Stima dei nanocristalli urinari nell'uomo utilizzando l'etichettatura del fluoroforo di calcio e l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle

Summary

L’obiettivo di questo studio era determinare se l’analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) potesse rilevare e quantificare il calcio urinario contenente nanocristalli di adulti sani. I risultati dell’attuale studio suggeriscono che l’NTA potrebbe essere un potenziale strumento per stimare i nanocristalli urinari durante la malattia da calcoli renali.

Abstract

I calcoli renali stanno diventando sempre più diffusi in tutto il mondo negli adulti e nei bambini. Il tipo più comune di calcoli renali è costituito da cristalli di ossalato di calcio (CaOx). I cristalli si verificano quando l’urina diventa supersatura di minerali (ad esempio calcio, ossalato, fosfato) e precede la formazione di calcoli renali. I metodi standard per valutare i cristalli nei formatori di pietra includono microscopia, filtrazione e centrifugazione. Tuttavia, questi metodi rilevano principalmente microcristalli e non nanocristalli. I nanocristalli sono stati suggeriti per essere più dannosi per le cellule epiteliali renali rispetto ai microcristalli in vitro. Qui descriviamo la capacità dell’analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) di rilevare i nanocristalli urinari umani. Gli adulti sani sono stati nutriti con una dieta ossalata controllata prima di bere un carico ossalato per stimolare i nanocristalli urinari. L’urina è stata raccolta per 24 ore prima e dopo il carico di ossalato. I campioni sono stati lavorati e lavati con etanolo per purificare i campioni. I nanocristalli urinari erano macchiati con il fluorofoforo legante il calcio, Fluo-4 AM. Dopo la colorazione, le dimensioni e il conteggio dei nanocristalli sono stati determinati usando l’NTA. I risultati di questo studio mostrano che NTA è in grado di rilevare in modo efficiente la nanocristalluria negli adulti sani. Questi risultati suggeriscono che l’NTA potrebbe essere un prezioso metodo di diagnosi precoce della nanocristalluria nei pazienti con malattia da calcoli renali.

Introduction

I cristalli urinari si formano quando l’urina diventa supersatura di minerali. Questo può verificarsi in individui sani ma è più comune negli individui con calcoli renali¹. La presenza e l’accumulo di cristalli urinari può aumentare il rischio di sviluppare un calcolo renale. In particolare, ciò si verifica quando i cristalli si legano alla placca di Randall, nucleato, si accumulano e crescono nel^{tempo 2,3,4}. Crystalluria precede la formazione di calcoli renali e la valutazione dei cristalli può avere un valore predittivo nei calcoli renali^{ex 3,5}. Nello specifico, è stato suggerito che i cristalli siano utili per prevedere il rischio di recidiva della pietra in pazienti con una storia di ossalato di calcio contenente^{pietre 6,7}.

È stato riferito che i cristalli hanno un impatto negativo sulla funzione epiteliale renale e sulle cellule immunitarie^{circolanti 8,9,10,11,12,13}. È stato precedentemente riferito che i monociti circolanti da ex calcoli renali di ossalato di calcio (CaOx) hanno soppresso la bioenergetica cellulare rispetto agli individui sani¹⁴. Inoltre, i cristalli caOx riducono i bioenergetici cellulari e interrompono l’omeostasi redox nei monociti⁸. Il consumo di pasti ricchi di ossalato può causare cristalli che potrebbero causare danni tubuli renali e alterare la produzione e la funzione di macromolecole urinarie protettive contro la formazione di calcoli^{renali 15,16}. Diversi studi hanno dimostrato che i cristalli urinari possono variare per forma e dimensioni a seconda del pH e della temperatura delle urine^17,18,19. Inoltre, le proteine urinarie hanno dimostrato di modulare il comportamento cristallino²⁰. ^Daudonet al. Alcuni metodi convenzionali attualmente disponibili per valutare la presenza di cristalli includono microscopia polarizzata^21,22,microscopia elettronica^23,contatori di particelle^3,filtrazione delle urine^24,evaporazione^3,5 o centrifugazione^21. Questi studi hanno fornito preziose informazioni sul campo di calcoli renali per quanto riguarda i cristalli. Tuttavia, una limitazione di questi metodi è stata l’incapacità di visualizzare e quantificare cristalli di dimensioni inferiori a 1 μm. Cristalli di queste dimensioni possono influenzare la crescita delle pietre CaOx attaccandosi alla placca di Randall.

