Summary
यह पेपर एक जीवित, रोगी-प्रासंगिक, प्रीक्लिनिकल मॉडल प्रणाली में ट्यूमर दवा प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए रोगी-व्युत्पन्न एक्सप्लांट के उत्पादन, दवा उपचार और विश्लेषण के तरीकों का वर्णन करता है।
Abstract
दवा प्रतिरोध की समझ और अत्यधिक प्रतिरोधी कैंसर को जागरूक करने के लिए उपन्यास रणनीतियों का विकास उपयुक्त प्रीक्लिनिकल मॉडल की उपलब्धता पर भरोसा करता है जो रोगी प्रतिक्रियाओं की सटीक भविष्यवाणी कर सकते हैं। मौजूदा प्रीक्लिनिकल मॉडल के नुकसान में से एक मानव ट्यूमर माइक्रोएनवायरनमेंट (टीएमई) को प्रासंगिक रूप से संरक्षित करने में असमर्थता है और इंट्राट्यूमरल विषमता का सही प्रतिनिधित्व करता है, इस प्रकार डेटा के नैदानिक अनुवाद को सीमित करता है। इसके विपरीत, मानव ट्यूमर के जीवित टुकड़ों की संस्कृति का प्रतिनिधित्व करके, रोगी-व्युत्पन्न एक्सप्लांट (पीडीई) मंच दवा प्रतिक्रियाओं को त्रि-आयामी (3 डी) संदर्भ में जांच करने की अनुमति देता है जो मूल ट्यूमर की रोग और वास्तुशिल्प विशेषताओं को यथासंभव बारीकी से प्रतिबिंबित करता है। पीडीई के साथ पिछली रिपोर्टों ने केमोरिस्ट्रिस्ट ट्यूमर से केमोसेंसिटिव को अलग करने के लिए मंच की क्षमता का दस्तावेजीकरण किया है, और यह दिखाया गया है कि यह अलगाव एक ही कीमोथेरपी के लिए रोगी प्रतिक्रियाओं का भविष्य कहनेवाला है। इसके साथ ही, पीडीई दवा प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी करने वाले ट्यूमर की आणविक, आनुवंशिक और हिस्टोलॉजिकल सुविधाओं से पूछताछ करने का अवसर देते हैं, जिससे प्रतिरोधी ट्यूमर को जागरूक करने के लिए रोगी स्तरीकरण के साथ-साथ उपन्यास इंटरवेंशनल दृष्टिकोणों के लिए बायोमार्कर की पहचान होती है। यह पेपर पीडीई पद्धति की विस्तार से रिपोर्ट करता है, रोगी के नमूनों के संग्रह से लेकर एंडपॉइंट विश्लेषण तक। यह एक्सप्लांट व्युत्पन्न और संस्कृति विधियों का विस्तृत विवरण प्रदान करता है, विशेष ट्यूमर के लिए बेस्पोक स्थितियों को रेखांकित करता है, जहां उचित हो। एंडपॉइंट विश्लेषण के लिए, ट्यूमर और स्ट्रोमल दोनों क्षेत्रों के भीतर प्रमुख बायोमार्कर के स्थानिक प्रोफाइलिंग के लिए मल्टीप्लेक्स्ड इम्यूनोफ्लोरेसेंस और मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग पर ध्यान केंद्रित किया गया है। इन तरीकों के संयोजन से, मात्रात्मक और गुणात्मक दवा प्रतिक्रिया डेटा उत्पन्न करना संभव है जो विभिन्न चिकित्सकीय मापदंडों से संबंधित हो सकता है और इस प्रकार संभावित रूप से बायोमार्कर पहचान के लिए उपयोग किया जा सकता है।
Introduction
प्रभावी और सुरक्षित कैंसर रोधी एजेंटों के विकास के लिए उपयुक्त प्रीक्लिनिकल मॉडल की आवश्यकता होती है जो कार्रवाई के तंत्र में अंतर्दृष्टि भी प्रदान कर सकते हैं जो भविष्य कहनेवाला और फार्माकोडायनामिक बायोमार्कर की पहचान की सुविधा प्रदान कर सकते हैं। अंतर और इंट्राट्यूमर विषमता1,2,3,4,5 और टीएमई6,7,8,9,10,11, 12कैंसर रोधी दवा प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करने के लिए जाने जाते हैं, और सेल लाइनों, ऑर्गेनॉइड और माउस मॉडल जैसे कई मौजूदा प्रीक्लिनिकल कैंसर मॉडल पूरीतरह से इन महत्वपूर्ण महत्वपूर्ण को समायोजित करने में सक्षम नहीं हैं सुविधाऐं। एक "आदर्श" मॉडल एक है कि ट्यूमर के भीतर गैर घातक कोशिकाओं के साथ घातक के जटिल स्थानिक बातचीत संक्षिप्त कर सकते है और साथ ही ट्यूमर के भीतर क्षेत्रीय मतभेदों को प्रतिबिंबित । यह लेख पीडीई पर एक उभरते मंच के रूप में केंद्रित है जो इनमें से कई आवश्यकताओं को पूरा कर सकता है13.
मानव पीडीई के उपयोग का पहला उदाहरण, जिसे हिस्टोकल्चर के रूप में भी जाना जाता है, 1 9 80 के दशक के उत्तरार्ध में है जब हॉफमैन एट अल ने हौसले से पुनः प्राप्त मानव ट्यूमर के स्लाइस उत्पन्न किए और उन्हें कोलेजन मैट्रिक्स14,15में सुसंस्कृत किया। इसमें एक 3 डी संस्कृति प्रणाली स्थापित करना शामिल था जो ऊतक वास्तुकला को संरक्षित करता है, जो टीएमई के भीतर स्ट्रोमल घटकों और सेल इंटरैक्शन के रखरखाव को सुनिश्चित करता है। मूल ट्यूमर को विघटित किए बिना, हॉफमैन एटअल16 ने ट्रांसलेशनल रिसर्च के एक नए दृष्टिकोण की शुरुआत की, और इस समय से, कई समूहों ने ऊतक अखंडता को संरक्षित करने और सटीक दवा प्रतिक्रिया डेटा17, 18, 19,20,21,22, 23,24बनाने के उद्देश्य से विभिन्न एक्सप्लांट तरीकों को अनुकूलित किया है। , हालांकि प्रोटोकॉल के बीच कुछ मतभेद स्पष्ट हैं । बटलर एट अल. नमूने के माध्यम से पोषक तत्वों और दवाओं के प्रसार में मदद करने के लिए जिलेटिन स्पंज में सुसंस्कृत explants20,21,25,जबकि मजूमडर एट अल. एक ही रोगी22से प्राप्त ऑटोलॉगस सीरम की उपस्थिति में ट्यूमर और स्ट्रोमल प्रोटीन से बना मैट्रिक्स के शीर्ष पर explants खेती द्वारा एक ट्यूमर पारिस्थितिकी तंत्र बनाया, 23.
