JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

הערכת Nanocrystals בדרכי השתן בבני אדם באמצעות סידן פלואורופור תיוג וניתוח מעקב חלקיקים

Published: February 09, 2021
doi:
10.3791/62192
, ,
1Department of Urology,University of Alabama at Birmingham

Summary

מטרת מחקר זה הייתה לקבוע אם ניתוח מעקב חלקיקים (NTA) יכול לזהות ולכמת סידן בדרכי השתן המכיל ננו-קריסטלים ממבוגרים בריאים. הממצאים מהמחקר הנוכחי מצביעים על כך ש-NTA יכול להיות כלי פוטנציאלי להערכת ננו-קריסטלים בדרכי השתן במהלך מחלת אבן כליה.

Abstract

אבנים בכליות הופכות שכיחות יותר ברחבי העולם אצל מבוגרים וילדים. הסוג הנפוץ ביותר של אבן כליות מורכב מגבישי סידן אוקסלט (CaOx). Crystalluria מתרחשת כאשר שתן הופך רווי עם מינרלים (למשל, סידן, אוקסלט, פוספט) ולפני היווצרות אבן כליה. שיטות סטנדרטיות להערכת קריסטלוריה באבן לשעבר כוללות מיקרוסקופיה, סינון וצנטריפוגה. עם זאת, שיטות אלה בעיקר לזהות microcrystals ולא nanocrystals. Nanocrystals הוצעו להיות מזיקים יותר לתאי אפיתל הכליות מאשר microcrystals במבחנה. כאן, אנו מתארים את היכולת של ניתוח מעקב חלקיקים (NTA) כדי לזהות nanocrystals השתן האנושי. מבוגרים בריאים הוזנו דיאטה אוקסלט מבוקר לפני שתיית עומס oxalate כדי לעורר nanocrystals השתן. שתן נאסף במשך 24 שעות לפני ואחרי עומס oxalate. דגימות עובדו ונשטפו עם אתנול כדי לטהר דגימות. ננו-קריסטלים בדרכי השתן היו מוכתמים בפלואורופור מחייב הסידן, Fluo-4 AM. לאחר הכתמת, הגודל והספירה של nanocrystals נקבעו באמצעות NTA. הממצאים ממחקר זה מראים NTA יכול לזהות ביעילות nanocrystalluria אצל מבוגרים בריאים. ממצאים אלה מראים NTA יכול להיות שיטת גילוי מוקדם בעל ערך של nanocrystalluria בחולים עם מחלת אבן כליות.

Introduction

גבישי שתן נוצרים כאשר השתן הופך רווי עם מינרלים. זה יכול להתרחש אצל אנשים בריאים אבל הוא נפוץ יותר אצל אנשים עם אבנים בכליות1. נוכחות והצטברות של גבישי שתן יכול להגביר את הסיכון לפתח אבן בכליה. באופן ספציפי, זה קורה כאשר גבישים להיקשר פלאק של רנדל, גרעין, לצבור, ולגדול לאורך זמן2,3,4. Crystalluria מקדים היווצרות אבן כליה והערכה של crystalluria עשוי להיות ערך חזוי לשעבר אבן כליות3,5. באופן ספציפי, קריסטלוריה הוצע להיות שימושי כדי לחזות את הסיכון להישנות אבן בחולים עם היסטוריה של סידן אוקסלט המכיל אבנים6,7.

