Мультиплексированный анализ экспрессии генов сетчатки и доступности хроматина с использованием scRNA-Seq и scATAC-Seq
Summary
Здесь авторы демонстрируют полезность MULTI-seq для фенотипирования и последующих пар scRNA-seq и scATAC-seq в характеристике профилей доступности транскриптома и хроматина в сетчатке.
Abstract
Мощные методы секвенирования следующего поколения предлагают надежный и всесторонний анализ для изучения того, как регуляторные сети генов сетчатки функционируют во время развития и в болезненных состояниях. Секвенирование одноклеточной РНК позволяет всесторонне профилировать изменения экспрессии генов, наблюдаемые при развитии и заболевании сетчатки на клеточном уровне, в то время как одноклеточный ATAC-Seq позволяет профилировать анализ доступности хроматина и связывания фактора транскрипции с аналогичным разрешением. Здесь описывается использование этих методов в развивающейся сетчатке и демонстрируется MULTI-Seq, где отдельные образцы маркируются модифицированным олигонуклеотид-липидным комплексом, что позволяет исследователям как увеличить объем отдельных экспериментов, так и существенно снизить затраты.
Introduction
Понимание того, как гены могут влиять на судьбу клеток, играет ключевую роль в опросе таких процессов, как болезнь и эмбриональное прогрессирование. Сложные взаимосвязи между факторами транскрипции и их генами-мишенями могут быть сгруппированы в генные регуляторные сети. Растущие доказательства помещают эти генные регуляторные сети в центр как болезни, так и развития в эволюционных линиях1. В то время как предыдущие методы, такие как qRT-PCR, были сосредоточены на одном гене или наборе генов, применение технологии высокопроизводительного секвенирования позволяет профилировать полные клеточные транскриптомы.
RNA-seq предлагает взглянуть на крупномасштабную транскриптомику 2,3. Секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq) дает исследователям возможность не только профилировать транскриптомы, но и связывать конкретные типы клеток с профилями экспрессии генов4. Это достигается биоинформатически путем подачи отдельных профилей клеток в алгоритмы сортировки с использованием известных генных маркеров5. Мультиплексирование с использованием секвенирования индексов с липидными метками (MULTI-seq) предлагает беспрецедентное разнообразие в количестве профилей scRNA-Seq, которые могут быть собраны6. Этот метод на основе липидов отличается от других методов индексации образцов, таких как хеширование клеток, которые полагаются на присутствие поверхностных антигенов и антител с высоким сродством вместо интеграции плазматической мембраны7. Мало того, что теперь можно профилировать профили экспрессии генов по типам клеток, но различные эксперименты могут быть объединены в единую библиотеку секвенирования, что значительно снижает стоимость отдельного эксперимента scRNA-seq6. Стоимость scRNA-seq может показаться непомерно высокой для использования в экспериментах по фенотипированию, где анализируется множество различных генотипов, состояний или образцов пациентов, но мультиплексирование позволяет комбинировать до 96 образцов в одной библиотеке6.
Профилирование экспрессии генов с помощью scRNA-seq было не единственным высокопроизводительным методом секвенирования, который произвел революцию в современном понимании того, как молекулярные механизмы диктуют судьбу клеток. Хотя понимание того, какие транскрипты генов присутствуют в клетке, позволяет идентифицировать тип клетки, не менее важным является понимание того, как геномная организация регулирует развитие и прогрессирование заболевания. Ранние исследования основывались на обнаружении Опосредованного ДНКазой расщепления последовательностей, не связанных с гистонами, с последующим секвенированием полученных фрагментов ДНК для идентификации областей открытого хроматина. Напротив, одноклеточный анализ для транспозонного доступного секвенирования хроматина (scATAC-seq) позволяет исследователям исследовать ДНК с помощью одомашненного транспозона, чтобы легко профилировать открытый хроматин на уровне одного нуклеотида8. Это прошло через масштабирование, аналогичное scRNA-seq, и теперь исследователи могут идентифицировать отдельные типы клеток и фенотипы профиля в тысячах отдельных геномов8.
Сочетание scRNA-seq и scATAC-seq позволило исследователям профилировать тысячи клеток для определения клеточных популяций, геномной организации и регуляторных сетей генов в моделях заболеваний и процессах развития 9,10,11,12. Здесь авторы описывают, как сначала использовать MULTI-seq для конденсации фенотипирования множества животных моделей и использовать парные scRNA-seq и scATAC-seq, чтобы лучше понять ландшафт хроматина и регуляторные сети в этих животных моделях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сила MULTI-seq проистекает из бесшовной интеграции данных из нескольких экспериментальных условий или моделей и огромной выгоды с точки зрения стоимости и ограничения пакетных эффектов. Использование MULTI-seq обеспечивает лабораторную беспрецедентную глубину фенотипирования. Негенетичес?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Линду Орзолек из Johns Hopkins Transcriptomics и Deep Sequencing Core за помощь в секвенировании созданных библиотек и Lizhi Jiang за выполнение ex vivo retinal explants.