हाल ही में, हमारे समूह ने एक प्रोटोकॉल स्थापित किया है जिससे ट्यूमर के विखंडन से 2-3 मिमी3आकार के टुकड़े उत्पन्न होते हैं जो तब संस्कृति प्रणाली24के वायु-तरल इंटरफ़ेस पर पारमीय झिल्ली पर अतिरिक्त घटकों के बिना रखे जाते हैं। एक साथ लिया, इन कई अध्ययनों से पता चला है कि पीडीई मानव ट्यूमर के अक्षुण्ण, जीवित टुकड़े की संस्कृति की अनुमति देते हैं जो स्थानिक वास्तुकला और मूल ट्यूमर की क्षेत्रीय विषमता को बनाए रखते हैं। मूल प्रयोगों में, एक्सप्लांट या हिस्टोकल्चर आमतौर पर दवा उपचार के बाद समरूपता के अधीन होते थे, जिसके बाद विभिन्न व्यवहार्यता परख को समरूप नमूनों जैसे हिस्टोकल्चर ड्रग रिस्पांस परख20,21,एमटीटी (3-(6) -2,5-डिफेनिल्टेट्राजोलम ब्रोमाइड) परख, लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज परख, या रेसज़िन आधारित परख26,27, 28परी के रूप में लागू किया गया था। . एंडपॉइंट विश्लेषण तकनीकों, विशेष रूप से डिजिटल पैथोलॉजी में हाल की प्रगति ने अब एंडपॉइंट परीक्षणों और परखों के प्रदर्शनों की सूची का विस्तार किया है जो29,30के एक्सप्लांट्स पर किया जा सकता है। इन नई प्रौद्योगिकियों को लागू करने के लिए, समरूपता के बजाय, पैराफिन (एफएफपीई) में एम्बेडेड फॉर्मेलिन में एक्सप्लांट तय किए जाते हैं और फिर इम्यूनोस्टेटिंग तकनीकों का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है, जिससे स्थानिक प्रोफाइलिंग की अनुमति होती है। इस दृष्टिकोण के उदाहरण गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (एनएससीएलसी), स्तन कैंसर के लिए प्रलेखित किया गया है, कोलोरेक्टल कैंसर, और मेसोथेलियोमा एक्सप्लांट्स जिससे प्रसार मार्कर, Ki67, और एपोप्टोटिक मार्कर, क्लीव्ड पॉली-एडीपी रिबोज़ पॉलीमरेज (सीपीआरपी) के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला, सेल प्रसार औरसेल डेथ24,31, 32,33,34में परिवर्तन की निगरानी के लिए उपयोग किया गया था।
मल्टीप्लेक्स्ड इम्यूनोफ्लोरेसेंस विशेष रूप से एंडपॉइंट35पर एक्सप्लांट में दवा प्रतिक्रियाओं की स्थानिक प्रोफाइलिंग के लिए उत्तरदायी है। उदाहरण केलिए, दवा उपचार13, 36, 37, 38पर TME के भीतर प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विशिष्ट वर्गों, जैसे मैक्रोफेज या टी कोशिकाओं के पुनर्लोकीकरण और स्थानिक वितरण को मापना संभव है, और जांच करना कि क्या एक चिकित्सीय एजेंट "कोल्ड ट्यूमर" से "हॉट ट्यूमर"39 में संक्रमण का पक्ष ले सकता है . हाल के वर्षों में, इस समूह ने विभिन्न ट्यूमर प्रकारों (एनएससीएलसी, गुर्दे का कैंसर, स्तन कैंसर, कोलोरेक्टल कैंसर, मेलानोमा) और कीमोथेरपी, छोटे-अणु अवरोधकों और प्रतिरक्षा चेकपॉइंट अवरोधकों (ICIs) सहित एंटीकैंसर एजेंटों की एक श्रृंखला के परीक्षण से पीडीई के व्युत्पन्न पर ध्यान केंद्रित किया है। टीएमई के विभिन्न घटकों के लिए व्यवहार्यता के साथ-साथ बायोमार्कर के स्थानिक प्रोफाइलिंग की अनुमति देने के लिए मल्टीप्लेक्स्ड इम्यूनोफ्लोरेसेंस को शामिल करने के लिए एंडपॉइंट विश्लेषण विधियों को अनुकूलित किया गया है।
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Protocol
1. ऊतक संग्रह
- सर्जरी के बाद, ताजा संस्कृति माध्यम के 25 एमएल युक्त ट्यूब में ताजा पुनः प्राप्त मानव ट्यूमर नमूनों को स्थानांतरित करें (दुलबेको का संशोधित ईगल माध्यम 4.5 ग्राम/एल ग्लूकोज और एल-ग्लूटामाइन + 1% (v/v) भ्रूण बछड़े सीरम + 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक है और बर्फ पर संग्रहीत किया जाता है। एक बाँझ वर्ग द्वितीय हुड में सर्जरी के 2 घंटे के भीतर एक्सप्लांट प्रक्रिया।
2. ईxplant तैयारी
- 70% औद्योगिक मिथाइलेटेड स्पिरिट (आईएमएस) समाधान के साथ सभी सर्जिकल उपकरण (ग्राफ्ट ब्लेड/डेंटल वैक्स सरफेस/चिमटी) को साफ करें।
- ताजा माध्यम के ~ 25 एमएल के साथ एक 10 सेमी संस्कृति पकवान (सामग्रीकी मेज देखें) भरें, और इसे बर्फ के बिस्तर के शीर्ष पर रखें।
- चिमटी का उपयोग करना, एक दंत मोम की सतह पर नमूना हस्तांतरण (सामग्री की मेजदेखें), और लगभग 2-3 मिमी3 के टुकड़ों में दो त्वचा भ्रष्टाचार ब्लेड का उपयोग कर ऊतक टुकड़ा ।
नोट: सर्वश्रेष्ठ प्रदर्शन के लिए, ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया शुरू करने के लिए मोटाई के 2-3 मिमी की एक व्यक्तिगत पट्टी प्राप्त है, और फिर अंतिम explants प्राप्त करने के लिए लंबाई के साथ पट्टी में कटौती । इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि पूरा नमूना कटा न हो जाए। - एक्सप्लांट्स को 10 सेमी डिश में बर्फ-कोल्ड कल्चर मीडियम में तुरंत ट्रांसफर करें । एक्सप्लांट (6-9 टुकड़े) का अनुपात लें, उन्हें 1 एमएल ट्यूब में रखें जिसमें 10% गैर-बफर फॉर्मेलिन समाधान होता है, और 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर छोड़ दें।
नोट: ये टुकड़े "असंस्कारी" स्थिति के लिए नियंत्रण प्रत्यारोपण का प्रतिनिधित्व करेंगे। - 6-अच्छी प्लेटों के कुओं की वांछित संख्या को 1.5 एमएल ताजा माध्यम के साथ अच्छी तरह से भरें, और प्रत्येक कुएं में एक ऑर्गोटिपिक कल्चर डालें डिस्क (सामग्री की तालिकादेखें) रखें ताकि यह माध्यम के शीर्ष पर तैरता है, सावधानी से मीडिया-डालने वाले इंटरफ़ेस पर हवा के बुलबुले से बचें।
- बेतरतीब ढंग से एक्सप्लांट का चयन करें, और उन्हें डालने डिस्क के शीर्ष पर एक समय में एक रखें। "असंस्कारी" स्थिति के अनुरूप होने के लिए, प्रति अच्छी तरह से 6-9 एक्सप्लांट का उपयोग करें। मल्टीवेल प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर एक सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें, और एक्सप्लांट्स को 16 घंटे के लिए ठीक होने दें।
नोट: ऊतक को कुचलने से बचने के लिए, चिमटी की कोमल हैंडलिंग की अत्यधिक सिफारिश की जाती है।
3. दवा उपचार
- 16 घंटे के बाद, नई 6-अच्छी प्लेटें लें, प्रत्येक कुएं में 1.5 एमएल ताजा माध्यम जोड़ें, वांछित सांद्रता पर प्रासंगिक दवाओं को जोड़ें, और वाहन नियंत्रण के लिए एक अच्छी तरह से शामिल करें। चिमटी का उपयोग करना, दवाओं युक्त नए तैयार 6-अच्छी तरह से प्लेटों के लिए प्रत्येक डालने को स्थानांतरित करें। प्लेटों को सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और24-48 घंटे के लिए 5% सीओ 2 रखें।