È stato dimostrato che i nanocristalli causano lesioni estese alle cellule renali rispetto ai microcristalli più grandi²⁵. La presenza di nanocristalli è stata segnalata nelle urine utilizzando un analizzatore di nanoparticelle^26,27. Recenti studi hanno utilizzato sonde bisfosfato etichettate fluorescentmente (alendronato-fluoresceina/alendronato-Cy5) per esaminare i nanocristalli usando citometria a flusso su scala nanometrica²⁸. La limitazione di questo colorante è che non è specifico e si legherà a quasi tutti i tipi di pietre tranne la cisteina. Pertanto, valutare con precisione la presenza di nanocristalli negli individui può essere uno strumento efficace per diagnosticare i cristalli e / o prevedere il rischio di pietra. Lo scopo di questo studio era quello di rilevare e quantificare il calcio contenente nanocristalli (<1 μm di dimensioni) utilizzando l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA). Per raggiungere questo obiettivo, la tecnologia NTA è stata utilizzata in combinazione con un fluorofore legante il calcio, Fluo-4 AM per rilevare e quantificare il calcio contenente nanocristalli nelle urine di adulti sani.

Protocol

Tutti gli esperimenti delineati in questo lavoro sono stati approvati dall’University of Alabama at Birmingham (UAB) Institutional Review Board. Gli adulti sani (33,6 ± 3,3 anni; n=10) sono stati iscritti allo studio se avevano un normale pannello metabolico completo del sangue, consumatori non di tabacco, non in gravidanza, un IMC tra 20-30 kg / m2e privo di condizioni mediche croniche o malattie acute. I partecipanti sani hanno firmato un modulo di consenso informato scritto prima dell’inizio dello studio.<…

Representative Results

I risultati di questo studio mostrano che l’NTA è in grado di rilevare in modo efficiente le dimensioni medie e la concentrazione di calcio contenente nanocristalli urinari nelle urine umane. Questo è stato ottenuto usando l’analisi del fluoroforo, fluo-4 AM e tracciamento delle nanoparticelle. Fluo-4 AM è stato in grado di legarsi sia ai cristalli CaOx che CaP. Come mostrato nella figura 3A, i cristalli di CaOx sono stati determinati in dimensioni compresa tra 50 e 270 nm e hanno una con…

Discussion

L’NTA è stata utilizzata nel presente studio per valutare i nanocristalli nelle urine umane utilizzando una sonda legante il calcio, Fluo-4 AM. Non esiste un metodo standard disponibile per rilevare i nanocristalli nelle urine. Alcuni gruppi di ricerca hanno rilevato nanocristalli nelle urine e si sono affidati all’uso di ampi protocolli o metodi che sono limitati nella loro capacità di quantificare^{i campioni 27,28}. Questo studio mostra un metodo specifico e se…

Materials

Benchtop Centrifuge	Jouan Centrifuge	CR3-12
Calcium Oxalate monohydrate	Synthesized in the lab as previously described29.		Store at RT; Stock 10 mM
Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder)	Sigma	677418	Store at RT; Stock 10 mM
Ethanol	Fischer Scientific	AC615095000	Store at RT; Stock 100%
Fluo-4 AM*	AAT Bioquest, Inc.	20550	Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM
Gold Nanoparticles	Sigma	742031	Store at 2-8°C
NanoSight Instrument	Malvern Instruments, UK	NS300
Syringe pump	Harvard Apparatus	98-4730
Virkon Disinfectant	LanXESS Energizing Company, Germany	LSP
*Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C.