Análisis multiplexado de la expresión génica de la retina y la accesibilidad a la cromatina utilizando scRNA-Seq y scATAC-Seq
Summary
Aquí, los autores muestran la utilidad de MULTI-seq para fenotipar y posteriormente emparejar scRNA-seq y scATAC-seq en la caracterización de los perfiles de accesibilidad transcriptómica y cromatina en la retina.
Abstract
Las potentes técnicas de secuenciación de próxima generación ofrecen un análisis sólido y completo para investigar cómo funcionan las redes reguladoras de genes de la retina durante el desarrollo y en los estados de enfermedad. La secuenciación de ARN unicelular nos permite perfilar de forma exhaustiva los cambios en la expresión génica observados en el desarrollo de la retina y la enfermedad a nivel celular, mientras que el ATAC-Seq unicelular permite perfilar el análisis de la accesibilidad a la cromatina y la unión al factor de transcripción a una resolución similar. Aquí se describe el uso de estas técnicas en la retina en desarrollo, y se demuestra MULTI-Seq, donde las muestras individuales se etiquetan con un complejo oligonucleótido-lípido modificado, lo que permite a los investigadores aumentar el alcance de los experimentos individuales y reducir sustancialmente los costos.
Introduction
Comprender cómo los genes pueden influir en el destino celular juega un papel clave en el interrogatorio de procesos como la enfermedad y la progresión embrionaria. Las complejas relaciones entre los factores de transcripción y sus genes diana se pueden agrupar en redes reguladoras de genes. La creciente evidencia coloca estas redes reguladoras de genes en el centro de la enfermedad y el desarrollo a través de los linajes evolutivos1. Mientras que las técnicas anteriores, como la qRT-PCR, se centraban en un solo gen o conjunto de genes, la aplicación de la tecnología de secuenciación de alto rendimiento permite el perfil de transcriptomas celulares completos.
RNA-seq ofrece una visión de la transcriptómica a gran escala 2,3. La secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) brinda a los investigadores la capacidad no solo de perfilar transcriptomas, sino también de vincular tipos celulares específicos con perfiles de expresión génica4. Esto se logra bioinformáticamente alimentando perfiles celulares individuales en algoritmos de clasificación utilizando marcadores genéticos conocidos5. La multiplexación mediante secuenciación de índices marcados con lípidos (MULTI-seq) ofrece una diversidad sin precedentes en el número de perfiles scRNA-Seq que se pueden recoger6. Esta técnica basada en lípidos difiere de otras técnicas de indexación de muestras, como el hashing celular, que se basan en la presencia de antígenos de superficie y anticuerpos de alta afinidad en lugar de la integración de la membrana plasmática7. Ahora no solo es posible perfilar los perfiles de expresión génica en tipos de células, sino que se pueden combinar diferentes experimentos en una sola biblioteca de secuenciación, lo que reduce drásticamente el costo de un experimento individual de scRNA-seq6. El costo de scRNA-seq puede parecer prohibitivo para su uso en experimentos de fenotipado donde se analizan muchos genotipos, condiciones o muestras de pacientes diferentes, pero la multiplexación permite la combinación de hasta 96 muestras en una sola biblioteca6.
El perfil de la expresión génica a través de scRNA-seq no ha sido la única técnica basada en secuenciación de alto rendimiento que revoluciona la comprensión actual de cómo los mecanismos moleculares dictan el destino celular. Si bien comprender qué transcripciones de genes están presentes en una célula permite la identificación del tipo de célula, igualmente importante es comprender cómo la organización genómica regula el desarrollo y la progresión de la enfermedad. Los primeros estudios se basaron en la detección de la escisión mediada por DNasa de secuencias no unidas a histonas, seguida de la secuenciación de los fragmentos de ADN resultantes para identificar regiones de cromatina abierta. Por el contrario, el ensayo de una sola célula para la secuenciación de cromatina accesible de transposones (scATAC-seq) permite a los investigadores sondear el ADN con un transposón domesticado para perfilar fácilmente la cromatina abierta en el nivel de nucleótido único8. Esto ha pasado por una escala similar a scRNA-seq y ahora los investigadores pueden identificar tipos de células individuales y perfilar fenotipos en miles de genomas individuales8.