- पहले फॉर्मेलिन में तय किए गए असंस्कारी एक्सप्लांट्स को हिस्टोलॉजी कैसेट में स्थानांतरित करें (नीचे धारा 4 देखें), और प्रयोग के अंत तक 70% आईएमएस में स्टोर करें।
4. हिस्टोलॉजिकल प्रोसेसिंग
- ऊतक निर्धारण
- दवा उपचार के बाद, 10% फॉर्मेलिन युक्त नई 6-अच्छी प्लेटों में एक्सप्लांट युक्त डालने वाले डिस्क को स्थानांतरित करें, और फिक्सेटिव के साथ पूर्ण कवरेज सुनिश्चित करने के लिए एक्सप्लांट के शीर्ष पर 10% फॉर्मलिन की कुछ बूंदें जोड़ें।
सावधानी: फॉर्मलिन खतरनाक है। त्वचा के साथ किसी भी संपर्क से बचें, और साँस लेना रोकने के लिए एक धुएं के भोजन के अंदर इसे संभालें। - एक्सप्लांट्स को 10% फॉर्मेलिन में रात भर (20-24 घंटे) रहने दें।
- अगले दिन, 70% आईएमएस में छोटे हिस्टोलॉजी स्पंज की प्रासंगिक संख्या सोख लें, और उन्हें हिस्टोलॉजी कैसेट के अंदर रखें। धीरे-धीरे सभी एक्सप्लांट्स को एक ही स्पंज पर एक दिए गए दवा उपचार की स्थिति से स्थानांतरित करें (एक्सप्लांट्स के अभिविन्यास को बनाए रखें ताकि डालने वाली डिस्क के संपर्क में एक्सप्लांट के पक्ष, और इसलिए दवा-उपचारित क्षेत्रों को स्पंज के संपर्क में रखा जाए)। एक्सप्लांट्स के शीर्ष पर एक और प्रीसोक्ड स्पंज रखें, और एक हिसटोलॉजी कैसेट (एक कैसेट प्रति अच्छी तरह से/
- 70% आईएमएस में कैसेट जलमग्न, और 24 घंटे के लिए आरटी पर छोड़ दें।
- दवा उपचार के बाद, 10% फॉर्मेलिन युक्त नई 6-अच्छी प्लेटों में एक्सप्लांट युक्त डालने वाले डिस्क को स्थानांतरित करें, और फिक्सेटिव के साथ पूर्ण कवरेज सुनिश्चित करने के लिए एक्सप्लांट के शीर्ष पर 10% फॉर्मलिन की कुछ बूंदें जोड़ें।
- पैराफिन एम्बेडिंग और ऊतक अनुभागन
- अगले दिन, टिश्यू प्रोसेसर के नमूना टोकरी में एक्सप्लांट युक्त हिसेटोलॉजी कैसेट स्थानांतरित करें (सामग्री की तालिकादेखें), और ढक्कन को सुरक्षित करें। टोकरी को रिटॉर्ट में रखें और धीरे-धीरे बंद करें। वांछित कार्यक्रम का चयन करें, और प्रोसेसर शुरू करें। रिटॉर्ट को छानलें, टोकरी को हटाने के लिए इसे खोलें, और टोकरी को एम्बेडिंग सेंटर वैक्स बाथ में स्थानांतरित करें।
- एम्बेड करने के बाद, धातु कैसेट ढक्कन को टोकरी में स्थानांतरित करें, और सफाई कार्यक्रम के लिए ऊतक प्रोसेसर के रिटॉर्ट पर लौटें। एक सूखे ऊतक के साथ सेंसर पोंछें, रिटॉर्ट ढक्कन से किसी भी अतिरिक्त मोम को हटा दें, और सफाई कार्यक्रम के साथ आगे बढ़ें।
- रोटरी माइक्रोटॉम में पैराफिन ब्लॉक की स्थिति, 4 माइक्रोन पर कुछ वर्गों को काटें, और ब्लॉक को बर्फ में वापस करें। ब्लॉक को फिर से स्थान दिया जा सकता है, और अधिक 4 माइक्रोन अनुभागों में कटौती करें। क्रीज और बुलबुले को हटाने के लिए एक छोटे से पेंट ब्रश के साथ वर्गों को स्थानांतरित करें और पानी के स्नान पर संदंश करें।
- माइक्रोस्कोप स्लाइड पर केंद्र में वर्गों की स्थिति, कुछ मिनट के लिए स्लाइड नाली, और उन्हें एक स्लाइड रैक में जगह के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में रात भर सूखी. जब अनुभाग सूखे हों, तो धूल से बचाने के लिए उन्हें स्लाइड फ़ोल्डर या बॉक्स में आरटी पर स्टोर करें।
5. हेमटॉक्सीलिन और ियोसिन (एचएंडई) धुंधला
- स्टेनर भरें (सामग्री की मेजदेखें) अभिकर्मकों के साथ, और एच एंड ई धुंधला के लिए आवश्यक कार्यक्रम सेट: हेमेटॉक्सीलिन इनक्यूबेशन समय: 5 मिनट; इनक्यूबेशन समय इओसिन: 3 मिनट।
- वाहक के लिए स्लाइड रैक संलग्न करें, यह जाइलीन के साथ पहले कंटेनर में जगह है, और कार्यक्रम शुरू करते हैं । रैक से स्लाइड वाहक निकालें, और बढ़ते क्षेत्र के लिए स्लाइड रैक के साथ कंटेनर ले लो।
- निष्कर्षण हुड के तहत डिब्यूटिल थैलेट जाइलीन (डीपीएक्स) के साथ स्लाइड्स माउंट करें। प्रत्येक कवरस्लिप पर डीपीएक्स रखें, और स्लाइड को नीचे की ओर अनुभाग के साथ कवरस्लिप पर कम करें, जिससे डीपीएक्स फैल सके।
नोट: DPX खतरनाक है । त्वचा के साथ किसी भी संपर्क से बचें और एक नामित धुएं हुड में उपयोग करें।
6. इम्यूनोदाता
नोट: निम्नलिखित कदम आरटी में किए जाने चाहिए जब तक कि अन्यथा नहीं कहा जाए।
- डिपैराफिनाइजेशन और रिहाइड्रेशन
- स्लाइड्स को स्लाइड रैक में रखें, और 3 मिनट (2x) के लिए जाइलीन में अनुभागों को डिपैराफिन करने से पहले 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी करें। कैरी-ओवर समाधान की मात्रा को कम से कम करें।
नोट: जाइलीन ज्वलनशील, खतरनाक और अड़चन है। डबल-स्तरित दस्ताने का उपयोग करते हुए धूम हुड के अंदर संभालें। त्वचा और आंखों के संपर्क से बचें। एक सीलबंद कंटेनर के भीतर कचरे का निपटान करें। - स्लाइड्स को अल्कोहल रेडिएंट में रीहाइड्रेट करें इस प्रकार: 1 मिनट (2x) के लिए 99% आईएमएस और 1 मिनट के लिए 95% आईएमएस। कैरी-ओवर समाधान की मात्रा को कम से कम करें।
नोट: आईएमएस अत्यधिक ज्वलनशील, अस्थिर और अड़चन है। धूम हुड के अंदर संभालें, और त्वचा और आंखों के संपर्क से बचें। - पूरी तरह से 5 मिनट के लिए अल्ट्रापुरे (यूपी) पानी में स्लाइड रैक जलमग्न ।
- स्लाइड्स को स्लाइड रैक में रखें, और 3 मिनट (2x) के लिए जाइलीन में अनुभागों को डिपैराफिन करने से पहले 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी करें। कैरी-ओवर समाधान की मात्रा को कम से कम करें।
- एंटीजन पुनर्प्राप्ति
- इस्तेमाल किए गए विशेष एंटीबॉडी के लिए निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार एंटीजन रिट्रीवल बफर तैयार करें।
नोट: सिट्रेट बफर 0.2 एम, पीएच 6, या ट्राइस(हाइड्रोक्सीमिथाइल) अमीनोमेथेन (ट्रिस) -एथिलेंडियामाइन टेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) 0.1 एम, पीएच 9, क्रमशः अम्लीय या क्षारीय स्थितियों के लिए उपयोग किए जाने वाले आम बफर हैं। साइट्रिक एसिड मोनोहाइड्रेट और ट्रिस परेशान एजेंट हैं। धूम हुड में सभी स्टॉक समाधान तैयार करें। त्वचा और आंखों के संपर्क से बचें। - एंटीजन रिट्रीवल बफर में स्लाइड युक्त रैक जलमग्न, और माइक्रोवेव (सामग्री की मेजदेखें) पूर्ण शक्ति पर (८०० डब्ल्यू) 20 मिनट के लिए ।
नोट: स्लाइड पूरी प्रक्रिया के दौरान बफर में पूरी तरह से डूबे रखें । बफर वॉल्यूम की अत्यधिक कमी से बचने के लिए, उपयोग किए गए कंटेनर के शीर्ष पर ढक्कन रखें।
- इस्तेमाल किए गए विशेष एंटीबॉडी के लिए निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार एंटीजन रिट्रीवल बफर तैयार करें।
- मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस (एमआईएफ)
