scRNA-Seq 및 scATAC-Seq 를 이용한 망막 유전자 발현 및 크로마틴 접근성의 다중화 분석
Summary
여기에서, 저자들은 망막에서 전사체 및 크로마틴 접근성 프로파일을 특성화하는데 있어서 표현형 및 후속 쌍을 이룬 scRNA-seq 및 scATAC-seq 에 대한 MULTI-seq 의 유용성을 보여준다.
Abstract
강력한 차세대 시퀀싱 기술은 개발 중 및 질병 상태에서 망막 유전자 조절 네트워크가 어떻게 기능하는지 조사하기 위해 강력하고 포괄적 인 분석을 제공합니다. 단일 세포 RNA 시퀀싱을 통해 망막 발달 및 질병에서 관찰 된 유전자 발현 변화를 세포 수준에서 포괄적으로 프로파일 링 할 수 있으며 단일 세포 ATAC-Seq 는 크로마틴 접근성 및 전사 인자 결합의 분석을 유사한 해상도로 프로파일 링 할 수 있습니다. 여기에서 망막 발달에서 이러한 기술의 사용이 설명되고, 개별 샘플이 변형된 올리고뉴클레오티드-지질 복합체로 표지되는 MULTI-Seq 가 입증되며, 연구자가 개별 실험의 범위를 늘리고 비용을 실질적으로 절감할 수 있게 한다.
Introduction
유전자가 세포 운명에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 이해하는 것은 질병 및 배아 진행과 같은 과정을 심문하는 데 중요한 역할을합니다. 전사 인자와 그들의 표적 유전자 사이의 복잡한 관계는 유전자 조절 네트워크로 그룹화될 수 있다. 이러한 유전자 조절 네트워크를 진화 계통에 걸쳐 질병과 발달의 중심에 두는 증거가 늘어나고있다1. qRT-PCR과 같은 이전 기술은 단일 유전자 또는 유전자 세트에 초점을 맞추었지만 고처리량 시퀀싱 기술을 적용하면 완전한 세포 전사체의 프로파일 링이 가능합니다.
RNA-seq 는 대규모 전사체 2,3을 엿볼 수 있습니다. 단일 세포 RNA 시퀀싱 (scRNA-seq)은 조사관에게 전사체를 프로파일 링할뿐만 아니라 특정 세포 유형을 유전자 발현 프로필과 연결하는 능력을 제공합니다4. 이것은 개별 세포 프로파일을 공지된 유전자 마커5를 사용하여 분류 알고리즘으로 공급함으로써 생물 정보학적으로 달성된다. 지질-태그된 인덱스 시퀀싱(MULTI-seq)을 이용한 멀티플렉싱은 수집될 수 있는 scRNA-Seq 프로파일의 수6에서 전례 없는 다양성을 제공한다. 이러한 지질 기반 기술은 원형질막 통합(7) 대신에 표면 항원 및 높은 친화성 항체의 존재에 의존하는 세포-해싱과 같은 다른 샘플 인덱싱 기술과는 다르다. 유전자 발현 프로필을 세포 유형으로 프로파일링할 수 있을 뿐만 아니라 다른 실험을 단일 시퀀싱 라이브러리로 결합할 수 있어 개별 scRNA-seq 실험6의 비용을 획기적으로 낮출 수 있습니다. scRNA-seq 의 비용은 많은 상이한 유전자형, 상태 또는 환자 샘플이 분석되는 표현형 실험에 사용하기에 금지된 것처럼 보일 수 있지만, 멀티플렉싱은 단일 라이브러리6에서 최대 96개의 샘플의 조합을 허용한다.
scRNA-seq 를 통한 유전자 발현 프로파일링은 분자 메커니즘이 세포 운명을 어떻게 지시하는지에 대한 현재의 이해에 혁명을 일으키는 유일한 고처리량 시퀀싱 기반 기술은 아니었다. 세포에 어떤 유전자 전사체가 존재하는지 이해하면 세포 유형을 확인할 수 있지만, 게놈 조직이 발달과 질병 진행을 어떻게 조절하는지 이해하는 것도 똑같이 중요합니다. 초기 연구는 히스톤에 결합하지 않은 서열의 DNase 매개 절단을 검출 한 다음 결과 DNA 단편의 시퀀싱을 수행하여 열린 크로마틴의 영역을 확인하는 데 의존했습니다. 대조적으로, 트랜스포존 접근 가능한 크로마틴 시퀀싱 (scATAC-seq)에 대한 단일 세포 분석은 연구자가 단일 뉴클레오티드 수준8에서 개방 크로마틴을 쉽게 프로파일 링하기 위해 길들여진 트랜스포존으로 DNA를 프로브 할 수있게합니다. 이것은 scRNA-seq 와 유사한 스케일링을 거쳤으며 이제 조사관은 수천 개의 개별 게놈8에 걸쳐 개별 세포 유형 및 프로파일 표현형을 식별 할 수 있습니다.
scRNA-seq 및 scATAC-seq 의 페어링을 통해 연구원은 질병 모델 및 발달 과정 9,10,11,12에서 세포 집단, 게놈 조직 및 유전자 조절 네트워크를 결정하기 위해 수천 개의 세포를 프로파일 링 할 수있었습니다. 여기서 저자는 먼저 MULTI-seq 를 활용하여 무수한 동물 모델의 표현형을 응축하고 쌍을 이루는 scRNA-seq 및 scATAC-seq 를 사용하여 이러한 동물 모델의 크로마틴 풍경 및 규제 네트워크를 더 잘 이해하는 방법을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
MULTI-seq 의 힘은 여러 실험 조건 또는 모델의 데이터를 원활하게 통합하고 비용 및 배치 효과 제한 측면에서 엄청난 이점을 제공합니다. MULTI-seq 활용은 실험실에서 전례 없는 표현형 깊이를 제공합니다. 세포 해싱 또는 핵 해싱과 같은 비유전자 다중화 방법은 바코드된 항체 7,19,20의 사용을 통해 다중화된 샘플에 대한 문을 열었다.<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Johns Hopkins Transcriptomics와 Deep Sequencing Core의 Linda Orzolek에게 제작 된 라이브러리의 시퀀싱에 도움을 주신 것과 생체 외 망막 외 식편을 수행 한 Lizhi Jiang에게 감사드립니다.
