Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Generatie en uitbreiding van menselijke cardiomyocyten uit mononucleaire bloedcellen van de patiënt

Published: February 12, 2021 doi: 10.3791/62206
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2,4, 1,2,5, 3, 1,2,5,6
1Center for Cardiovascular Research, The Abigail Wexner Research Institute, Nationwide Children’s Hospital, 2The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, 3Department of Physiology and Cell Biology, The Ohio State University College of Medicine, 4Department of Anatomy, The Ohio State University College of Medicine, 5MCDB Graduate Program, The Ohio State University, 6Department of Pediatrics, The Ohio State University College of Medicine

Summary

Hier presenteren we een protocol om menselijke cardiomyocyten robuust te genereren en uit te breiden uit perifere mononucleaire bloedcellen van patiënten.

Abstract

Het genereren van patiëntspecifieke cardiomyocyten uit een enkele bloedafname heeft enorme belangstelling getrokken voor precisiegeneeskunde bij hart- en vaatziekten. Cardiale differentiatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) wordt gemoduleerd door gedefinieerde signaalroutes die essentieel zijn voor de embryonale hartontwikkeling. Talrijke cardiale differentiatiemethoden op 2D- en 3D-platforms zijn ontwikkeld met verschillende efficiënties en cardiomyocytenopbrengst. Dit heeft onderzoekers buiten het veld verbaasd, omdat de verscheidenheid van deze methoden moeilijk te volgen kan zijn. Hier presenteren we een uitgebreid protocol dat robuuste generatie en uitbreiding van patiëntspecifieke cardiomyocyten uit perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) uitwerkt. We beschrijven eerst een zeer efficiënt iPSC-herprogrammeringsprotocol van het bloedmonster van een patiënt met behulp van niet-geïntegreerde Sendai-virusvectoren. Vervolgens beschrijven we een kleine molecuul-gemedieerde monolaagdifferentiatiemethode die robuust kloppende cardiomyocyten kan produceren uit de meeste menselijke iPSC-lijnen. Daarnaast wordt een schaalbaar cardiomyocytenuitbreidingsprotocol geïntroduceerd met behulp van een klein molecuul (CHIR99021) dat patiënt-afgeleide cardiomyocyten snel kan uitbreiden voor industriële en klinische toepassingen. Aan het einde worden gedetailleerde protocollen voor moleculaire identificatie en elektrofysiologische karakterisering van deze iPSC-CM's weergegeven. We verwachten dat dit protocol pragmatisch is voor beginners met beperkte kennis over cardiovasculaire ontwikkeling en stamcelbiologie.

Introduction

De ontdekking van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen heeft een revolutie teweeggebracht in de moderne cardiovasculaire geneeskunde1,2. Menselijke iPSC's zijn in staat om zichzelf te vernieuwen en alle celtypen in het hart te genereren, inclusief cardiomyocyten, endotheelcellen, gladde spiercellen en hartfibroblasten. Patiënt iPSC-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CMs) kunnen dienen als onbepaalde bronnen voor het modelleren van genetisch overerfbare hart- en vaatziekten (CVD's) en het testen van de cardiale veiligheid voor nieuwe geneesmiddelen3. In het bijzonder zijn patiënt iPSC-CMs goed voorbereid om genetische en moleculaire etiologieën van CVD's te onderzoeken die zijn afgeleid van defecten in cardiomyocyten, zoals lang QT-syndroom4 en gedilateerde cardiomyopathie (DCM)5. In combinatie met CRISPR/ Cas9-gemedieerde genoombewerking hebben patiënt-iPSC-CM's een ongekende weg geopend om de complexe genetische basis van CVD's te begrijpen, waaronder aangeboren hartafwijkingen (CHD's)6,7,8. Menselijke iPSC-CM's hebben ook mogelijkheden getoond om te dienen als autologe celbronnen voor het aanvullen van het beschadigde myocard tijdens een hartaanval9. In de afgelopen jaren is het van het grootste belang geworden om hoogwaardige menselijke iPSC-CMs te genereren met gedefinieerde subtypen (atriale, ventriculaire en nodale) voor hartregeneratie en geneesmiddelentests10.

Cardiale differentiatie van menselijke iPSC's is het afgelopen decennium sterk verbeterd. Differentiatiemethoden zijn gegaan van op embryoïde lichamen (EB) gebaseerde spontane differentiatie naar chemisch gedefinieerde en gerichte cardiale differentiatie11. Belangrijke signaalmoleculen die essentieel zijn voor de embryonale hartontwikkeling, zoals Wnt, BMP, Nodal en FGF, worden gemanipuleerd om de differentiatie van cardiomyocyten van menselijke iPSC's10,12te verbeteren. Belangrijke vooruitgang omvat sequentiële modulatie van Wnt-signalering (activering gevolgd door remming) voor robuuste generatie van cardiomyocyten uit menselijke iPSC's13,14. Chemisch gedefinieerde hartdifferentiatierecepten zijn onderzocht om grootschalige productie van kloppende cardiomyocyten15,16tevergemakkelijken, die het potentieel hebben om te worden opgewaardeerd tot productie op industrieel en klinisch niveau. Bovendien wordt een robuuste uitbreiding van vroege menselijke iPSC-CM's bereikt door blootstelling aan constitutieve Wnt-activering met behulp van een kleine chemische stof (CHIR99021)17. Meest recent worden subtypespecifieke cardiomyocyten gegenereerd door manipulatie van retinoïnezuur (RA) en Wnt-signaalroutes bij specifieke differentiatievensters tijdens cardiomyocytenlijnverbintenis van menselijke iPSC's18,19,20,21,22.