नोट: इस प्रक्रिया में 1-2 दिन लगते हैं।- यूपी के 250 एमएल पानी के साथ एक साफ कंटेनर भरें, और 2 मिनट (2x) के लिए स्लाइड रैक को पूरी तरह से जलमग्न कर दें। प्रत्येक स्लाइड को स्लाइड कवरप्लेट में इकट्ठा करने के साथ आगे बढ़ें (सामग्री की तालिकादेखें)।
- एक कवरप्लेट पर एक स्लाइड इकट्ठा करने के लिए, पानी के साथ एक गिलास गर्त तैयार करें। कवरप्लेट और स्लाइड दोनों को पानी में जलमग्न करें, टिश्यू सेक्शन साइड को कवरप्लेट का सामना करते हुए रखें।
- कवरप्लेट के नीचे प्रोट्यूबेंस के शीर्ष पर स्लाइड के निचले किनारे की स्थिति रखें, और अंत में स्लाइड को कवरप्लेट में संरेखित करें, जिससे पानी को बीच में गैप भरने की अनुमति मिलती है जिसमें कोई हवा फंस नहीं जाती है। कवरप्लेट पकड़ें और एक साथ स्लाइड करें, और उन्हें एक कवरप्लेट रैक में रखें।
- फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ कवरप्लेट भरें, और गुरुत्वाकर्षण (2x) द्वारा बहने वाले स्लाइड्स को धोने के लिए बफर की प्रतीक्षा करें। प्रत्येक कवरप्लेट पर बफर को अवरुद्ध करने के पिपेट 110 माइक्रोन (सामग्री की तालिकादेखें) और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- निर्माता की सिफारिशों के अनुसार पीबीएस या ब्लॉकिंग बफर में वांछित प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने की तैयारी करें। 30 मिनट के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी (110 μL प्रत्येक स्लाइड) के साथ स्लाइड को इनक्यूबेट करें। 6.3.2 में वर्णित पीबीएस (2x) के 5 एमएल के साथ स्लाइड्स धोएं।
- 30 मिनट के लिए सहिजन पेरोक्सिडास बहुलक के ११० माइक्रोन के साथ स्लाइड्स इनक्यूबेट । 6.3.2 में वर्णित पीबीएस (2x) के 5 एमएल के साथ स्लाइड्स धोएं।
- प्रवर्धन मंद 1:100 (v/v) में फ्लोरोफोर कमजोर पड़ने की तैयारी करें, और 10 मिनट के लिए फ्लोरोफोर (110 माइक्रोन प्रत्येक स्लाइड) के साथ स्लाइड को इनक्यूबेट करें। 6.3.2 में वर्णित पीबीएस (2x) के 5 एमएल के साथ स्लाइड्स धोएं।
नोट: फ्लोरोफोर 780 के उपयोग के लिए, निर्माता के दिशानिर्देशों का पालन करें। प्रयोग यहां रुका जा सकता है अगर स्लाइड पीबीएस के अंतिम धोने में इनक्यूबेटेड और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर संग्रहीत कर रहे हैं । - कवरप्लेट से स्लाइड को अनक्लिप करें, और एक अलग एंटीबॉडी के साथ धुंधला शुरू करने के लिए एंटीजन पुनर्प्राप्ति चरण पर वापस जाएं। परीक्षण किए जाने वाले एंटीबॉडी की वांछित संख्या के लिए धुंधला दोहराएं।
- उपयोग में पिछले फ्लोरोफोर के लिए चरण 6.3.5 के बाद, कवरप्लेट पर स्लाइड रखें, 4'-6-डायमिडिनो-2-फेनीलिंडलोल (DAPI) के 6 माइक्रोन घोल को तैयार करें, और 5 मिनट (110 माइक्रोन प्रत्येक स्लाइड) के लिए स्लाइड्स को काउंटरटेन करें। स्लाइड्स में देखें यूपी के पानी (2x) से धोएं और स्लाइड्स के किनारों को सुखाने से अतिरिक्त पानी निकालें। बढ़ते माध्यम का उपयोग करके स्लाइड्स पर कवरस्लिप को इकट्ठा करें, और अंधेरे में आरटी पर स्टोर करें।
- यूपी के 250 एमएल पानी के साथ एक साफ कंटेनर भरें, और 2 मिनट (2x) के लिए स्लाइड रैक को पूरी तरह से जलमग्न कर दें। प्रत्येक स्लाइड को स्लाइड कवरप्लेट में इकट्ठा करने के साथ आगे बढ़ें (सामग्री की तालिकादेखें)।
7. स्कैनिंग
नोट: स्लाइड स्कैनिंग एक मल्टीस्पेक्ट्रल स्वचालित इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके किया गया था (सामग्री की तालिकादेखें)।
- वाहक में स्लाइड इकट्ठा, और वांछित क्रम में स्कैनर में उन्हें लोड।
नोट: यह सिफारिश की जाती है कि एक नियंत्रण स्लाइड को शामिल किया जाए जिसमें इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला होने के दौरान कोई फ्लोरोफोर या डीएपीआई का उपयोग नहीं किया जाता है। इस स्लाइड का उपयोग ऊतक के आंतरिक फ्लोरेसेंस (ऑटोफ्लोरेसेंस (एएफ)) के नियंत्रण के रूप में किया जाएगा। - स्लाइड स्कैनर सॉफ्टवेयर लॉन्च करने के बाद होम पेज से एडिट प्रोटोकॉल चुनें। नाम, इमेजिंग मोड, मल्टीस्पेक्ट्रल स्कैन के प्रकार (4-7 चैनल)और अध्ययन(निर्देशिका)को संबोधित करते हुए एक नया प्रोटोकॉल बनाएं।
नोट: विश्लेषण किए गए बैंड की डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स को संशोधित करने के लिए, फ़ंक्शन का चयन स्कैन बैंड का उपयोग करके वांछित फ़िल्टर का चयन करें/चयन करें - स्कैन एक्सपोजर और लोड कैरियरके साथ आगे बढ़ें, और अंत में प्रोटोकॉल सेटअप के लिए वाहक का चयन करें। स्लाइड पर ऊतक का पता लगाने के लिए अवलोकन करें चुनें। वाहकपर प्रदर्शित स्लाइड चुनें, और स्क्रीन की बाईं खिड़की पर लाइव दृश्य में लाने के लिए लाल कर्सर के साथ ऊतक के एक विशिष्ट क्षेत्र का चयन करें।
- DAPI फ़िल्टरका चयन करें, और ऑटोफोकस पर क्लिक करें या रुचि के क्षेत्र को ध्यान केंद्रित करने के लिए स्टेज हाइट स्लाइडर को मैन्युअल रूप से समायोजित करें। ऑटोएक्सपोज़ पर क्लिक करें सिस्टम को उस फ़िल्टर/बैंड के लिए सबसे अच्छा एक्सपोजर खोजने की अनुमति देने के लिए।
नोट: प्रत्येक फ़िल्टर के लिए एक्सपोजर समय 12 एमएस पर सेट किया गया है। सिस्टम को ऑटोएक्सपोज करने के बाद, एक्सपोजर समय को बेहतर अनुमान के साथ परिष्कृत करें। हाइलाइट किए गए सेल में मैन्युअल रूप से मूल्य टाइप करके ऑटोएक्सपोजर मूल्य को ओवरराइड करना भी संभव है। - प्रोटोकॉल में सभी फ़िल्टर के लिए उपरोक्त चरणों को दोहराएं। यदि आवश्यक हो, तो एक्सपोजर सेट करने के लिए सबसे अच्छे संकेतों को खोजने के लिए स्थानों और/या स्लाइड को बदलें ।
नोट: यदि ऊतक को लाइव दृश्य में लाल रंग में हाइलाइट किया जाता है, तो विश्लेषण किए गए फ़िल्टर का फ्लोरोसेंट सिग्नल संतृप्त होता है, और ऑटोएक्सपोजर को दोहराया जाना चाहिए। - एक बार एक्सपोजर सेटिंग्स स्थापित हो जाने के बाद, बैक बटन पर क्लिक करें, और प्रोटोकॉल को सहेजें। सॉफ्टवेयर होम पेज से (सामग्री की तालिकादेखें), स्कैन स्लाइडका चयन करें ।
- स्लाइड कैरियर होटल में स्कैन करने के लिए सभी वाहकोंको ढेर करें, और सिस्टम में अपनी आईडी असाइन करने के लिए स्लाइड के आदेश पर ध्यान दें।
नोट: सॉफ्टवेयर स्क्रीन पर, प्रत्येक वाहक 4 स्लाइड वाले स्लॉट से संबंधित होगा। - एक ही पैरामीटर के साथ कई स्लाइड्स को कॉन्फ़िगर करने के लिए, कॉन्फिग्योर टास्कपर क्लिक करें, और विकल्प यूके साथ एक या अधिक स्लॉट का चयनकरें एक ही स्लाइड के लिए एक ही नियम गाते हैं। एक बार एडिट स्लाइड्स खुलते ही कॉन्फ़िगर करें: कार्य, अध्ययनऔर प्रोटोकॉल,और ओकेपर क्लिक करें ।