El emparejamiento de scRNA-seq y scATAC-seq ha permitido a los investigadores la capacidad de perfilar miles de células para determinar poblaciones celulares, organización genómica y redes reguladoras de genes en modelos de enfermedades y procesos de desarrollo 9,10,11,12. Aquí, los autores describen cómo utilizar primero MULTI-seq para condensar el fenotipado de una miríada de modelos animales y emplear scRNA-seq y scATAC-seq pareados para obtener una mejor comprensión del paisaje de la cromatina y las redes reguladoras en estos modelos animales.
Protocol
Representative Results
Discussion
El poder de MULTI-seq se deriva de la integración perfecta de datos de múltiples condiciones o modelos experimentales y el enorme beneficio en términos de costo y limitación de los efectos de lote. La utilización de MULTI-seq ofrece una profundidad de fenotipado de laboratorio sin precedentes. Los métodos de multiplexación no genéticos como el hashing celular o el hashing de núcleos abrieron la puerta a muestras multiplexadas mediante el uso de anticuerpos con código de barras…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Linda Orzolek del Johns Hopkins Transcriptomics and Deep Sequencing Core por su ayuda en la secuenciación de las bibliotecas producidas y a Lizhi Jiang por realizar los explantes de retina ex vivo .
Materials
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette filter tips | |||
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| 100 µM Barcode Solution | Request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
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| 100% Ethanol | Millipore Sigma | E7023-500ML | |
| 100% Methanol | Millipore Sigma | 322415-100ML | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 1000195 | |
| 10x Chromium controller & Accessory Kit | 10x Genomics | PN-120263 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Quality Biological | P886-229411 | |
| 40 µm FlowMi Cell Strainer | Bel-Art | H13680-0040 | |
| 50 µM Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
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| 50 µM Co-Anchor Solution | Sigma or request from Gartner lab | https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897&edit_requested =true |
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| 5200 Fragment Analyzer system | Agilent | M5310AA | |
| 70 um FlowMi cell strainer | Bel-Art | H13680-0070 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | VWR | BK392302 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Chromium Next GEM Chip G | 10x Genomics | PN-1000120 | |
| Chromium Next GEM Chip H | 10x Genomics | PN-1000161 | |
| Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1 | 10x Genomics | PN-1000175 | |
| Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 | 10x Genomics | PN-1000121 | |
| Digitonin | Fisher Scientific | BN2006 | |
| Dissection microscope | Leica | ||
| DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| Dry Ice | |||
| EVA Foam Ice Pan | Tequipment | 04393-54 | |
| FA 12-Capillary Array Short, 33 cm | Agilent | A2300-1250-3355 | |
| Fisherbrand Isotemp Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-20Q | |
| Forma CO2 Water Jacketed Incubator | ThermoFisher Scientific | 3110 | |
| Glycerol 50% Aqueous solution | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| Illumina NextSeq or NovaSeq | Illumina | ||
| Kapa Hifi Hotstart ReadyMix | HiFi | 7958927001 | |
| Low TE Buffer | Quality Biological | 351-324-721 | |
| Magnesium Chloride Solution 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Magnetic Separator Rack for 1.5 mL tubes | Millipore Sigma | 20-400 | |
| Magnetic Separator Rack for 200 µL tubes | 10x Genomics | NC1469069 | |
| MULTI-seq Primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| MyFuge Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | C1008 | |
| Nonidet P40 Substitute | Sigma-Aldrich | 74385 | |
| Nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9937 | |
| P2, P10, P20, P200, P1000 micropipettes | Eppendorf | ||
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
| PBS pH 7.4 (1X) | Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| Refridgerated Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 2231000655 | |
| RNase-free Disposable Pellet Pestles | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2615 | |
| RPI primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Single Index Kit N, Set A | 10x Genomics | PN-1000212 | |
| Single Index Kit T Set A | 10x Genomics | PN-1000213 | |
| Sodium Chloride Solution 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | |
| SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | B23318 | |
| Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| TempAssure PCR 8-tube strip | USA Scientific | 1402-4700 | |
| Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) | Corning | 25-900-CI | |
| Universal I5 primer | Sigma or IDT | See sequence list | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
| Vortex Mixer | VWR | 10153-838 |
Referências
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