In dit protocol beschrijven we een werkprocedure voor robuuste generatie en proliferatie van menselijke CM's afkomstig van perifere mononucleaire bloedcellen van patiënten. We presenteren protocollen voor 1) het herprogrammeren van menselijke PBMC's naar iPSC's, 2) robuuste generatie van kloppende cardiomyocyten van menselijke iPSC's, 3) snelle uitbreiding van vroege iPSC-CMs, 4) moleculaire karakterisering van menselijke iPSC-CMs, en 5) elektrofysiologische meting van menselijke iPSC-CMs op het niveau van eencellige door patchklem. Dit protocol omvat de gedetailleerde experimentele procedures voor het omzetten van bloedcellen van patiënten in kloppende cardiomyocyten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De experimentele protocollen en geïnformeerde toestemming voor menselijke proefpersonen werden goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB) in het Nationwide Children's Hospital.

1. Bereiding van celkweekmedia, oplossingen en reagentia

  1. PBMC-media voorbereiden
    1. Meng 20 ml basale PBMC-cultuurmedia (1x) en 0,52 ml supplement. Voeg elk 20 μL SCF en FLT3 toe (voorraadconcentratie: 100 μg/ml), 4 μL IL3, IL6 en EPO elk (voorraadconcentratie: 100 μg/ml) en 200 μL L-glutaminealternatief (100x). Meng ze grondig. Filter in een steriele kap met behulp van een filtereenheid van 0,22 μm. Noem dit Complete Blood Media.
    2. Meng 20 ml basale PBMC-cultuurmedia (1x) en 0,52 ml van het supplement. Voeg 200 μL L-glutamine alternatief (100x) toe. Meng ze grondig. Filter met een filtereenheid van 0,22 μm. Noem dit als Supplement Bloedmedia.
  2. Bereid complete E8-media voor
    1. Meng 500 ml E8 basale media en 10 ml E8-supplement ('s nachts ontdooid bij 4 °C) om complete E8-media te maken. Voor gebruik in evenwicht brengen tot kamertemperatuur (RT).
  3. iPSC passaging media voorbereiden
    1. Voeg 40 μL Y-27632 Rock inhibitor (1:5.000 verdunning, voorraadconcentratie: 10 mM) toe aan 200 ml complete E8 media. Meng het grondig. Voor gebruik in evenwicht brengen met RT.
  4. Bereid cardiomyocytendifferentiatiemedia voor
    1. Media I: Meng 500 ml RPMI1640 met 10 ml B27 minus insulinesupplement (50x).
    2. Media II: Voeg een geschikt volume CHIR99021 (GSK3-remmer) toe aan Media I (CHIR99021 eindconcentratie van 6 μM). Meng.
    3. Media III: Voeg een geschikt volume IWR-1 (Wnt-remmer) toe aan Media I (IWR-1 eindconcentratie van 5 μM). Meng.
    4. Media IV: Meng 500 ml RPMI1640 met 10 ml B27-supplement (50x). Meng.
    5. Media V: Meng 500 ml RPMI1640 (geen glucose) met 10 ml B27-supplement (50x). Meng.
    6. Media VI: Voeg een geschikt volume CHIR99021-voorraad toe aan Media IV (CHIR99021 eindconcentratie van 2 μM). Meng.
  5. Bereid iPSC-CM passaging media voor
    1. Voeg 10 ml knock-out serumvervanging (KSR) toe aan 90 ml Media IV (KSR-eindconcentratie: 10%). Meng goed.
  6. iPSC-CM-vriesmedia voorbereiden
    1. Voeg 1 ml DMSO toe aan 9 ml KSR (eindconcentraties: 10% DMSO/90% KSR) en meng goed.
  7. Bereid keldermembraanmatrix medium-gecoate platen voor
    1. Ontdooi het membraanmatrixmedium van de kelder bij 4 °C 's nachts en aliquot in buizen van 1,5 ml. Voeg 1 ml van dit medium toe aan 250 ml DMEM/F12 media (1:250 verdunning) en meng ze grondig. Breng 2 ml van de verdunde oplossing per put aan in een 6-well plaat en incubeer in 5% CO2 bij 37 °C gedurende 30 minuten voor gebruik.