- स्लॉट आइकन पर क्लिक करके प्रत्येक स्लाइड को लेबल करें, और स्लाइड आईडी सेल में एक नाम टाइप करें। स्कैनिंग शुरू करने के लिए स्कैन पर क्लिक करें।
नोट: एक बार स्लॉट आइकन नीला हो जाता है और स्लाइड एक नीले तीर के साथ चिह्नित कर रहे हैं, वाहक सभी नियम है और स्कैन करने के लिए तैयार है । सेव सेटअप बटन पर क्लिक करके स्लाइड की पढ़ाई, पढ़ाई, प्रोटोकॉल और कार्यों को सहेजना संभव है।
8. विश्लेषण
नोट: नीचे दिए गए प्रोटोकॉल फेनोटाइप विश्लेषण के लिए विधि दिखाता है।
- छवि की तैयारी
- विश्लेषण के लिए छवियों को तैयार करने के लिए, दर्शक सॉफ्टवेयर खोलें (सामग्री की तालिकादेखें), और लोड स्लाइडका चयन करें। स्क्रीन के दाहिने हाथ की ओर प्रशिक्षण परियोजना के लिए वांछित स्कैन का चयन करें।
- प्रत्येक स्कैन के लिए, स्टैंपपर क्लिक करें, और बॉक्स में प्रोजेक्ट चुनें चुनें: प्रशिक्षण विश्लेषण के लिए बाद में टेम्पलेट के रूप में उपयोग किए जाने वाले छवि क्षेत्र में आकार 1 x 1 के साथ एक स्टैंप को परिभाषित करें। गौर करें कि इस स्टैंप को लाल चौक के रूप में चिह्नित किया जाएगा।
नोट: परियोजना के लिए स्टांप एनोटेशन की संख्या मनमाना है। आंतरिक फ्लोरेसेंस स्कैन के लिए एक उत्पन्न करने की सिफारिश की जाती है और कुछ और जो आम तौर पर ऊतक के भीतर सिग्नल वितरण के प्रतिनिधि होते हैं। - अंत में, प्रयोग के सभी स्कैन खोलें। हर एक के लिए, स्टांपपर क्लिक करें, और इस बार, बॉक्स में विकल्प बैच चुनें के लिए चुनें: प्रत्येक एक्सप्लांट को दरकिनार करने वाला स्टैंप रखें।
नोट: इस बार, टिकटों को हरे वर्गों के रूप में चिह्नित किया जाएगा और बैच विश्लेषण शुरू होने के बाद इसकी आवश्यकता होगी। टिकटों (1 x 1, 2 x 2, 3 x 3) के लिए उपयुक्त आकार चुनें और टिकटों के ओवरलैपिंग से बचें, जो निर्यात की गई फ़ाइल में डुप्लिकेट डेटा उत्पन्न करेगा।
- प्रशिक्षण विश्लेषण
- विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर लॉन्च करें (सामग्री की तालिकादेखें), और एक नई परियोजना बनाएं: फ़ाइल | का चयन करें नई | परियोजना।
- प्रोजेक्ट नाम बॉक्स में एक नाम टाइप करें, और परियोजना के प्रकारको कॉन्फ़िगर करें।
नोट: प्रयोग निम्नलिखित विनिर्देशों का उपयोग करके किए गए थे: प्रशिक्षित ऊतक विभाजन; अनुकूली सेल विभाजन; फेनोटाइपिंग। - प्रशिक्षण के लिए टिकटों युक्त स्कैन लोड करें: फाइल | ओपन | छवि। एकल मोड दृश्यमें, छवियों के माध्यम से नेविगेट करें और आंतरिक फ्लोरेसेंस के साथ स्कैन का चयन करें।
- ऑटोफ्लोरेसेंस (एएफ) बटन पर क्लिक करें, और ऑटोफ्लोरेसेंस पिकरके साथ, ऊतक के एक अन दाग भाग पर आकर्षित करें। सॉफ्टवेयर को प्रशिक्षण के लिए अपलोड की गई सभी छवियों से आंतरिक फ्लोरेसेंस की तीव्रता को घटाने की अनुमति देने के लिए तैयार छवियों पर क्लिक करें।
- संपादित मार्कर और रंग बटन पर क्लिक करें, और उनके फ्लोरोफोर के साथ जुड़े बॉक्स में मार्कर नाम दर्ज करें । टिश्यू सेगमेंटेशन ट्रेनिंग विंडो खोलने के लिए स्क्रीन के टॉप पर सेगमेंट टिश्यू स्टेप पर क्लिक करें ।
- ऊतक श्रेणियों की खिड़की में, छवियों को सेगमेंट करने के लिए ऊतक श्रेणियों के नाम पर टाइप करें (उदाहरण के लिए, ट्यूमर, स्ट्रोमा, बैकग्राउंड, नेक्रोसिस)।
- ऊतक विभाजन प्रशिक्षण खिड़की में, ड्रा बटन पर क्लिक करें और रुचि की एक ऊतक श्रेणी को परिभाषित करने के लिए कोशिकाओं के समूहों के आसपास क्षेत्रों को आकर्षित करें । उदाहरण के लिए, ट्यूमर क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए, ट्यूमर कोशिकाओं के एक समूह के आसपास एक क्षेत्र आकर्षित करें। अगली श्रेणी में स्विच करें और ड्राइंग प्रक्रिया दोहराएं।
नोट: प्रशिक्षण के लिए अपलोड की गई अधिकांश छवियों में क्षेत्रों को आकर्षित करने की सिफारिश की जाती है। पैटर्न स्केल और सेगमेंटेशन रिज़ॉल्यूशन को संपादित करके प्रशिक्षण को परिष्कृत करना भी संभव है जिसका विवरण उपयोगकर्ता मैनुअल में बेहतर वर्णित है। - प्रशिक्षण क्षेत्रों को परिभाषित करने के बाद, टिशू सेगमेंटर को प्रशिक्षित करने केसाथ आगे बढ़ें।
नोट: प्रशिक्षण की प्रक्रिया के दौरान, सॉफ्टवेयर ऊतक विभाजन की सटीकता का प्रतिशत प्रदर्शित करता है। इष्टतम परिणामों के लिए, यह सिफारिश की जाती है कि ऊतक विभाजन कम से कम 90% सटीक हो। एक बार सेगमेंटर स्थिर हो जाने के बाद, किए गए बटन पर क्लिक करें। - सभी छवियों पर ऊतक श्रेणी मास्क देखने के लिए, सेगमेंट ऑल बटन पर क्लिक करें।
- ऊतक विभाजन की गुणवत्ता की पुष्टि करने के बाद, उन क्षेत्रों के आसपास के प्रशिक्षण क्षेत्रों को फिर से आकर्षित करें जिन्हें गलत तरीके से वर्गीकृत किया गया था, और प्रक्रिया सफल होने तक ऊतक सेगमेंटर को फिर से प्रशिक्षित करें।
- विश्लेषण के साथ आगे बढ़ने के लिए विंडो के शीर्ष पर स्टेप बार में सेल सेगमेंटेशन स्टेप पर क्लिक करें।
- सेलुलर डिब्बों को सेगमेंट में चुनें: नाभिक, साइटोप्लाज्म,और/या झिल्ली।
नोट: अनुकूली सेल विभाजन के रूप में केवल परमाणु संकेत के साथ कोशिकाओं का पता लगा सकते हैं, परमाणु काचयन नहीं है । हालांकि साइटोप्लाज्म और/या झिल्ली को सेगमेंट करना भी संभव है, लेकिन पहले सबसे मजबूत, सबसे प्रचुर मात्रा में परमाणु घटक (जैसे, DAPI) चुनने की सिफारिश की जाती है। - परमाणु पिक्सल का पता लगाने के लिए उपयोग की जाने वाली सीमा को समायोजित करने के लिए विशिष्ट तीव्रता स्लाइडर का उपयोग करके परमाणु घटक को कॉन्फ़िगर करें। सीमा समायोजित होने के साथ ही लाइव फीडबैक प्रदान करने वाली पूर्वावलोकन विंडो पर ध्यान दें।
नोट: यह सीमा अनुकूली है और आसपास की पृष्ठभूमि के सापेक्ष मापा जाता है । यदि बहुत अधिक पृष्ठभूमि परमाणु के रूप में पता चला है तो इस मूल्य को बढ़ाएं। यदि बेहोश नाभिक को याद किया जा रहा है तो इस मूल्य को कम करें। पर और बंद विभाजन मास्क पलक करने के लिए शो/खाल क्षेत्र बटन का उपयोग करें, और जांच करें कि क्या सही पिक्सल परमाणु के रूप में पता लगाया जा रहा है । - परमाणु पिक्सल के समूहों को विभाजित करने के लिए, परमाणु घटक बंटवारे पैनल का उपयोग करें। बटन चुनें जो नाभिक की धुंधला गुणवत्ता का सबसे अच्छा वर्णन करता है। फिर, विभाजन संवेदनशीलता को समायोजित करने के लिए स्लाइडर बार का उपयोग करें, यह ध्यान में रखतेहुए कि कम मूल्यों के परिणामस्वरूप अधिक विभाजन होगा।