גבישים דווחו להשפיע לרעה על אפיתל הכליות ואת תפקוד תא החיסון במחזור8,9,10,11,12,13. דווח בעבר כי במחזור מונוציטים מסידן אוקסלט (CaOx) אבן כליה לשעבר דיכאו bioenergetics הסלולר לעומת אנשים בריאים14. בנוסף, גבישי CaOx מפחיתים ביו-אנרגיה תאית ומשבשים הומאוסטזיס של Redox במונוציטים8. צריכת ארוחות עשירות באוקסלט עלולה לגרום לקריסטלוריה שעלולה להוביל לנזק ל tubule הכליות ולשנות את הייצור והתפקוד של מקרומולקולות בדרכי השתן המגנות מפני היווצרות אבן כליות15,16. מספר מחקרים הראו כי גבישי השתן יכולים להשתנות בצורה ובגודל בהתאם ל- pH ולטמפרטורה של השתן17,18,19. יתר על כן, חלבונים בדרכי השתן הוכחו לווסת התנהגות גביש20. Daudon et al.19, הציע כי ניתוח crystalluria יכול להיות מועיל בניהול של חולים עם מחלת אבן כליות בהערכת תגובתם לטיפולים. כמה שיטות קונבנציונליות הזמינות כיום כדי להעריך את נוכחותם של גבישים כוללים מיקרוסקופיה מקוטבת21,22, מיקרוסקופ אלקטרונים23, דלפקי חלקיקים3, סינון שתן24, אידוי3,5 אוצנטריפוגה 21. מחקרים אלה סיפקו תובנה חשובה לשדה אבן הכליה לגבי קריסטלוריה. עם זאת, מגבלה של שיטות אלה כבר חוסר היכולת לדמיין ולכמת גבישים פחות מ 1 מיקרומטר בגודל. גבישים בגודל זה עשויים להשפיע על הצמיחה של אבני CaOx על ידי הצמדה ללוח של רנדל.

Nanocrystals הוכחו לגרום לפציעה נרחבת לתאי הכליה לעומת microcrystals גדול25. נוכחות של nanocrystals דווח בשתן באמצעות מנתח חלקיקים26,27. מחקרים אחרונים השתמשו בבדיקות ביספוספט בעלות תווית פלואורסצנטית (alendronate-fluorescein/alendronate-Cy5) כדי לבחון ננו-קריסטלים באמצעות ציטומטריית זרימה ננומטרית28. המגבלה של צבע זה היא שזה לא ספציפי ייקשר כמעט לכל סוגי האבנים למעט ציסטאין. לכן, הערכה מדויקת של נוכחותם של nanocrystals אצל אנשים עשוי להיות כלי יעיל כדי לאבחן crystalluria ו / או לחזות סיכון אבן. מטרת מחקר זה הייתה לזהות ולכמת סידן המכיל ננו-קריסטלים (גודל של <1 מיקרומטר) באמצעות ניתוח מעקב חלקיקים (NTA). כדי להשיג זאת, נעשה שימוש בטכנולוגיית NTA בשילוב עם פלואורופור מחייב סידן, Fluo-4 AM כדי לזהות ולכמת סידן המכיל nanocrystals בשתן של מבוגרים בריאים.

Protocol

כל הניסויים המתוארים בעבודה זו אושרו על ידי אוניברסיטת אלבמה ב ברמינגהאם (UAB) הוועדה לבדיקה מוסדית. מבוגרים בריאים (33.6 ± 3.3 שנים; n = 10) נרשמו למחקר אם היה להם פאנל מטבולי מקיף דם נורמלי, משתמשים שאינם טבק, לא בהריון, BMI בין 20-30 ק”ג / מ’2, וללא מצבים רפואיים כרוניים או מחלות חריפות. משתתפים ברי…

Representative Results

הממצאים ממחקר זה מראים NTA יכול לזהות ביעילות את הגודל הממוצע ואת הריכוז של סידן המכיל nanocrystals בדרכי השתן בשתן האנושי. זה הושג באמצעות פלואורופור, Fluo-4 AM, וניתוח מעקב חלקיקים. Fluo-4 AM היה מסוגל להיקשר הן גבישי CaOx ו CaP. כפי שמוצג באיור 3A, גבישי CaOx נקבעו להיות בין 50-270 ננומטר בגודל ויש…

Discussion

NTA שימש במחקר הנוכחי כדי להעריך nanocrystals בשתן אנושי באמצעות בדיקה מחייב סידן, Fluo-4 AM. אין שיטה סטנדרטית זמינה כדי לזהות nanocrystals בשתן. כמה קבוצות מחקר זיהו nanocrystals בשתן והסתמכו על שימוש בפרוטוקולים נרחבים או שיטות מוגבלות ביכולתם לכמת את הדגימות27,28. מחקר זה מראה ש?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים לכל משתתפי המחקר ולגרעין הביונוטריון UAB CCTS ולמרכז שירות ההדמיה ברזולוציה גבוהה של UAB על תרומתם. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים DK106284 ו DK123542 (TM), ו UL1TR003096 (המרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום).