2. iPSC herprogrammering van PBMC's

  1. Scheid PBMC's van bloedmonsters.
    1. Verzamel bloedmonsters van patiënten (~ 5 ml) en breng over in bloedcelscheidingsbuizen (zie Materiaaltabel). Meng door 10x om te keren.
    2. Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Haal de buisjes er voorzichtig uit en spuit met 70% ethanol. Verwijder onder een bioveiligheidskap de doppen zonder de mononucleaire cellen te verstoren (buffy layer). PBMC's bevinden zich in een witachtige laag net onder de plasmalaag(figuur 1A). Verzamel de hele buffy laag met een pipet van 1000 μL en breng over op een conische buis van 15 ml.
    4. Tel het celnummer met behulp van een geautomatiseerde celteller. Draai de buis op 300 x g gedurende 25 minuten bij RT.
    5. Gooi het supernatant weg. Wassen met 10 ml DPBS (Ca2+/Mg2+ vrij).
    6. Draai de buis op 300 x g gedurende 15 minuten bij RT.
    7. Verwijder het supernatant. Resuspend celkorrels in 1 ml van de vriesmedia (KSR plus 10% DMSO). Pas de celdichtheid aan om 1 x 106 cellen per injectieflacon te maken.
    8. Plaats PBMC cryovialen in een celbevriezingscontainer en houd deze 's nachts op -80 °C. Breng over naar een tank met vloeibare stikstof voor langdurige opslag de volgende dag.
  2. iPSC herprogrammering.
    1. Voeg 3 ml supplementbloedmedia toe in een conische buis van 15 ml. Ontdooi PBMC's in een waterbad van 37 °C en breng ze over in een conische buis. Draai op 300 x g gedurende 7 minuten bij RT.
    2. Gooi het supernatant weg. Resuspend PBMC's met complete bloedmedia. Zaai ze in twee putten van een 24 put weefselkweekplaten (geen keldermembraanmatrix).
    3. Incubeer 's nachts 5% CO2 bij 37 °C. Verwijder de volgende dag voorzichtig de helft van de oude media (0,5 ml) en voeg 0,5 ml verse Complete Blood Media toe.
    4. Verander media om de dag door de helft van de oude media te vernieuwen.
    5. Was na een week de put agressief met 1 ml supplementbloedmedia en breng cellen over in een centrifugebuis van 15 ml.
    6. Tel het celnummer. Neem 2 x 105 cellen en centrifugeer bij 300 x g gedurende 7 minuten.
    7. Gooi het supernatant weg. Resuspend cellen met 300 μL complete bloedmedia. Voer transfectie uit door het juiste volume Sendai-virusherprogrammeringsvectoren toe te voegen volgens de instructies van de fabrikant. Breng ze over in één put van een 24-putplaat (geen keldermembraanmatrix). Incubeer 's nachts 5% CO2 bij 37 °C.
    8. Draai de volgende dag 7 min op 300 x g. Verwijder het supernatant en resuspend in 2 ml complete bloedmedia. Breng over in één put van een 6 putplaat voorgecoat met keldermembraanmatrix. Dit is dag 1 (D1).
    9. Raak het bord de volgende dag niet aan.
    10. Verwijder op D3 1 ml van de oude media. Voeg 1 ml supplement bloedmedia toe.
    11. Herhaal stap 2.2.10 op D5.
    12. Verwijder op D7 1 ml van de oude media. Voeg 1 ml complete E8-media toe.
    13. Herhaal stap 2.2.12 op D8.
    14. Verwijder op D9 de oude media. Voeg 2 ml complete E8-media toe. Volledig geherprogrammeerde cellen zullen zich naar verwachting hechten en kolonies gaan vormen.
    15. Ververs elke dag met 2 ml complete E8-media.
    16. Ongeveer 2 weken na de overdracht van het Sendai-virus verschijnen grote iPSC-kolonies die klaar zijn om te worden geplukt.
    17. Knip iPSC-kolonies onder een stereomicroscoop in de kap en breng individuele kolonies over naar een keldermembraanmatrix-gecoate 24-well plaat vooraf geladen met 0,5 ml iPSC passaging media.
    18. Ververs elke dag met 0,5 ml complete E8-media totdat iPSC-kolonies groot genoeg worden om door te gaan in een nieuwe keldermembraanmatrix-gecoate 6-well plaat.

3. Menselijk iPSC-onderhoud en passaging

  1. Wanneer menselijke iPSC's meer dan 90% samenvloeiing bereiken, verwijder dan oude media. Spoel eenmaal af met 3 ml DPBS.
  2. Voeg 1 ml 0,5 mM EDTA toe in dpbs-oplossing. Incubeer in 5% CO2 bij 37 °C gedurende 5-8 min.
  3. Verwijder EDTA door aspiratie. Voeg 1 ml iPSC passaging media toe. Maak iPSC's handmatig los.
  4. Neem 600-900 μL eencellige suspensie en plaats ze opnieuw op een keldermembraanmatrix-gecoate 6-well plaat (verdunning: 1:6 tot 1:10). Incubeer 's nachts 5% CO2 bij 37 °C.
  5. Ververs elke dag met 2 ml complete E8-media. De iPSC-culturen bereiken meestal confluentie na 3-4 dagen.

4. Chemisch gedefinieerde cardiomyocytendifferentiatie

  1. Kweek menselijke iPSC's in volledige E8-media tot 95% confluent (3-4 dagen).
  2. Verwijder de oude media. Voeg 2 ml CM-differentiatie Media II (6 μM CHIR in RPMI1640 plus B27 minus insulinesupplement) toe aan elke put van een 6-putplaat. Dit is D0. Raak D1 niet aan.
  3. Op D2, vervang door 2 ml CM-differentiatie Media I (RPMI1640 plus B27 minus insulinesupplement).
  4. Op D3, vervang door 2 ml CM-differentiatie Media III (5 μM IWR-1 in RPMI1640 plus B27 minus insulinesupplement). Raak D4 niet aan.
  5. Op D5, vervang door 2 ml CM differentiatie Media I.
  6. Op D7, vervangen door 2 ml CM differentiatie Media IV (RPMI1640 plus B27 supplement). Ververs daarna om de dag de media.
  7. Op D11 wanneer samentrekkende cellen worden waargenomen, vervangt u door 2 ml CM-differentiatie Media V (geen glucose).
  8. Op D13, vervangen door 2 ml CM differentiatie Media V.
  9. Op D15, vervangen door 2 ml CM differentiatie Media IV.
  10. Vervang op D17-D21 om de dag door 2 ml CM-differentiatie Media IV.

5. Passage menselijke iPSC-CM's

  1. Verwijder oude media en spoelcellen eenmaal met 3 ml DPBS.
  2. Breng 1 ml CM-dissociatieoplossing (zie materiaaltabel)aan op elke put van een 6-putplaat. Incubeer in 5% CO2 bij 37 °C gedurende 5-8 min.
  3. Dissociëren iPSC-CM's mechanisch in afzonderlijke cellen door krachtig pipetteren.
  4. Breng cellen over in een conische buis van 15 ml. Voeg 2 ml CM passaging media toe (10% KSR in RMPI1640 plus B27 supplement) om CM dissociatie oplossing te neutraliseren.
  5. Draai 5 min op 300 x g bij RT.
  6. Gooi het supernatant weg. Resuspend cellen met een gewenst volume CM passaging media. Zaai ze in een met keldermembraanmatrix gecoate plaat / schaal. Menselijke iPSC-CM's hervatten het kloppen 1-3 dagen na het passeren.