Materials
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips | |||
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| 100 µM Barcode Solution | Request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 100% Ethanol | Millipore Sigma | E7023-500ML | |
| 100% Methanol | Millipore Sigma | 322415-100ML | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 1000195 | |
| 10x Chromium controller & Accessory Kit | 10x Genomics | PN-120263 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Quality Biological | P886-229411 | |
| 40 µm FlowMi Cell Strainer | Bel-Art | H13680-0040 | |
| 50 µM Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 50 µM Co-Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
|
| 5200 Fragment Analyzer system | Agilent | M5310AA | |
| 70 um FlowMi cell strainer | Bel-Art | H13680-0070 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | VWR | BK392302 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Chromium Next GEM Chip G | 10x Genomics | PN-1000120 | |
| Chromium Next GEM Chip H | 10x Genomics | PN-1000161 | |
| Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1 | 10x Genomics | PN-1000175 | |
| Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 | 10x Genomics | PN-1000121 | |
| Digitonin | Fisher Scientific | BN2006 | |
| Dissection microscope | Leica | ||
| DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| Dry Ice | |||
| EVA Foam Ice Pan | Tequipment | 04393-54 | |
| FA 12-Capillary Array Short, 33 cm | Agilent | A2300-1250-3355 | |
| Fisherbrand Isotemp Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-20Q | |
| Forma CO2 Water Jacketed Incubator | ThermoFisher Scientific | 3110 | |
| Glycerol 50% Aqueous solution | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| Illumina NextSeq or NovaSeq | Illumina | ||
| Kapa Hifi Hotstart ReadyMix | HiFi | 7958927001 | |
| Low TE Buffer | Quality Biological | 351-324-721 | |
| Magnesium Chloride Solution 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes | Millipore Sigma | 20-400 | |
| Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes | 10x Genomics | NC1469069 | |
| MULTI-seq Primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| MyFuge Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | C1008 | |
| Nonidet P40 Substitute | Sigma-Aldrich | 74385 | |
| Nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9937 | |
| P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes | Eppendorf | ||
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
| PBS pH 7.4 (1X) | Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| Refridgerated Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 2231000655 | |
| RNase-free Disposable Pellet Pestles | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2615 | |
| RPI primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Single Index Kit N, Set A | 10x Genomics | PN-1000212 | |
| Single Index Kit T Set A | 10x Genomics | PN-1000213 | |
| Sodium Chloride Solution 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | |
| SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | B23318 | |
| Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| TempAssure PCR 8-tube strip | USA Scientific | 1402-4700 | |
| Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) | Corning | 25-900-CI | |
| Universal I5 primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
| Vortex Mixer | VWR | 10153-838 |
Referências
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370, (2020).
- Nagalakshmi, U., et al. The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 96 (2018).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36, 411-420 (2018).
- McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 16, 619-626 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19, 224 (2018).
- Chen, X., Miragaia, R. J., Natarajan, K. N., Teichmann, S. A. A rapid and robust method for single cell chromatin accessibility profiling. Nature Communications. 9, 5345 (2018).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. , 8598 (2020).
- Clark, B. S., et al. Single-Cell RNA-Seq Analysis of Retinal Development Identifies NFI Factors as Regulating Mitotic Exit and Late-Born Cell Specification. Neuron. 102, 1111-1126 (2019).
- Zheng, Y., et al. A human circulating immune cell landscape in aging and COVID-19. Protein Cell. 11, 740-770 (2020).
- Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37, 925-936 (2019).
- Worthington Biochemical Corporation. . Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , (2020).
- 10x Genomics. . Chromium Single Cell 3′ Reagent Kits v3 User Guide. , (2020).
- Agilent. . DNF-468 HS Genomic DNA 50 kb Kit Quick Guide for Fragment Analyzer Systems. , (2015).
- ThermoFisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kits. ThermoFisher Scientific. , (2015).
- 10x Genomics. . Chromium Single Cell ATAC Reagent Kits User Guide (v1.1 Chemistry). , (2020).
- Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Regulation of retinal neurogenesis by somatostatin signaling. bioRxiv. , (2020).
- Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14, 865-868 (2017).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10, 2907 (2019).
- Ma, S., et al. Chromatin Potential Identified by Shared Single-Cell Profiling of RNA and Chromatin. Cell. , (2020).
- Buenrostro, J. D., et al. Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation. Cell. 173, 1535-1548 (2018).
- Pliner, H. A., et al. Cicero Predicts cis-Regulatory DNA Interactions from Single-Cell Chromatin Accessibility Data. Molecular Cell. 71, 858-871 (2018).
- Granja, J. M., et al. ArchR: An integrative and scalable software package for single-cell chromatin accessibility analysis. BioRxiv. , (2020).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177, 1888-1902 (2019).
- METABRIC Group. The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups. Nature. 486, 346-352 (2012).
- Izadi, F. Differential Connectivity in Colorectal Cancer Gene Expression Network. Iranian Biomedical Journal. 23, 34-46 (2019).