Materials

Benchtop Centrifuge Jouan Centrifuge CR3-12
Calcium Oxalate monohydrate Synthesized in the lab as previously described29. Store at RT; Stock 10 mM
Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder) Sigma 677418 Store at RT; Stock 10 mM
Ethanol Fischer Scientific AC615095000 Store at RT; Stock 100%
Fluo-4 AM* AAT Bioquest, Inc. 20550 Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM
Gold Nanoparticles Sigma 742031 Store at 2-8°C
NanoSight Instrument Malvern Instruments, UK NS300
Syringe pump Harvard Apparatus 98-4730
Virkon Disinfectant LanXESS Energizing Company, Germany LSP
*Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Fogazzi, G. B. Crystalluria: a neglected aspect of urinary sediment analysis. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 11 (2), 379-387 (1996).
  2. Kuo, R. L. Urine calcium and volume predict coverage of renal papilla by Randall’s plaque. Kidney International. 64 (6), 2150-2154 (2003).
  3. Robertson, W. G., Peacock, M., Nordin, B. E. Calcium crystalluria in recurrent renal-stone formers. Lancet. 2 (7610), 21-24 (1969).
  4. Robertson, W. G., Peacock, M. Calcium oxalate crystalluria and inhibitors of crystallization in recurrent renal stone-formers. Clinical Science. 43 (4), 499-506 (1972).
  5. Hallson, P. C., Rose, G. A. A new urinary test for stone “activity”. British Journal of Urology. 50 (7), 442-448 (1978).
  6. Daudon, M., Hennequin, C., Boujelben, G., Lacour, B., Jungers, P. Serial crystalluria determination and the risk of recurrence in calcium stone formers. Kidney International. 67 (5), 1934-1943 (2005).
  7. Baumann, J. M., Affolter, B. From crystalluria to kidney stones, some physicochemical aspects of calcium nephrolithiasis. World Journal of Nephrology. 3 (4), 256-267 (2014).
  8. Patel, M., et al. Oxalate induces mitochondrial dysfunction and disrupts redox homeostasis in a human monocyte derived cell line. Redox Biology. 15, 207-215 (2018).
  9. Khan, S. R. Role of renal epithelial cells in the initiation of calcium oxalate stones. Nephron Experimental Nephrology. 98 (2), 55-60 (2004).
  10. Mulay, S. R., et al. Calcium oxalate crystals induce renal inflammation by NLRP3-mediated IL-1beta secretion. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 236-246 (2013).
  11. Umekawa, T., Chegini, N., Khan, S. R. Oxalate ions and calcium oxalate crystals stimulate MCP-1 expression by renal epithelial cells. Kidney International. 61 (1), 105-112 (2002).
  12. Huang, M. Y., Chaturvedi, L. S., Koul, S., Koul, H. K. Oxalate stimulates IL-6 production in HK-2 cells, a line of human renal proximal tubular epithelial cells. Kidney International. 68 (2), 497-503 (2005).
  13. Lu, X. Renal tubular epithelial cell injury, apoptosis and inflammation are involved in melamine-related kidney stone formation. Urological Research. 40 (6), 717-723 (2012).
  14. Williams, J., Holmes, R. P., Assimos, D. G., Mitchell, T. Monocyte Mitochondrial Function in Calcium Oxalate Stone Formers. Urology. 93, 221-226 (2016).
  15. Balcke, P., et al. Transient hyperoxaluria after ingestion of chocolate as a high risk factor for calcium oxalate calculi. Nephron. 51 (1), 32-34 (1989).
  16. Khan, S. R., Kok, D. J. Modulators of urinary stone formation. Frontiers in Bioscience. 9, 1450-1482 (2004).
  17. Rodgers, A., Allie-Hamdulay, S., Jackson, G. Therapeutic action of citrate in urolithiasis explained by chemical speciation: increase in pH is the determinant factor. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 21 (2), 361-369 (2006).
  18. Verplaetse, H., Verbeeck, R. M., Minnaert, H., Oosterlinck, W. Solubility of inorganic kidney stone components in the presence of acid-base sensitive complexing agents. European Urology. 11 (1), 44-51 (1985).
  19. Frochot, V., Daudon, M. Clinical value of crystalluria and quantitative morphoconstitutional analysis of urinary calculi. International Journal of Surgery. 36, 624-632 (2016).