6. Uitbreiding van menselijke iPSC-CM's

  1. Spoel D10-12 één keer af met iPSC-CMs met 3 ml DPBS voor elke put van een 6-well plaat. Voeg 1 ml CM-dissociatieoplossing toe (stap 5.2). Incubeer in 5% CO2 bij 37 °C gedurende 7-10 min.
  2. Dissociëren iPSC-CM's mechanisch in afzonderlijke cellen door krachtig pipetteren.
  3. Breng cellen over in een conische buis van 15 ml. Voeg 2 ml CM passaging media toe om cm-dissociatieoplossing te neutraliseren.
  4. Draai 5 min op 300 x g bij RT.
  5. Gooi het supernatant weg. Resuspend cellen met een geschikt volume CM passaging media. Pipetteer op en neer om eencellige suspensie te maken. Zaai een miljoen iPSC-CMs in een keldermembraan matrix-gecoate 10 cm schaal.
  6. De volgende dag oude media verwijderen. Voeg 10 ml cardiomyocytenproliferatiemedia toe (Media VI: 2 μM CHIR99021). Verander de media om de dag.
  7. Wanneer iPSC-CMs na 7-9 dagen cultuur confluent worden, herhaal dan de voorbijgaande stap voor verdere uitbreiding van iPSC-CMs.

7. Immunofluorescentie

  1. Vóór immunofluorescentiekleuring, zaai iPSC-CMs op keldermembraanmatrix-gecoate coverslips die in een 24-putplaat worden geplaatst (zaaidichtheid: 0,5-1 x 106 cellen / ml). Houd iPSC-CM's minstens 4 dagen in cultuur.
  2. Was de cellen eenmaal met 1 ml DPBS.
  3. Voeg 0,5 ml 4% paraformaldehyde (PFA) toe en incubeer gedurende 15 minuten bij RT.
  4. Was de cellen met 1 ml DPBS. Herhaal dit één keer.
  5. Voeg 0,5 ml van 0,1% Triton X-100 toe en incubeer gedurende 20 minuten bij RT.
  6. Was tweemaal met 1 ml DPBS.
  7. Voeg 0,5 ml 0,2% BSA toe in DPBS (blokkeringsoplossing). Incubeer bij RT gedurende 1 uur.
  8. Voeg 200 μL primair antilichaam verdund met blokkerende oplossing toe (verdunning: 1:400-1:1000). Incubeer 's nachts bij 4 °C.
  9. Was cellen met behulp van 0,5 ml blokkerende oplossing gedurende 3 minuten met schudden. Herhaal dit twee keer.
  10. Voeg 200 μL secundair antilichaam verdund toe in de blokkerende oplossing. Incubeer bij RT gedurende 1 uur.
  11. Spoel cellen drie keer met 0,5 ml DPBS, elk gedurende 3 minuten met schudden.
  12. Counterstain kernen met DAPI (1:2000 verdunning) en incubeer gedurende 5 min bij RT.
  13. Spoel cellen drie keer met 0,5 ml DPBS.
  14. Monteer cellen op de coverslips op een microscoopglaasje met behulp van 5 μl bevestigingsmedia. Bewaren bij 4 °C en beschermen tegen licht.

8. Voorbereiding van flowcytometriemonsters

  1. Was menselijke iPSC-CM's eenmaal met 3 ml DPBS.
  2. Voeg 1 ml CM-dissociatieoplossing toe en incubeer in 5% CO2 bij 37 °C gedurende 7-10 minuten.
  3. Verwijder cellen met behulp van een pipet van 1.000 μL. Breng de celsuspensie over naar een ronde FACS-buis via een zeefdop. De FACS-buis is voorgevuld met 1 ml iPSC-CM passaging media (10% KSR) om de enzymactiviteit te neutraliseren.
  4. Draai op 300 x g gedurende 5 min.
  5. Verwijder supernatant zonder de celkorrel te storen. Voeg 250 μL fixatie-/permeabilisatieoplossing toe (zie materiaaltabel). Incubeer gedurende 20 min bij 4 °C.
  6. Voeg 1 ml Perm/Wasbuffer toe. Vortex kort en draai op 300 x g gedurende 4 min.
  7. Gooi het supernatant weg. Voeg 100 μL verdunde primaire antilichamen (1:200-1:500) toe in 1x Perm/Wasbuffer. Vortex kort en incubeer een nacht bij 4 °C.
  8. Was de cellen door 1 ml Perm/Wasbuffer toe te voegen. Vortex kort en draai op 300 x g gedurende 4 min.
  9. Gooi het supernatant weg. Voeg 100 μL verdunde secundaire antilichamen toe (1:500-1:1.000). Vortex kort en incubeer bij RT gedurende 1 uur. Bescherm tegen licht als secundaire antilichamen worden geconjugeerd met lichtgevoelige fluorescentie.
  10. Was de cellen door 1 ml Perm/wasbuffer toe te voegen. Vortex kort en draai op 300g gedurende 4 min.
  11. Gooi het supernatant weg. Resuspend cellen met 400 μL FACS-kleuringsbuffer (PBS/4% FBS). Bewaren bij 4 °C totdat het op een FACS-instrument wordt geladen.

