע ניסויי סמים הוא אפוא מוגבל יחסית, האוסר על השימוש במודל זה לחקר מנגנוני עמידות לתרופות שנרכשו או לחקר הפלישה והטפסטזיס13. הרחבת הכדאיות של explants עשוי להתאפשר בעתיד באמצעות פיתוח של טכנולוגיות חדשות, כגון פיגומים וערוצים perfused, אשר עשוי להקל על דיפוזיה וספיגה של חומרים מזינים, המאפשר תרבות מורחבת יותר.
עם זאת, עד שיפורים אלה ניתן לבצע, פלטפורמת PDE צריך להיחשב שיטת תרבות לטווח קצר שיכול לספק נתוני תגובה מיידית לתרופות. יש להשתמש בו לצד מערכות מודל אחרות, כגון אורגנוידים ומודלים PDX, שיכולים לספק נתוני תגובה לתרופות לטווח ארוך יותר. בסך הכל, פלטפורמת PDE היא מערכת מודל פרה-כליני הוכחת הרעיון כי הוא שימוש בקביעת הרגישות של הגידול של המטופל לסוכן נגד נגד נתון, להפקת תובנה על מנגנונים של פעילות סמים בגידול אמיתי, ולפיתוח סמנים ביולוגיים חזויים ופרמקודינמיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין מה לחשוף
Acknowledgments
אנו מודים למנתחים ולפתולוגים בבתי החולים האוניברסיטאיים של לסטר NHS Trust על מתן רקמת גידול שנקטה בניתוח. אנו מודים גם למתקן ההיסטולוגיה בשירותי הליבה ביוטכנולוגיה על עזרה בעיבוד רקמות וחיתוך של בלוקי רקמת FFPE וקייס סטראטמן על תמיכה בשימוש ב- Vectra Polaris. מחקר זה נתמך ומומן על ידי קונסורציום Explant המורכב מארבעה שותפים: אוניברסיטת לסטר, היחידה טוקסיקולוגיה MRC, מחקר סרטן בריטניה מעבדות גילוי טיפולי, ו LifeArc. תמיכה נוספת ניתנה על ידי המרכז לרפואה ניסיונית לסרטן CRUK-NIHR לסטר (C10604/A25151). המימון ל- GM, CD ו- NA סופק על ידי תוכנית הזרז של סרטן השד עכשיו (2017NOVPCC1066), הנתמכת במימון פייזר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma | 320099 | Staining reagent |
| Antibody Diluent / Block, 1x | Perkin Elmer | ARD1001EA | Antibody diluent/blocking buffer |
| Barnstead NANOpure Diamond | Barnstead | Ultra Pure (UP) H2O machine | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma-Aldrich | C7129 | Reagent for citrate buffer |
| Costar Multiple Well Cell Culture Plates | Corning Incorporated | 3516 | 6 multiwell plate |
| DAPI Dilactate | Life Technologies | D3571 | |
| 100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | 100 mm diameter dish for tissue culture |
| DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate | Gibco (Life Technologies) | 10569-010 | Tissue culture medium (500 mL) |
| DPX mountant | VWR | 360294H | Mounting medium |
| DPX mountant | Merck | 6522 | Mounting medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | Reagent for TE buffer |
| Eosin | CellPath | RBC-0100-00A | Staining reagent |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | For use in tissue culture medium |
| 37% Formaldehyde | Fisher (Acros) | 119690010 | 10% Formalin |
| iGenix, microwave oven IG2095 | iGenix | IG2095 | Microwave used for antigen retreival |
| Industrial methylated spirit (IMS) | Genta Medical | 199050 | 99% Industrial Denatured Alcohol (IDA) |
| InForm Advanced Image Analysis Software | Akoya Biosciences | InForm | |
| Leica ASP3000 Tissue Processor | Leica Biosystems | Automated Vacuum Tissue Processor | |
| Leica Arcadia H and C | Leica Biosystems | Embedding wax bath | |
| Leica RM2125RT | Leica Biosystems | Rotary microtome | |
| Leica ST4040 Linear Stainer | Leica Biosystems | H&E stainer | |
| Mayer's Haematoxylin | Sigma | GHS132-1L | Staining reagent |
| Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Merck Milipore | PICMORG50 | Organotypic culture insert disc |
| Novolink Polymer Detection System | Leica Biosystems | RE7150-K | DAB staining kit |
| OPAL 480 | Akoya Biosciences | FP1500001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagent | Akoya Biosciences | FP1501001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent |
| Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x | Perkin Elmer | ARH1001EA | HRP polymer |
| Penicillin/streptomycin solution | Fisher Scientific | 11548876 | For use in tissue culture medium |
| PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer | Akoya Biosciences | PhenoChart | Viewer software for scanned images |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Thermo Scientific Oxoid | BR0014G | PBS |
| 1x Plus Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36961 | Mounting medium |
| Slide Carrier | Perkin Elmer | To load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S/3160/63 | 10% Formalin |
| Sodium Hydroxide pellets | Fisher Scientific | S/4920/53 | Reagent for citrate buffer |
| Tenatex Toughened Wax - Pink (500 g) | KEMDENT | 1-601 | Dental wax surface |
| Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining Center | Fisher Scientific | 10098889 | Holder for slides and slide clips |
| Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates | Fisher Scientific | 11927774 | Slide clips |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | 252859 | Reagent for TE buffer |
| VectaShield | Vecta Laboratories | H-1000-10 | Mounting medium |
| Vectra Polaris Slide Scanner | Perkin Elmer | Vectra Polaris | Slide scanner |
| Xylene | Genta Medical | XYL050 | De-waxing agent |
References
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. The New England Journal of Medicine. 366 (10), 883-892 (2012).