  20. Grover, P. K., Thurgood, L. A., Wang, T., Ryall, R. L. The effects of intracrystalline and surface-bound proteins on the attachment of calcium oxalate monohydrate crystals to renal cells in undiluted human urine. BJU International. 105, 708-715 (2010).
  21. Bader, C. A., Chevalier, A., Hennequin, C., Jungers, P., Daudon, M. Methodological aspects of spontaneous crystalluria studies in calcium stone formers. Scanning Microscopy. 8 (2), 215-231 (1994).
  22. Daudon, M., Cohen-Solal, F., Jungers, P. . Eurolithiasis. 9th European Symposium on Urolithiasis. , 261-263 (2001).
  23. Werness, P. G., Bergert, J. H., Smith, L. H. Crystalluria. Journal of Crystal Growth. 53 (1), 166-181 (1981).
  24. Fan, J., Chandhoke, P. S. Examination of crystalluria in freshly voided urines of recurrent calcium stone formers and normal individuals using a new filter technique. Journal of Urology. 161 (5), 1685-1688 (1999).
  25. Sun, X. Y., Ouyang, J. M., Yu, K. Shape-dependent cellular toxicity on renal epithelial cells and stone risk of calcium oxalate dihydrate crystals. Scientific Reports. 7 (1), 7250 (2017).
  26. He, J. Y., Deng, S. P., Ouyang, J. M. Morphology, particle size distribution, aggregation, and crystal phase of nanocrystallites in the urine of healthy persons and lithogenic patients. IEEE Trans Nanobioscience. 9 (2), 156-163 (2010).
  27. Gao, J., et al. Comparison of Physicochemical Properties of Nano- and Microsized Crystals in the Urine of Calcium Oxalate Stone Patients and Control Subjects. Journal of Nanomaterials. 2014, 9 (2014).
  28. Gavin, C. T., et al. Novel Methods of Determining Urinary Calculi Composition: Petrographic Thin Sectioning of Calculi and Nanoscale Flow Cytometry Urinalysis. Scientific Reports. 6, 19328 (2016).
  29. Kumar, P., et al. Dietary Oxalate Induces Urinary Nanocrystals in Humans. Kidney International Reports. 5 (7), 1040-1051 (2020).
  30. Carr, B., Hole, P., Malloy, A., Nelson, P., Smith, J. Applications of nanoparticle tracking analysis in nanoparticle research–A mini-review. European Journal of Parenteral Sciences and Pharmaceutical Sciences. 14 (2), 45 (2009).
  31. Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7 (6), 780-788 (2011).
  32. Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, 64-74 (2015).
  33. Gercel-Taylor, C., Atay, S., Tullis, R. H., Kesimer, M., Taylor, D. D. Nanoparticle analysis of circulating cell-derived vesicles in ovarian cancer patients. Analytical Biochemistry. 428 (1), 44-53 (2012).
  34. Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 8171-8178 (1989).
  35. Harkins, A. B., Kurebayashi, N., Baylor, S. M. Resting myoplasmic free calcium in frog skeletal muscle fibers estimated with fluo-3. Biophysical Journal. 65 (2), 865-881 (1993).
  36. Hernandez-Santana, A., Yavorskyy, A., Loughran, S. T., McCarthy, G. M., McMahon, G. P. New approaches in the detection of calcium-containing microcrystals in synovial fluid. Bioanalysis. 3 (10), 1085-1091 (2011).
  37. Tong, M., Brown, O. S., Stone, P. R., Cree, L. M., Chamley, L. W. Flow speed alters the apparent size and concentration of particles measured using NanoSight nanoparticle tracking analysis. Placenta. 38, 29-32 (2016).
  38. Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
  39. Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15, 2101 (2013).
  40. Tomlinson, P. R., et al. Identification of distinct circulating exosomes in Parkinson’s disease. Annals of Clinical and Translational Neurology. 2 (4), 353-361 (2015).

Tags

Keywords: Urinary NanocrystalsCalcium Fluorophore LabelingNanoparticle Tracking AnalysisKidney Stone FormationCrystal UreaOxalate LoadUrine PHUrine VolumeCalcium OxalateCalcium PhosphateFluo-4 AMGold NanoparticlesNanoparticle Tracking Analysis (NTA)
check_url/pt/62192?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Kumar, P., Bell, A., Mitchell, T. Estimation of Urinary Nanocrystals in Humans using Calcium Fluorophore Labeling and Nanoparticle Tracking Analysis. J. Vis. Exp. (168), e62192, doi:10.3791/62192 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image