9. Real-time qPCR

  1. Verwijder oude media in de menselijke iPSC-CM-cultuur. Voeg 500-700 μL lysisbuffer toe aan lysaatcellen. Incubeer gedurende 3 minuten bij RT. Scape-cellysaat en breng over op een RNase-vrije buis van 1,5 ml. Ga onmiddellijk over tot totale RNA-extractie of bewaar bij -80 °C.
  2. Isoleer totaal RNA met behulp van een RNA-extractiekit volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Meet de RNA-concentratie en beoordeel de kwaliteit van het totale RNA met een spectrofotometer.
  4. Voer een omgekeerde transcriptiereactie uit met behulp van een cDNA-synthesekit. Het totale volume rt-reactie is 20 μl inclusief 4 μl reactiemix (5x), 1 μl reverse transcriptase, 1 μg totaal RNA en RNase-vrij water.
  5. Incubeer het volledige RT-reactiemengsel in een thermische cycler met behulp van het volgende protocol: 25 °C gedurende 5 minuten; 46 °C gedurende 20 min; 95 °C gedurende 1 min; houd bij 4 °C.
  6. Verdun cDNA met 1:10 met nucleasevrij water. Stel real-time qPCR-reactie in door 1 μL cDNA-sjabloon, 1 μL primers /probe, 10 μL qPCR-mastermix en 8 μL nucleasevrij water te mengen.
  7. Voer uit in een real-time PCR-systeem. Het fietsprotocol is 50 °C 2 min (vasthouden), 95 °C 10 min (vasthouden), 95 °C 15 sec, 60 °C 1 min, herhaal gedurende 40 cycli.
  8. Verzamel CT-waarden voor elk gen in elk monster. Relatieve mRNA-abundantie wordt berekend door de CT-waarde van het doelgen af te trekken van de CT-waarde van een huishoudgen. Relatieve genexpressie wordt geanalyseerd met behulp van de 2-ΔΔCT-methode.

10. Opname van patchklem voor hele cellen

  1. Dissocieer iPSC-CM's in afzonderlijke cellen met behulp van CM-dissociatieoplossing zoals eerder beschreven.
  2. Zaadcellen met een lage dichtheid op keldermembraanmatrix-gecoate coverslips. Kweek ze gedurende 3-4 dagen in Media IV.
  3. Trek pipetten (weerstand 0,9-1,5 MΩ) uit borosilicaatglascapillairen met behulp van een horizontale micro-elektrodetrekker.
  4. Incubateer cellen in de oplossing van Tyrode (pH=7,35).
  5. Vul pipetten met elektrodeoplossing (pH=7,3) bestaande uit de volgende chemicaliën: 120 mM asparaginezuur, 20 mM KCl, 2 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 10 mM NaCl, 5 mM EGTA, 0,3 mM Na-GTP, 14 mM fosfocreatine, 4 mM K-ATP en 2mM creatinefosfokinase.
  6. Plaats cellen in de huidige klemmodus met behulp van een 1,5-2 diastolische drempel van 5 ms stroompuls bij 1 Hz.
  7. Record action potentials (AP's) met behulp van een micro-elektrodeversterker en een softwaregestuurd acquisitiebord.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Menselijke iPSC-herprogrammering van PBMC's
Na prekweek met Complete Blood Media gedurende 7 dagen worden PBMC's groot met zichtbare kernen en cytoplasma(figuur 1B),wat aangeeft dat ze klaar zijn voor virustransfectie. Na transfectie met de sendai virus herprogrammeringsfactoren, zullen PBMC's nog een week een epigenetisch herprogrammeringsproces ondergaan. Meestal krijgen we 30-50 iPSC-kolonies van de transfectie van 1 x 105 PBMC's en de herprogrammeringsefficiëntie is 0,03% -0,05%. Volledig geherprogrammeerde cellen zullen zich hechten en kolonies gaan vormen wanneer ze worden geïntroduceerd in de volledige E8-media(figuur 1C). Deze vroege iPSC-kolonies worden nog eens 7 dagen uitgebreid en vervolgens mechanisch gesneden en individueel opgeraapt. Elke iPSC-kolonie wordt overgebracht naar één put van een 6-putplaat om individuele iPSC-lijnen vast te stellen. Na 4-5 passages worden iPSC-kolonies zuiver met zeer weinig gedifferentieerde cellen in de buurt(figuur 1D). In dit stadium zijn de meeste cellen in iPSC-kolonies OCT4- en NANOG-positief(figuur 1E),wat hun pluripotentie aantoont. Stabiele iPSC-lijnen worden vastgesteld door de vijfde passage.

Cardiale differentiatie
Het cardiale differentiatieprotocol is weergegeven in figuur 1F. Cardiale differentiatie wordt geïnitieerd wanneer iPSC's gedurende ten minste 10 passages worden gehandhaafd. De mate van iPSC-samenvloeiing is van cruciaal belang wanneer CHIR99021 wordt toegepast. De celdichtheid is meer dan 90% confluent maar niet over confluent. Als iPSC-kolonies te druk worden, zullen ze spontane differentiatie starten die de gerichte cardiomyocytendifferentiatie-efficiëntie negatief zal beïnvloeden. Kloppende cardiomyocyten worden meestal waargenomen na dag 12 van differentiatie(Video 1). De datum waarop het begin van het slaan optreedt, varieert en is afhankelijk van de iPSC-lijnen die in gebruik zijn. Na glucose-uithongering en replating vertonen iPSC-CMs spontane slagen (Video 2) en uitgelijnde sarcomeerstructuur met geïncaleerde cardiale troponine T (TNNT2) en α-actinine (Figuur 1G-H). Bovendien is de zuiverheid van iPSC-CM's hoog, met meer dan 93% van de cellen die TNNT2+ zijn, zoals blijkt uit FACS-analyse (figuur 1I).