- सभी छवियों को सेगमेंट करने के लिए सेगमेंट ऑल बटन पर क्लिक करें। यदि परिणाम सटीक नहीं है, तो सेटिंग्स को संशोधित करें और एक संतोषजनक विभाजन प्राप्त होने तक सॉफ्टवेयर को फिर से प्रशिक्षित करें।
- विश्लेषण के अंतिम चरण पर आगे बढ़ें: फेनोटाइपिंग। फेनोटाइप्स पैनल में, पता लगाने के लिए फेनोटाइप की सूची जोड़ें, और संबंधित टेक्स्ट बॉक्स में नाम टाइप करें। एडिट फेनोटाइप्स बटन पर क्लिक करें, ड्रॉपडाउन मेनू लाने के लिए एक विशेष सेल का चयन करें, और इसी फेनोटाइप का चयन करें।
नोट: क्लासिफायर को प्रशिक्षित करने के लिए प्रत्येक फेनोटाइप के लिए कम से कम पांच कोशिकाएं आवश्यक हैं। नाभिक के दृश्य को बंद करने से सेल फेनोटाइप के बेहतर दृश्य की अनुमति देता है जिसे सौंपे जाने की आवश्यकता है। - एक बार प्रशिक्षण के लिए चयन पूरा हो गया है, ट्रेन क्लासिफायर बटन पर क्लिक करें ।
नोट: सॉफ्टवेयर छवि में हर एक सेल को वर्गीकृत करेगा, और जब भी वर्गीकरण में त्रुटियां होती हैं, कोशिकाओं के फेनोटाइप को संपादित करना और क्लासिफायर के प्रशिक्षण को दोहराना संभव है। बैच विश्लेषण के लिए आगे बढ़ने से पहले परियोजना को सहेजें, और स्क्रीन के शीर्ष पर टूल बार में निर्यात पर क्लिक करें। - बाएं मेनू पर बाथ एनालिसिस टैब चुनें, और बैच एल्गोरिदम या प्रोजेक्ट बॉक्स में परियोजना लोड करें।
- प्रत्येक छवि के लिए अलग निर्देशिका बनाने के लिए निर्यात विकल्पों पर क्लिक करें, और ब्राउज़ बटन के साथ, डेटा निर्यात करने के लिए स्थान खोजने के लिए नेविगेट करें। निर्यात करने के लिए छवियों और तालिकाओं के सभी विकल्पों पर क्लिक करें।
- स्क्रीन के दाईं ओर, ऐड स्लाइड्स पर क्लिक करें और पहले से तैयार बैचों (चरण 7.3) के लिए टिकटों वाली सभी छवियों को लोड करें। बैच विश्लेषण शुरू करने और एक समय में एक स्टांप प्रक्रिया, इसी डेटा का निर्यात करने के लिए रन बटन पर क्लिक करें ।
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Representative Results
एमआईएफ-दाग हिस्टोलॉजिकल सेक्शन की मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग अलग-अलग सेल आबादी की पहचान और फेनोटाइपिंग और एक्सप्लांट टीएमई(चित्रा 2)में ट्यूमर और स्ट्रोमल घटकों की पहचान की अनुमति देती है। मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग उच्च आंतरिक ऑटोफ्लोरेसेंस वाले ऊतकों के विश्लेषण के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, जैसे कि उच्च कोलेजन सामग्री वाले ऊतक, क्योंकि यह ऑटोफ्लोरेसेंस सिग्नल को अन्य संकेतों से विघटित करने और बाद के विश्लेषण से बाहर रखने की अनुमति देता है। सिलिको ऊतक और सेल विभाजन में बाद में आउटपुट की एक भीड़ के साथ दवा प्रतिक्रिया की मात्रा की अनुमति देता है, लेकिन सीमित नहीं, कच्चे सेल संख्या (जैसे, प्रतिशत सकारात्मकता), संकेत तीव्रता, सेल आकार, ऊतक क्षेत्र, और व्यक्तिगत कोशिकाओं के स्थानिक स्थान ।
ऊतक और सेल विभाजन इसलिए दवा उपचार परिणामों के मात्रात्मक विश्लेषण और ट्यूमर की पहचान और स्ट्रोमल-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं के लिए बेहद उपयोगी हैं। उदाहरण के लिए, ट्यूमर मार्कर के साथ Ki67 और cPARP के लिए धुंधला प्रसार और सेल मृत्यु के स्तर के मात्रा के लिए क्रमशः, एक्सप्लांट्स(चित्रा 3)में अनुमति देता है। दिए गए उदाहरण में, पीडीईएस में स्ट्रोमल और ट्यूमर क्षेत्रों के लिए एंटी-प्रोग्राम सेल डेथ प्रोटीन 1 (पीडी-1) प्रतिरक्षा चेकपॉइंट अवरोधक (आईसीआई), निवोलुमाब के जवाब में Ki67 और cPARP का स्तर निर्धारित किया गया है। इसके अलावा, दाग वर्गों से स्थानिक जानकारी निकालने की क्षमता इंटरसेल दूरी की गणना के साथ-साथ ट्यूमर सीमाओं और अन्य संरचनाओं के लिए दूरी की अनुमति देती है। इसलिए, दवा उपचार के बाद सेलुलर वितरण में परिवर्तन मात्रात्मक रूप से विश्लेषण किया जासकता है (चित्र 4)। दिखाया गया उदाहरण निवोलुमाब के साथ पीडीई उपचार का प्रतिनिधित्व करता है।
चित्र 1:पीडीई की पीढ़ी और विश्लेषण के लिए कार्यप्रवाह। (ए)हौसले से पुनः प्राप्त मानव ट्यूमर नमूनों को संसाधित किया जाता है और संस्कृति माध्यम में तैरते डिस्क को पार करने योग्य संस्कृति पर व्यवस्थित किया जाता है। (ख)दवा उपचार के बाद, एक्सप्लांट काटा जाता है, एफएफएपी के अधीन होता है, और फिर एचएंडई धुंधला होने के लिए हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए अनुभागित किया जाता है। (ग)एमआईएफ स्टेनिंग और ऊतक वर्गों की स्कैनिंग बहुस्पेक्ट्रल छवियों को उत्पन्न करने के लिए की जाती है जिनसे व्यक्तिगत संकेतों को अलग-अलग विश्लेषण और विश्लेषण किया जा सकता है। (घ)समग्र छवियों का विश्लेषण ट्यूमर और स्ट्रोमल क्षेत्रों के पृथक्करण और विभिन्न कोशिका प्रकारों के फेनोटाइप के आकलन की अनुमति देता है । संक्षिप्त जानकारी: PDE = रोगी-व्युत्पन्न एक्सप्लांट; एफएफएपी = फॉर्मेलिन में तय, पैराफिन में एम्बेडेड; एच एंड ई = हेमटॉक्सीलिन और ियोसिन; mIF = मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस; एचआरपी = सहिजन पेरोक्सिडास; एच2ओ2 = हाइड्रोजन पेरोक्साइड; एबी = एंटीबॉडी; TSA = tyramide संकेत प्रवर्धन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2:एक mIF-दाग ऊतक अनुभाग का उदाहरण। एनएससीएलसी एक्सप्लांट ऊतक को नाभिक को चिह्नित करने के लिए सेल व्यवहार्यता के मार्कर के लिए दाग दिया गया था, अर्थात्, सीपीआरपी (लाल) और Ki67 (हरा) के साथ-साथ एक पैन-साइटोकेराटिन मार्कर (पीला) और DAPI (नीला) । फ्लोरोसेंट संकेतों को डिकोवोल्यूट करने और ऑटोफ्लोरेसेंस को हटाने के लिए मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग का प्रदर्शन किया गया था। छवियां चयनित क्षेत्र का 20x आवर्धन दिखाती हैं। स्केल बार = 50 माइक्रोन। संक्षिप्त: mIF = मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस; एनएससीएलसी = गैर-छोटे सेल फेफड़ों का कैंसर; cPARP = क्लीवेड पॉली-एडीपी रिबोज पॉलीमरेज; CK = साइटोकेराटिन; DAPI = 4'-6-diamidino-2-फेनीलिंडोल; वायु सेना = ऑटोफ्लोरेसेंस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3:पीडीई में सेल मृत्यु और प्रसार का परिमाणीकरण। मध्यम नियंत्रण की तुलना में 5 μg/mL nivolumab के साथ उपचार के 24 घंटे के बाद एनएससीएलसी पीडीई में एपोप्टोसिस प्रेरण दिखाने वाले बॉक्स और मूंछ भूखंडों का उदाहरण । प्रसार का प्रतिशत (Ki67) और एपोप्टिक सेल डेथ (सीपीआरपी) घटनाओं का प्रतिशत क्रमशः ट्यूमर क्षेत्र और स्ट्रोमा में प्रदर्शित होता है। प्रत्येक बिंदु एक ही एक्सप्लांट का प्रतिनिधित्व करता है, बॉक्स की केंद्रीय लाइन वितरण के औसत का प्रतिनिधित्व करती है, और बॉक्स (नीचे और शीर्ष) के पक्ष क्रमशः पहले और तीसरे क्वार्टाइल्स का प्रतिनिधित्व करते हैं। त्रुटि सलाखों इंटरक्वार्टिकल रेंज (1.5 x IQR से आगे) का प्रतिनिधित्व करते हैं। संक्षिप्त जानकारी: PDE = रोगी-व्युत्पन्न एक्सप्लांट; एनएससीएलसी = गैर-छोटे सेल फेफड़ों का कैंसर; cPARP = क्लीवेड पॉली-एडीपी रिबोज पॉलीमरेज; आईक्यूआर = इंटरक्वार्टिकल रेंज। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4:दवा उपचार के बाद स्थानिक संगठन । (A)प्रतिनिधि छवियां टी सेल मार्कर-सीडी 4, FOXP3, सीडी 8 (बाएं पैनल) के mIF धुंधला दिखा-एक मेलानोमा एक्सप्लांट पर प्रदर्शन किया, और इसी फेनोटाइप विश्लेषण (दाएं) CD8 + कोशिकाओं और Treg कोशिकाओं के बीच अंतरसेल दूरी की पहचान (CD4 +/FOXP3 +) । स्केल बार = 200 माइक्रोन.(बी)हिस्टोग्राम प्लॉट साइटोटॉक्सिक टी कोशिकाओं (सीडी 8 +) और ट्रेग कोशिकाओं (सीडी 4 +/FOXP3+) के बीच बढ़ी हुई दूरी दिखा रहा है। घनत्व इकाई को बैंडविड्थ प्रति सभी कोशिकाओं के योग से विभाजित कोशिकाओं की संख्या के रूप में व्यक्त किया जाता है। संक्षिप्त: mIF = मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस; सीडी = भेदभाव का क्लस्टर; FOXP3 = फोर्कहेड बॉक्स P3; PDE = रोगी-व्युत्पन्न एक्सप्लांट; एनएससीएलसी = गैर-छोटे सेल फेफड़ों का कैंसर; आईओ = इम्यूनो ऑन्कोलॉजी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
यह पेपर पीडीई के उत्पादन, दवा उपचार और विश्लेषण के तरीकों का वर्णन करता है और मंच के फायदों को एक प्रीक्लिनिकल मॉडल सिस्टम के रूप में उजागर करता है। एक हौसले से पुनः प्राप्त ट्यूमर की पूर्व वीवो संस्कृति, जिसमें इसका डिकंस्ट्रक्शन शामिल नहीं है, ट्यूमर वास्तुकला13,24 की अवधारण के लिए अनुमति देता है और इस प्रकार, टीएमई में सेलुलर घटकों के स्थानिक इंटरैक्शन के साथ-साथ इंट्राट्यूमरल विषमता। यह विधि दर्शाती है कि कैसे, ट्यूमर-विशिष्ट मार्कर का उपयोग करके, स्ट्रोमा के क्षेत्रों बनाम ट्यूमर ऊतक के क्षेत्रों की पहचान करना संभव है और इसलिए इन डिब्बों(चित्रा 3)के भीतर अलग दवा प्रतिक्रियाएं। इसके अतिरिक्त, कई बायोमार्कर का आकलन करने के लिए एक साथ प्रोफाइल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, TME(चित्रा 4)के भीतर प्रतिरक्षा कोशिकाओं के ऑन-टारगेट आंदोलन।
एक पिछले प्रकाशन ने इस पीडीई प्लेटफॉर्म के आवेदन को देखभाल कीमोथेरेपी, सिस्प्लैटिन के मानक के लिए एनएससीएलसी पीडीई के स्तरीकरण के लिए प्रलेखित किया, जिसमें यह दर्शाया गया है कि केमोसेंसिटिवआबादी 24से केमोरिस्ट को अलग करना संभव है। ये PDE से संबंधित निष्कर्ष रोगी प्रतिक्रियाओं दर्पण । यहां वर्णित तरीकों का पालन करके, अन्य ट्यूमर प्रकारों के लिए और विभिन्न प्रकार की दवाओं, कीमोथेरेटिक्स या अन्यथा के साथ समान दृष्टिकोण शुरू करना संभव है। पीडीई को दवा के प्रति संवेदनशील और नशीली दवाओं के प्रतिरोधी आबादी में अलग करना दवा प्रतिरोध में और अधिक मशीनी अंतर्दृष्टि पैदा करने के लिए एक अमूल्य संसाधन बनाता है । उदाहरण के लिए, चूंकि पीडीई को आरएनए, डीएनए, प्रोटीन या मेटाबोलाइट अलगाव के लिए संसाधित किया जा सकता है, इसलिए यह प्रतिक्रिया के भविष्य कहने वाले प्रमुख बायोमार्कर की पहचान करने के लिए "ओमिक" प्रौद्योगिकियों के कार्यान्वयन की अनुमति दे सकता है। वैकल्पिक रूप से, इलाज पीडीई से उत्पन्न एफएफएपी वर्गों का उपयोग व्यापक स्थानिक प्रोफाइलिंग के लिए किया जा सकता है ताकि यह समझा जा सके कि पीडीई में विभिन्न सेल प्रकार दवा प्रतिरोध में कैसे योगदान देते हैं।
यह मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग और मास साइटोमेट्रीदृष्टिकोण35,40, 41, 42,43में आगे की घटनाओं से सुविधाजनक हो सकता है, जो सैकड़ों बायोमार्कर को एक साथ प्रोफाइल करने की अनुमतिदेगा। इम्यूनोथेरपीटिक प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने वाले प्रीक्लिनिकल मॉडल बहुत अधिक मांगे जाते हैं, और यह पेपर दर्शाता है कि पीडीई इस महत्वपूर्ण जगह(चित्र 3 और चित्रा 4)को भर सकता है। रोग चौकियों को लक्षित करने वाले मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, जैसे साइटोटॉक्सिक टी-लिम्फोसाइट एंटीजन 4 और पीडी-1/प्रोग्राम डे डेथ लिगांड-1 (पीडी-एल 1), को मानक कीमोथेरेपी की तुलना में बड़ी संख्या में ठोस ट्यूमर में समग्ररोगी अस्तित्व में कुछ उल्लेखनीय सुधार के साथ44, 45,46,47 विकसित किया गया है। हालांकि, आईसीएस उन कारणों के लिए सीमित संख्या में रोगियों में प्रभावी हैं जो स्पष्ट नहीं हैं, जिससे भविष्य कहने वाले बायोमार्कर48की पहचान की आवश्यकता होती है। पीडीई की उत्कृष्ट विशेषता-ट्यूमर ऊतक के 3 डी वास्तुकला को संरक्षित करने से आईसीआई प्रभावकारिता(चित्रा 3)के मूल्यांकन और आईसीआई उपचार(चित्रा 4)के जवाब में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की निगरानी की सुविधा है। इस प्रकार, पीडीई आईसीआई-संवेदनशील बनाम आईसीआई-प्रतिरोधी मामलों को अलग करने और इस अंतर को रेखांकित करने वाले तंत्रों की जांच के लिए एक आदर्श मंच है।
PDE प्रौद्योगिकी कुछ नुकसान से ग्रस्त है । पीडीई से सटीक, प्रयोगात्मक परिणामों की पीढ़ी ट्यूमर अखंडता पर निर्भर करती है, और कभी-कभी, सर्जरी के बाद ट्यूमर के नमूने पीडीई के लिए प्रक्रिया करने के लिए भी परिगलित होते हैं। इसके अलावा, लंबे समय तक संस्कृति25के बाद ऊतक अखंडता की अवधारण के कुछ विशिष्ट उदाहरणों के बावजूद, सबसे अधिक सूचित मामलों के लिए, संस्कृति में 72 घंटे के बाद अखंडता और व्यवहार्यता खो गई है, और ऊतक विघटन होता है। दवा प्रयोगों को करने के लिए समय की खिड़की इसलिए अपेक्षाकृत सीमित है, अधिग्रहीत दवा प्रतिरोध या आक्रमण और मेटास्टेसिस13के अध्ययन के तंत्र के अध्ययन के लिए इस मॉडल के उपयोग पर रोक लगाता है। एक्सप्लांट्स की व्यवहार्यता का विस्तार भविष्य में नई प्रौद्योगिकियों के विकास के माध्यम से संभव हो सकता है, जैसे कि मचान और पर्फ्यूज चैनल, जो अधिक विस्तारित संस्कृति की अनुमति देते हुए प्रसार और पोषक तत्वों के तेज की सुविधा प्रदान कर सकते हैं।