Materials
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips | |||
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| 100 µM Barcode Solution | Request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
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| 100% Ethanol | Millipore Sigma | E7023-500ML | |
| 100% Methanol | Millipore Sigma | 322415-100ML | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 1000195 | |
| 10x Chromium controller & Accessory Kit | 10x Genomics | PN-120263 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Quality Biological | P886-229411 | |
| 40 µm FlowMi Cell Strainer | Bel-Art | H13680-0040 | |
| 50 µM Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
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| 50 µM Co-Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
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| 5200 Fragment Analyzer system | Agilent | M5310AA | |
| 70 um FlowMi cell strainer | Bel-Art | H13680-0070 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | VWR | BK392302 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Chromium Next GEM Chip G | 10x Genomics | PN-1000120 | |
| Chromium Next GEM Chip H | 10x Genomics | PN-1000161 | |
| Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1 | 10x Genomics | PN-1000175 | |
| Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 | 10x Genomics | PN-1000121 | |
| Digitonin | Fisher Scientific | BN2006 | |
| Dissection microscope | Leica | ||
| DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| Dry Ice | |||
| EVA Foam Ice Pan | Tequipment | 04393-54 | |
| FA 12-Capillary Array Short, 33 cm | Agilent | A2300-1250-3355 | |
| Fisherbrand Isotemp Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-20Q | |
| Forma CO2 Water Jacketed Incubator | ThermoFisher Scientific | 3110 | |
| Glycerol 50% Aqueous solution | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| Illumina NextSeq or NovaSeq | Illumina | ||
| Kapa Hifi Hotstart ReadyMix | HiFi | 7958927001 | |
| Low TE Buffer | Quality Biological | 351-324-721 | |
| Magnesium Chloride Solution 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes | Millipore Sigma | 20-400 | |
| Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes | 10x Genomics | NC1469069 | |
| MULTI-seq Primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| MyFuge Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | C1008 | |
| Nonidet P40 Substitute | Sigma-Aldrich | 74385 | |
| Nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9937 | |
| P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes | Eppendorf | ||
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
| PBS pH 7.4 (1X) | Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| Refridgerated Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 2231000655 | |
| RNase-free Disposable Pellet Pestles | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2615 | |
| RPI primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Single Index Kit N, Set A | 10x Genomics | PN-1000212 | |
| Single Index Kit T Set A | 10x Genomics | PN-1000213 | |
| Sodium Chloride Solution 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | |
| SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | B23318 | |
| Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| TempAssure PCR 8-tube strip | USA Scientific | 1402-4700 | |
| Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) | Corning | 25-900-CI | |
| Universal I5 primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
| Vortex Mixer | VWR | 10153-838 |
Referências
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370, (2020).
- Nagalakshmi, U., et al. The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 96 (2018).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36, 411-420 (2018).
- McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 16, 619-626 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19, 224 (2018).
- Chen, X., Miragaia, R. J., Natarajan, K. N., Teichmann, S. A. A rapid and robust method for single cell chromatin accessibility profiling. Nature Communications. 9, 5345 (2018).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. , 8598 (2020).
- Clark, B. S., et al. Single-Cell RNA-Seq Analysis of Retinal Development Identifies NFI Factors as Regulating Mitotic Exit and Late-Born Cell Specification. Neuron. 102, 1111-1126 (2019).
- Zheng, Y., et al. A human circulating immune cell landscape in aging and COVID-19. Protein Cell. 11, 740-770 (2020).
- Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37, 925-936 (2019).
- Worthington Biochemical Corporation. . Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , (2020).
- 10x Genomics. . Chromium Single Cell 3′ Reagent Kits v3 User Guide. , (2020).
- Agilent. . DNF-468 HS Genomic DNA 50 kb Kit Quick Guide for Fragment Analyzer Systems. , (2015).
- ThermoFisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kits. ThermoFisher Scientific. , (2015).
- 10x Genomics. . Chromium Single Cell ATAC Reagent Kits User Guide (v1.1 Chemistry). , (2020).
- Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Regulation of retinal neurogenesis by somatostatin signaling. bioRxiv. , (2020).
- Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14, 865-868 (2017).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10, 2907 (2019).
- Ma, S., et al. Chromatin Potential Identified by Shared Single-Cell Profiling of RNA and Chromatin. Cell. , (2020).
- Buenrostro, J. D., et al. Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation. Cell. 173, 1535-1548 (2018).
- Pliner, H. A., et al. Cicero Predicts cis-Regulatory DNA Interactions from Single-Cell Chromatin Accessibility Data. Molecular Cell. 71, 858-871 (2018).
- Granja, J. M., et al. ArchR: An integrative and scalable software package for single-cell chromatin accessibility analysis. BioRxiv. , (2020).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177, 1888-1902 (2019).
- METABRIC Group. The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups. Nature. 486, 346-352 (2012).
- Izadi, F. Differential Connectivity in Colorectal Cancer Gene Expression Network. Iranian Biomedical Journal. 23, 34-46 (2019).