Hoewel iPSC-CMs relatief onvolwassen zijn in vergelijking met volwassen cardiomyocyten, vertonen ze ventriculaire en atriale-achtige actiepotentialen gemeten door hele-cel patchklem(Figuur 2A,B). In een typische cardiale differentiatie zijn dag 30 iPSC-CMs een mengsel van ventriculaire- , atriale en nodaalachtige subtypen, waarbij ventriculaire CMs de meerderheid vertegenwoordigen (60%, figuur 2C)met behulp van het bovengenoemde differentiatieprotocol (figuur 1F). Verschillende differentiatieprotocollen leveren verschillende percentages cardiomyocytensubtypen op als gevolg van verschillende activering van signaalroutes tijdens cellijnbepaling10. Ventriculaire CMs zijn gelabeld met MYL2 (MLC2v, Figuur 2D), terwijl atriale iPSC-CMs worden gemarkeerd door NR2F2 (COUP-TFII, Figuur 2E). Deze markers komen sterk tot uiting in meer volwassen iPSC-CMs (>D30) in plaats van die in een vroeg stadium.

Uitbreiding van iPSC-CMs door Wnt activatie
Bij zoogdieren delen volwassen cardiomyocyten zich niet actief voor zelfvernieuwing. Dit fenomeen vindt ook plaats voor menselijke iPSC-CM's. Eenmaal volwassen voorbij D30, is celdeling van iPSC-CM's een zeldzame gebeurtenis, waardoor hun vermogen voor massaproductie op klinisch en industrieel niveau wordt beperkt. Om de ontwikkelingsomgeving na te bootsen tijdens embryonale cardiomyocytenproliferatie, activeren we de Wnt-route van CHIR99021 om de vermenigvuldiging van vroege iPSC-CM's te stimuleren. D12-14 iPSC-CMs (na zuivering door glucosedeprivatie) worden gezaaid met een lage dichtheid in aanwezigheid van 2 μM CHIR99021. Wnt-activering stimuleert de celdeling van iPSC-CMs en bevordert de expressie van celcyclusregulatoren zoals Cycline D1 (Figuur 3A) die de celcyclus door de G1-fase kunnen duwen. Interessant is dat CHIR99021 een robuuste proliferatie van vroege iPSC-CMs mogelijk maakt voor 2 passages in vergelijking met de controles(Figuur 3B). Het proliferatievermogen van iPSC-CMs neemt echter af met uitgebreide passage(figuur 3B), wat consistent is met de beperkte en goed gecontroleerde cardiale proliferatie tijdens de embryonale hartontwikkeling. Bovendien lijkt het er niet op dat CHIR99021 in staat is om de uitbreiding van meer volwassen iPSC-CMs te stimuleren wanneer ze meer dan 30 dagen differentiatie bereiken en stabiele sarcomeerstructuren ontwikkelen.

Figure 1
Figuur 1: Menselijke iPSC-herprogrammering en cardiomyocytendifferentiatie. A) Een schematisch diagram met de PBMC-laag na scheiding van bloedmonsters van patiënten. (B) Vergrote PBMC's zijn klaar voor transfectie. (C) Vroege menselijke iPSC-kolonies. D) Een vastgestelde iPSC-lijn bij passage 5. (E) Humane iPSC's zijn positief voor de pluripotentiemarkers OCT4 (groen) en NANOG (rood). Kernen worden tegengevlekt door DAPI (blauw). (F) Overzicht van een cardiomyocytendifferentiatieprotocol. (G-H) Sarcomeerstructuur van iPSC-CMs wordt onthuld door immunofluorescentiekleuring met antilichamen tegen TNNT2 (groen) en α-actinine (rood). Kernen worden tegengevlekt door DAPI (blauw). (I) FACS-analyse van iPSC-CM's met behulp van een antilichaam tegen TNNT2. Schaalstaven: 200 μm (B-D), 50 μm (E en G) en 20 μm (H). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Subtypen cardiomyocyten in humane iPSC-CMs. (A-B) Representatieve actiepotentiaalduur voor ventriculaire(A)en atriale-achtige (B) iPSC-CMs. (C) Representatieve percentages ventriculaire-, atriale- en nodaalachtige subtypen in menselijke iPSC-CM's. (D-E) D30 iPSC-CMs worden gekleurd met antilichamen tegen ventriculaire cardiomyocytmarker MYL2 (D) en atriale marker NR2F2 (E). Cellen worden tegelijkertijd gekleurd met een TNNT2-antilichaam. Kernen worden tegengevlekt door DAPI (blauw). Schaalbalken: 50 μm (D-E). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Uitbreiding van menselijke iPSC-CMs door Wnt-activering. (A) Percentage Cycline D1 positieve iPSC-CMs is verhoogd in aanwezigheid van CHIR99021. Cellen zijn dubbel gekleurd met antilichamen tegen TNNT2 (rood) en Cycline D1 (groen). Kernen worden tegengevlekt door DAPI (blauw). (B) Celnummervouw verandert tijdens de uitbreiding van menselijke iPSC-CM's met of zonder CHIR99021 in de eerste 3 passages. De Y-as toont de veranderingen in de celnummervouw. CHIR99021 stimuleert de robuuste proliferatie van vroege iPSC-CM's. Schaalbalken: 50 μm (A). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Video 1. Het verslaan van menselijke iPSC-CMs op dag 18 van differentiatie. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 2. Het verslaan van menselijke iPSC-CM's op dag 25 na metabole zuivering. Klik hier om deze video te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tijdens iPSC-herprogrammering is het van cruciaal belang om PBMC's gedurende 1 week te kweken totdat ze zijn vergroot met duidelijke kernen en cytoplasma. Omdat PBMC's zich niet vermenigvuldigen, is een geschikt celnummer voor virale transductie belangrijk voor een succesvolle iPSC-herprogrammering. Het celaantal PBMC's, de multipliciteit van infectie (MOI) en de titer van het virus moeten worden overwogen en aangepast om de optimale transductieresultaten te bereiken. Voor cardiale differentiatie is de initiële zaaidichtheid van cruciaal belang voor iPSC's om meer dan 90% confluent te bereiken op de dag dat CHIR99021 wordt toegediend. Aan de ene kant, als iPSC's minder confluent zijn op het moment van cardiale differentiatie, zal CHIR99021 toxisch zijn en leiden tot aanzienlijke celdood. Aan de andere kant, als iPSC's overconfluent zijn, zullen ze spontane differentiatie ondergaan die de efficiëntie van gerichte cardiale differentiatie in gevaar zal brengen. Voor de uitbreiding van vroege iPSC-CMs moet rekening worden gehouden met de timing en cardiomyocytenkwaliteit. Vroege iPSC-CM's kunnen zich alleen robuust vermenigvuldigen als de zuiverheid van cardiomyocyten hoog genoeg is. Bestaande niet-cardiomyocyten in de kweek kunnen zich ook vermenigvuldigen als reactie op chir99021-behandeling, wat de proliferatie van vroege iPSC-CM's negatief zal beïnvloeden. Bovendien is het cruciaal om de uitbreiding van cardiomyocyten te stimuleren op dag 20 van differentiatie. Zodra iPSC-CM's dag 30 hebben overschreden, zal het voor hen moeilijk zijn om de robuuste verdeling te hervatten.