- Jamal-Hanjani, M., et al. Tracking the evolution of non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 376 (22), 2109-2121 (2017).
- McGranahan, N., Swanton, C. Biological and therapeutic impact of intratumor heterogeneity in cancer evolution. Cancer Cell. 27 (1), 15-26 (2015).
- Casey, T., et al. Molecular signatures suggest a major role for stromal cells in development of invasive breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 114 (1), 47-62 (2009).
- Gerdes, M. J., et al. Emerging understanding of multiscale tumor heterogeneity. Frontiers in Oncology. 4, 366 (2014).
- Komohara, Y., Takeya, M. CAFs and TAMs: maestros of the tumour microenvironment. The Journal of Pathology. 241 (3), 313-315 (2017).
- Miyake, M., et al. CXCL1-mediated interaction of cancer cells with tumor-associated macrophages and cancer-associated fibroblasts promotes tumor progression in human bladder cancer. Neoplasia. 18 (10), 636-646 (2016).
- Hisamitsu, S., et al. Interaction between cancer cells and cancer-associated fibroblasts after cisplatin treatment promotes cancer cell regrowth. Human Cell. 32 (4), 453-464 (2019).
- Witz, I. P. The tumor microenvironment: the making of a paradigm. Cancer Microenvironment. 2, Suppl 1 9-17 (2009).
- Fu, X. T., et al. Tumor-associated macrophages modulate resistance to oxaliplatin via inducing autophagy in hepatocellular carcinoma. Cancer Cell International. 19, 71 (2019).
- Chen, D., Zhang, X. Tipping tumor microenvironment against drug resistance. Journal of Oncology Translational Research. 1 (1), 106 (2015).
- Roma-Rodrigues, C., Mendes, R., Baptista, P. V., Fernandes, A. R. Targeting tumor microenvironment for cancer therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (4), 840 (2019).
- Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
- Freeman, A. E., Hoffman, R. M. In vivo-like growth of human tumors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 83 (8), 2694-2698 (1986).
- Vescio, R., et al. A. al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 84 (14), 5029-5033 (1987).
- Hoffman, R. M. 3D Sponge-matrix histoculture: an overview. Methods in Molecular Biology. 1760, 11-17 (2018).
- Vescio, R. A., Connors, K. M., Kubota, T., Hoffman, R. M. Correlation of histology and drug response of human tumors grown in native-state three-dimensional histoculture and in nude mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 88 (12), 5163-5166 (1991).
- Furukawa, T., Kubota, T., Hoffman, R. M. Clinical applications of the histoculture drug response assay. Clinical Cancer Research. 1 (3), 305-311 (1995).
- Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nature Reviews Urology. 10 (8), 483-487 (2013).
- Centenera, M. M., et al. Evidence for efficacy of new Hsp90 inhibitors revealed by ex vivo culture of human prostate tumors. Clinical Cancer Research. 18 (13), 3562-3570 (2012).
- Dean, J. L., et al. Therapeutic response to CDK4/6 inhibition in breast cancer defined by ex vivo analyses of human tumors. Cell Cycle. 11 (14), 2756-2761 (2012).
- Majumder, B., et al. Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity. Nature Communications. 6, 6169 (2015).
- Goldman, A., et al. Temporally sequenced anticancer drugs overcome adaptive resistance by targeting a vulnerable chemotherapy-induced phenotypic transition. Nature Communications. 6, 6139 (2015).
- Karekla, E., et al. Ex vivo explant cultures of non-small cell lung carcinoma enable evaluation of primary tumor responses to anticancer therapy. Cancer Research. 77 (8), 2029-2039 (2017).
- Ricciardelli, C., et al. Novel ex vivo ovarian cancer tissue explant assay for prediction of chemosensitivity and response to novel therapeutics. Cancer Letters. 421, 51-58 (2018).
- Yoshimasu, T., et al. Histoculture drug response assay (HDRA) guided induction concurrent chemoradiotherapy for mediastinal node-positive non-small cell lung cancer. Gan To Kagaku Ryoho. Cancer and chemotherapy. 30 (2), 231-235 (2003).
- Pirnia, F., et al. Ex vivo assessment of chemotherapy-induced apoptosis and associated molecular changes in patient tumor samples. Anticancer Research. 26, 1765-1772 (2006).
- Maund, S. L., Nolley, R., Peehl, D. M. Optimization and comprehensive characterization of a faithful tissue culture model of the benign and malignant human prostate. Laboratory Investigation. 94 (2), 208-221 (2014).
- Vasaturo, A., Galon, J. Multiplexed immunohistochemistry for immune cell phenotyping, quantification and spatial distribution in situ. Methods in Enzymology. 635, 51-66 (2020).
- Fuhrman, K., et al. Molecularly guided digital spatial profiling for multiplexed analysis of gene expression with spatial and single cell resolution. Journal of Biomolecular Techniques. 31, 14-15 (2020).
- Twiddy, D., et al. A TRAIL-R1-specific ligand in combination with doxorubicin selectively targets primary breast tumour cells for apoptosis. Breast Cancer Research. 12 (1), 58 (2010).
- Cai, H., et al. Cancer chemoprevention: Evidence of a nonlinear dose response for the protective effects of resveratrol in humans and mice. Science Translational Medicine. 7 (298), (2015).
- Busacca, S., et al. Resistance to HSP90 inhibition involving loss of MCL1 addiction. Oncogene. 35 (12), 1483-1492 (2016).
- Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. Elife. 7, 30224 (2018).
- Toki, M. I., et al. High-plex predictive marker discovery for melanoma immunotherapy-treated patients using digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 25 (18), 5503-5512 (2019).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Park, I. J., et al. Prediction of radio-responsiveness with immune-profiling in patients with rectal cancer. Oncotarget. 8 (45), 79793-79802 (2017).
- Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
- Kather, J. N., et al. Topography of cancer-associated immune cells in human solid tumors. Elife. 7, 36967 (2018).
- Zollinger, D. R., Lingle, S. E., Sorg, K., Beechem, J. M., Merritt, C. R. GeoMx™ RNA assay: high multiplex, digital, spatial analysis of RNA in FFPE tissue. Methods in Molecular Biology. 2148, 331-345 (2020).
- Zugazagoitia, J., et al. Biomarkers associated with beneficial PD-1 checkpoint blockade in non-small cell lung cancer (NSCLC) identified using high-plex digital spatial profiling. Clinical Cancer Research. 26 (16), 4360-4368 (2020).
- Allo, B., Lou, X., Bouzekri, A., Ornatsky, O. Clickable and high-sensitivity metal-containing tags for mass cytometry. Bioconjugate Chemistry. 29 (6), 2028-2038 (2018).
- Gerdtsson, E., et al. Multiplex protein detection on circulating tumor cells from liquid biopsies using imaging mass cytometry. Convergent Science Physical Oncology. 4 (1), 015002 (2018).
- Reck, M., et al. Pembrolizumab versus chemotherapy for PD-L1-positive non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1823-1833 (2016).
- Le, D. T., et al. KEYNOTE-164: Phase 2 study of pembrolizumab for patients with previously treated, microsatellite instability-high advanced colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 34, 15_suppl 3631 (2016).
- Diaz, L. A., et al. KEYNOTE-177: Randomized phase III study of pembrolizumab versus investigator-choice chemotherapy for mismatch repair-deficient or microsatellite instability-high metastatic colorectal carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 35, 4_suppl 815 (2017).
- Long, G. V., et al. Impact of baseline serum lactate dehydrogenase concentration on the efficacy of pembrolizumab and ipilimumab in patients with advanced melanoma: data from KEYNOTE-006. European Journal of Cancer. 72, 122-123 (2017).
- Voong, K. R., Feliciano, J., Becker, D., Levy, B. Beyond PD-L1 testing-emerging biomarkers for immunotherapy in non-small cell lung cancer. Annals of Translational Medicine. 5 (18), 376 (2017).