हालांकि, जब तक इन सुधारों को नहीं किया जा सकता है, तब तक पीडीई प्लेटफॉर्म को एक अल्पकालिक संस्कृति विधि के रूप में माना जाना चाहिए जो तत्काल दवा प्रतिक्रिया डेटा प्रदान कर सकता है। इसका उपयोग ऑर्गेनॉइड और पीडीएक्स मॉडल जैसे अन्य मॉडल प्रणालियों के साथ किया जाना चाहिए, जो दीर्घकालिक दवा प्रतिक्रिया डेटा प्रदान कर सकते हैं। कुल मिलाकर, PDE मंच एक प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट प्रीक्लिनिकल मॉडल सिस्टम है जो एक मरीज के ट्यूमर की संवेदनशीलता को किसी दिए गए कैंसर एजेंट को निर्धारित करने में उपयोग का है, एक वास्तविक ट्यूमर में दवा कार्रवाई के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, और भविष्य कहनेवाला और फार्मासिडाइनमिक बायोमार्कर विकसित करने के लिए।
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Disclosures
खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं
Acknowledgments
हम सर्जिकल पुनः प्राप्त ट्यूमर ऊतक प्रदान करने के लिए लीसेस्टर एनएचएस ट्रस्ट के विश्वविद्यालय अस्पतालों में सर्जन और रोगविज्ञानियों का शुक्रिया अदा करते हैं । हम वेक्ट्रा पोलारिस के उपयोग के समर्थन के लिए ऊतक प्रसंस्करण और एफएफपीई ऊतक ब्लॉकों और कीस स्ट्रैटमैन की अनुभागिंग के साथ मदद के लिए कोर बायोटेक्नोलॉजी सेवाओं के भीतर हिक्टोलॉजी सुविधा का भी धन्यवाद करते हैं। इस शोध का समर्थन किया गया था और चार भागीदारों को शामिल करते हुए Explant कंसोर्टियम द्वारा वित्त पोषित किया गया था: लीसेस्टर विश्वविद्यालय, एमआरसी टॉक्सिकोलॉजी यूनिट, कैंसर रिसर्च यूके चिकित्सीय डिस्कवरी प्रयोगशालाएं, और लाइफआरआरसी। CRUK-NIHR लीसेस्टर प्रायोगिक कैंसर चिकित्सा केंद्र (C10604/A25151) द्वारा अतिरिक्त सहायता प्रदान की गई थी । जीएम, सीडी, और एनए के लिए धन स्तन कैंसर अब उत्प्रेरक कार्यक्रम (2017NOVPCC1066) द्वारा प्रदान किया गया था, जो फाइजर से धन द्वारा समर्थित है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma | 320099 | Staining reagent |
| Antibody Diluent / Block, 1x | Perkin Elmer | ARD1001EA | Antibody diluent/blocking buffer |
| Barnstead NANOpure Diamond | Barnstead | Ultra Pure (UP) H2O machine | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma-Aldrich | C7129 | Reagent for citrate buffer |
| Costar Multiple Well Cell Culture Plates | Corning Incorporated | 3516 | 6 multiwell plate |
| DAPI Dilactate | Life Technologies | D3571 | |
| 100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | 100 mm diameter dish for tissue culture |
| DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate | Gibco (Life Technologies) | 10569-010 | Tissue culture medium (500 mL) |
| DPX mountant | VWR | 360294H | Mounting medium |
| DPX mountant | Merck | 6522 | Mounting medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | Reagent for TE buffer |
| Eosin | CellPath | RBC-0100-00A | Staining reagent |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | For use in tissue culture medium |
| 37% Formaldehyde | Fisher (Acros) | 119690010 | 10% Formalin |
| iGenix, microwave oven IG2095 | iGenix | IG2095 | Microwave used for antigen retreival |
| Industrial methylated spirit (IMS) | Genta Medical | 199050 | 99% Industrial Denatured Alcohol (IDA) |
| InForm Advanced Image Analysis Software | Akoya Biosciences | InForm | |
| Leica ASP3000 Tissue Processor | Leica Biosystems | Automated Vacuum Tissue Processor | |
| Leica Arcadia H and C | Leica Biosystems | Embedding wax bath | |
| Leica RM2125RT | Leica Biosystems | Rotary microtome | |
| Leica ST4040 Linear Stainer | Leica Biosystems | H&E stainer | |
| Mayer's Haematoxylin | Sigma | GHS132-1L | Staining reagent |
| Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Merck Milipore | PICMORG50 | Organotypic culture insert disc |
| Novolink Polymer Detection System | Leica Biosystems | RE7150-K | DAB staining kit |
| OPAL 480 | Akoya Biosciences | FP1500001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagent | Akoya Biosciences | FP1501001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent |
| Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x | Perkin Elmer | ARH1001EA | HRP polymer |
| Penicillin/streptomycin solution | Fisher Scientific | 11548876 | For use in tissue culture medium |
| PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer | Akoya Biosciences | PhenoChart | Viewer software for scanned images |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Thermo Scientific Oxoid | BR0014G | PBS |
| 1x Plus Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36961 | Mounting medium |
| Slide Carrier | Perkin Elmer | To load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S/3160/63 | 10% Formalin |
| Sodium Hydroxide pellets | Fisher Scientific | S/4920/53 | Reagent for citrate buffer |
| Tenatex Toughened Wax - Pink (500 g) | KEMDENT | 1-601 | Dental wax surface |
| Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining Center | Fisher Scientific | 10098889 | Holder for slides and slide clips |
| Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates | Fisher Scientific | 11927774 | Slide clips |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | 252859 | Reagent for TE buffer |
| VectaShield | Vecta Laboratories | H-1000-10 | Mounting medium |
| Vectra Polaris Slide Scanner | Perkin Elmer | Vectra Polaris | Slide scanner |
| Xylene | Genta Medical | XYL050 | De-waxing agent |
References
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