Humane iPSC's werden aanvankelijk afgeleid van dermale en longfibroblasten via retrovirus-gemedieerde transfectie1,2. Er zijn twee belangrijke problemen met deze herprogrammeringsmethoden die de vooruitgang in klinische vertaling van patiënt-iPSC's verhinderen: 1) het retrovirus integreert in het gastheergenoom en introduceert zo potentiële genetische mutaties; 2) patiënt-afgeleide fibroblasten vereisen huidbiopten die veel patiënten kunnen afnemen. In dit protocol beschrijven we een protocol dat commerciële niet-integratie Sendai virus23 en PBMC's gebruikt om patiënt-iPSC's robuust af te leiden. Deze iPSC's zijn vrij van exogene herprogrammeringsvectoren en kunnen voor onbepaalde tijd worden gehandhaafd met zelfvernieuwing en pluripotentie. Bovendien kunnen bloedmonsters van patiënten gemakkelijk worden verzameld in klinische laboratoria. Ons protocol is veelzijdig en kan worden gebruikt voor massaproductie van patiënt- en ziektespecifieke iPSC's voor grootschalige opslagplaatsen en klinische vertalingen24.

Robuuste cardiomyocytendifferentiatie wordt bereikt door sequentiële modulatie van specifieke signaalroutes tijdens cardiale differentiatie van menselijke iPSC's. Belangrijke routes die betrokken zijn bij cardiale specificatie en proliferatie omvatten Wnt, BMP, Activine, NOTCH, VEGF en retinoïnezuur (RA) 10,12. Hier presenteren we een efficiënt cardiaal differentiatieprotocol door sequentiële modulatie van Wnt-signalering door kleine chemicaliën: eerst activering door CHIR99021 en vervolgens remming door IWR-113,14. Kleine chemicaliën zijn stabiel en geven consistente differentiatieresultaten in vergelijking met die met behulp van groeifactoren. De meeste iPSC-CMs gegenereerd door dit protocol zijn ventriculaire cardiomyocyten, gemengd met atriale en nodale cellen. Precisiegeneratie van subtypespecifieke cardiomyocyten wordt bereikt door latere differentiatiestappen10, 12te verfijnen. Toevoeging van RA onmiddellijk na IWR-1-behandeling levert bijvoorbeeld een hoog percentage atriale cardiomyocyten op, terwijl RA-remming de vorming van ventriculaire iPSC-CMsbevordert 18,22. Wnt signalerende activering in een later stadium van differentiatie bevordert de inductie van cardiale voorlopercellen tot nodaalachtige cardiomyocyten19,21, wat veelbelovend is voor de generatie van patiëntspecifieke biologische pacemakercellen.

Menselijke iPSC-CM's zijn onvolwassen en hebben een beperkt proliferatievermogen25. Tijdens de embryonale cardiale ontwikkeling verloopt de rijping terwijl de proliferatie afneemt. Er is een smal venster waarin iPSC-CM's kunnen worden gestimuleerd voor robuuste proliferatie, die een weerspiegeling is van embryonale cardiomyocytenexpansie. Hier gebruiken we een Wnt-activator CHIR99021 om de proliferatie van vroege iPSC-CMs gedurende een beperkte periode te bevorderen, wat consistent is met een recent rapport17. Er wordt gespeculeerd dat de Wnt-signaleringsroute de proliferatie van cardiomyocyten beïnvloedt, mogelijk via de overspraak met meerdere stroomopwaartse paden zoals NOTCH en Hippo26,27. NOTCH-signalering bevordert de proliferatie van cardiomyocyten, terwijl de Hippo-route de hartgroei en hartgrootte28,29,30beperkt. Het is nog onbekend hoe de interactie tussen NOTCH en Hippo de stroomafwaartse Wnt-activiteit bepaalt en een passende mate van hartproliferatie afstemt. Ons protocol heeft een interessant model voor cardiomyocytenproliferatie geleverd om ziektemechanismen van aangeboren hartafwijkingen te bestuderen die worden veroorzaakt door de hypoplasie van ventriculaire cardiomyocyten, zoals hypoplastisch linkerhartsyndroom (HLHS) en pulmonale atresie met intact ventrikelseptum (PA-IVS).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige financiële belangen te hebben.

Acknowledgments

Deze studie werd ondersteund door de American Heart Association (AHA) Career Development Award 18CDA34110293 (M-T.Z.), Additional Ventures AVIF en SVRF awards (M-T.Z.), National Institutes of Health (NIH / NHLBI) subsidies 1R01HL124245, 1R01HL132520 en R01HL096962 (I.D.). Dr. Ming-Tao Zhao werd ook ondersteund door start-upfondsen van het Abigail Wexner Research Institute in het Nationwide Children's Hospital.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABI 7300 Fast Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific
Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier Molecular Devices Microelectrode Amplifier
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
B27 supplement minus insulin Thermo Fisher Scientific A1895601
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit BD Biosciences 554714 Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer
BD Vacutainer CPT tube BD Biosciences 362753 Blood cell separation tube
CHIR99021 Selleck Chemicals S2924
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A16517 Sendai virus reprogramming kit
Digidata 1200B Axon Instruments Acquisition board
Direct-zol RNA Miniprep kit Zymo Research R2050 RNA extraction kit
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11330057
Essential 8 medium Thermo Fisher Scientific A1517001 E8 media for iPSC culture
GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 35050061 L-glutamine alternative
Growth factor reduced Matrigel Corning 356231 Basement membrane matrix
iScript cDNA Snythesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
IWR-1-endo Selleck Chemicals S7086
KnockOut Serum Replacement (KSR) Thermo Fisher Scientific 10828028
pCLAMP 7.0 Molecular Devices Electrophysiology data acquisition & analysis software
Recombinant human EPO Thermo Fisher Scientific PHC9631
Recombinant human FLT3 Thermo Fisher Scientific PHC9414
Recombinant human IL3 Peprotech 200-03
Recombinant human IL6 Thermo Fisher Scientific PHC0065
Recombinant human SCF Peprotech 300-07
RPMI 1640 medium Thermo Fisher Scientific 11875093
RPMI 1640 medium, no glucose Thermo Fisher Scientific 11879020
SlowFade Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific S36936 Mounting media
StemPro-34 SFM Thermo Fisher Scientific 10639011 PBMC culture media
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444964 qPCR master mix
TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red Thermo Fisher Scientific A1217703 CM dissociation solution
UltraPure 0.5 M EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 iPSC dissociation solution
Y-27632 2HCl Selleck Chemicals S1049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  3. Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
  4. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  5. Hinson, J. T., et al. Titin mutations in iPS cells define sarcomere insufficiency as a cause of dilated cardiomyopathy. Science. 349 (6251), 982-986 (2015).
  6. Deacon, D. C., et al. Combinatorial interactions of genetic variants in human cardiomyopathy. Nature Biomedical Engineering. 3 (2), 147-157 (2019).
  7. Gifford, C. A., et al. Oligogenic inheritance of a human heart disease involving a genetic modifier. Science. 364 (6443), 865-870 (2019).
  8. Lo Sardo, V., et al. Unveiling the role of the most impactful cardiovascular risk locus through haplotype editing. Cell. 175 (7), 1796-1810 (2018).
  9. Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
  10. Zhao, M. T., Shao, N. Y., Garg, V. Subtype-specific cardiomyocytes for precision medicine: where are we now. Stem Cells. 38, 822-833 (2020).
  11. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  12. Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: from developmental biology to therapeutic applications. Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).
  13. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  14. Zhao, M. T., et al. Molecular and functional resemblance of differentiated cells derived from isogenic human iPSCs and SCNT-derived ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 11111-11120 (2017).
  15. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  16. Lian, X., et al. Chemically defined, albumin-free human cardiomyocyte generation. Nature Methods. 12 (7), 595-596 (2015).
  17. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human ipsc-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  18. Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes develop from distinct mesoderm populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
  19. Liang, W., et al. Canonical Wnt signaling promotes pacemaker cell specification of cardiac mesodermal cells derived from mouse and human embryonic stem cells. Stem Cells. 38 (3), 352-368 (2020).
  20. Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
  21. Ren, J., et al. Canonical Wnt5b signaling directs outlying Nkx2.5+ mesoderm into pacemaker cardiomyocytes. Developmental Cell. 50 (6), 729-743 (2019).
  22. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Research. 21 (4), 579-587 (2011).
  23. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Seriers B, Physical and Biological Sciences. 85 (8), 348-362 (2009).
  24. Stacey, G. N., Crook, J. M., Hei, D., Ludwig, T. Banking human induced pluripotent stem cells: lessons learned from embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (4), 385-388 (2013).
  25. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  26. Zhao, L., Ben-Yair, R., Burns, C. E., Burns, C. G. Endocardial notch signaling promotes cardiomyocyte proliferation in the regenerating zebrafish heart through Wnt pathway antagonism. Cell Reports. 26 (3), 546-554 (2019).
  27. Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. Determinants of cardiac growth and size. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150 (2020).
  28. Campa, V. M., et al. Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).
  29. Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).
  30. Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).

Tags

Ontwikkelingsbiologie perifere mononucleaire bloedcellen PBMC's door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen iPSC's cardiale differentiatie iPSC-herprogrammering cardiomyocytenexpansie.
Generatie en uitbreiding van menselijke cardiomyocyten uit mononucleaire bloedcellen van de patiënt
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ye, S., Wan, X., Su, J., Patel, A.,… More

Ye, S., Wan, X., Su, J., Patel, A., Justis, B., Deschênes, I., Zhao, M. T. Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells. J. Vis. Exp. (168), e62206, doi:10.3791/62206 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter