Analisi comparativa di metodi sperimentali per quantificare l'attività animale in modelli di caenorhabditis elegans della malattia mitocondriale

Summary

Questo studio presenta protocolli per due approcci di analisi dell’attività locomotoria semi-automatizzati nei vermi del gas-1della malattia di C. elegans complesso I(fc21),vale a dire ZebraLab (un saggio a medio rendimento) e WormScan (un saggio ad alto rendimento) e fornisce analisi comparative tra una vasta gamma di metodi di ricerca per quantificare il comportamento dei nematodi e la funzione neuromuscolare integrata.

Abstract

Caenorhabditis elegans è ampiamente riconosciuta per la sua utilità centrale come modello animale traslazionale per interrogare in modo efficiente meccanismi e terapie di diverse malattie umane. I vermi sono particolarmente adatti per gli screening genetici e farmacologici ad alto rendimento per ottenere una visione più approfondita degli obiettivi terapeutici e delle terapie sfruttando il loro ciclo di sviluppo rapido, le grandi dimensioni della covata, la breve durata della vita, la trasparenza microscopica, i bassi costi di manutenzione, la robusta suite di strumenti genomici, i repository mutanti e le metodologie sperimentali per interrogare la fisiologia sia in vivo che ex vivo. L’attività locomotoria del verme rappresenta un fenotipo particolarmente rilevante che è frequentemente compromesso nella malattia mitocondriale, che è altamente eterogenea nelle cause e nelle manifestazioni, ma condivide collettivamente una ridotta capacità di produrre energia cellulare. Mentre una suite di metodologie diverse può essere utilizzata per interrogare il comportamento dei worm, queste variano notevolmente in termini di costi sperimentali, complessità e utilità per schermi genomici o ad alto rendimento dei farmaci. Qui, sono stati confrontati il throughput relativo, i vantaggi e i limiti di 16 diverse metodologie di analisi dell’attività che quantificano la locomozione dei nematodi, il thrashing, il pompaggio faringeo e / o la chemiotassi in singoli vermi o popolazioni di vermi di C. elegans in diversi stadi, età e durate sperimentali. Sono stati dimostrati protocolli dettagliati per due metodi semi-automatizzati per quantificare l’attività locomotoria dei nematodi che rappresentano nuove applicazioni degli strumenti software disponibili, vale a dire ZebraLab (un approccio a medio rendimento) e WormScan (un approccio ad alto rendimento). I dati derivanti dall’applicazione di questi metodi hanno dimostrato gradi simili di ridotta attività animale verificatisi allo stadio larvale L4 e progrediti negli adulti del giorno 1, nella malattia mitocondriale del complesso I (gas-1(fc21)) rispetto ai vermi mutanti wild-type (N2 Bristol) C. elegans. Questi dati convalidano l’utilità per queste nuove applicazioni di utilizzare gli strumenti software ZebraLab o WormScan per quantificare l’attività locomotoria dei vermi in modo efficiente e oggettivo, con capacità variabile di supportare lo screening farmacologico ad alto rendimento sul comportamento dei vermi in modelli animali preclinici di malattia mitocondriale.

Introduction

Caenorhabiditis elegans è ampiamente riconosciuto come un modello eccezionale nelle neuroscienze basato sul fatto che ha 302 neuroni che coordinano tutti i comportamenti dei vermi, tra cui accoppiamento, alimentazione, deposizione delle uova, defecazione, nuoto e locomozione su mezzi solidi¹. Questi nematodi ermafroditi sono anche ampiamente utilizzati per comprendere una vasta gamma di meccanismi di malattia umana, resi possibili dal suo genoma ben caratterizzato e dall’elevata omologia di ~ 80% di geni tra C. elegans e gli esseri umani^2,3,4. C. elegans è stato a lungo usato per interrogare la malattia mitocondriale umana^5,6,7,8^,9,10, che è un gruppo altamente geneticamente e fenotipicamente eterogeneo di disturbi metabolici ereditari che condividono la ridotta capacità di generare energia cellulare e spesso clinicamente presenti con funzionalità neuromuscolare sostanzialmente compromessa, intolleranza all’esercizio fisico e affaticamento^{11 ,12,13,14}. A tal fine, l’uso di modelli di C. elegans consente la modellazione preclinica degli aspetti quantitativi dell’attività animale e della funzione neuromuscolare in diversi sottotipi genetici di malattia mitocondriale, nonché la loro risposta a terapie candidate che possono migliorare la loro funzione neuromuscolare e l’attività complessiva.

L’attività neuromuscolare in C. elegans è oggettivamente misurabile da una serie di metodologie sperimentali, tra cui approcci sia manuali che semi-automatizzati che consentono analisi funzionali in mezzi solidi o liquidi(Tabella 1)^1,15. L’accurata quantificazione dell’attività di C. elegans si è rivelata importante per consentire scoperte relative alla funzione e allo sviluppo del sistema muscolare e nervoso^16,17,18. Questo studio riassume e confronta i requisiti sperimentali, i vantaggi e le limitazioni di 17 diversi saggi che possono essere eseguiti nei laboratori di ricerca per valutare la funzione e l’attività neuromuscolare su quattro risultati chiave nei modelli di malattie di C. elegans, sia al basale in una serie di stadi di sviluppo ed età, sia in risposta alle terapie candidate (Tabella 1 ). In effetti, lo studio fornisce una panoramica dettagliata della gamma di approcci sperimentali disponibili per caratterizzare i tassi di C. elegans thrashing (curve corporee al minuto), l’attività locomotoria, il pompaggio faringeo e la chemiotassi, specificando in ogni caso la metodologia sperimentale e analitica utilizzata, i vantaggi e i limiti di ciascun metodo, le attrezzature e il software necessari per eseguire e analizzare ciascun test, e la capacità di produzione di ciascun metodo di sostenerne l’uso a fini di screening genetico o farmacologico ad alto rendimento. La capacità di throughput di ciascun test è descritta come bassa, media o alta in base alla complessità del protocollo sperimentale, compresa la manutenzione del worm, il tempo di elaborazione, l’uso di piastre a singolo o multi-pozzo e / o il tempo dello sperimentatore necessario per completare l’impostazione sperimentale e le analisi dei dati.

Le analisi manuali di thrashing^19,attività locomotoria^20,pompaggio faringeo^17,21,e chemiotassi^22,23 sono metodologie consolidate per valutare l’attività dei vermi che richiedono uno stereomicroscopio^24. Mentre la misurazione dell’attività di thrashing dei vermi richiede l’analisi in mezzi liquidi per determinare la frequenza delle curve corporee al minuto, l’attività locomotoria dei vermi può essere misurata su mezzi solidi o in mezzi liquidi. Tuttavia, le analisi manuali dell’attività dei singoli worm richiedono intrinsecamente molto tempo e comportano inevitabili pregiudizi generati dall’utente. L’automazione delle analisi dell’attività dei worm riduce al minimo i pregiudizi generati dall’utente e può aumentare notevolmente il throughput sperimentale²⁵. Le registrazioni video dell’attività di worm thrashing in media liquidi possono essere analizzate utilizzando wrMTrck, un plugin ImageJ²⁶. Tuttavia, le impostazioni sperimentali originali sviluppate per wrMTrck ne limitavano l’utilità, poiché troppi worm in una singola goccia di liquido portavano alla sovrapposizione di vermi che rendevano difficile il tracciamento accurato. Sebbene questa limitazione sperimentale sia stata risolta²⁷, il metodo wrMTrck non è in grado di supportare lo screening ad alta produttività.

Esiste una serie di metodi per quantificare l’attività locomotoria del verme al basale e in risposta alle terapie candidate in modelli di malattia mitocondriale di C. elegans. Questi includono ZebraLab (ViewPoint Life Sciences), Tierpsy Tracker²⁸, wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP)²⁹, WormMotel, WormWatcher³⁰, WormLab³¹, Infinity Chip³²e WMicrotracker One³³ (Tabella 1). Questi metodi consentono l’analisi simultanea della locomozione in più ceppi o condizioni di vermi, in genere su piastre multi-pozzo, supportando così applicazioni di screening farmacologico a più alto rendimento. Alcuni di questi metodi hanno considerazioni uniche che possono limitare o migliorare la loro utilità generale, come la necessità di apparecchiature costose rispetto al software ad accesso aperto e la diversa facilità di esecuzione dei protocolli sperimentali. Nel complesso, nessun singolo sistema o protocollo sperimentale è ideale per tutti gli esperimenti di attività locomotoria di C. elegans. Piuttosto, è importante scegliere attentamente quale metodo è più adatto agli obiettivi e ai requisiti sperimentali dello specifico investigatore.

Il pompaggio faringeo rappresenta un altro importante risultato per valutare l’attività neuromuscolare in C. elegans. La faringe di C. elegans è composta da 20 cellule muscolari, 20 neuroni e altre 20 cellule che consentono l’ingestione di Escherichia coli (E. coli) all’estremità anteriore del tratto alimentare del verme^34,35,36. Sono stati stabiliti diversi metodi manuali per determinare le velocità di pompaggio faringeo^17,21,37,38. La maggior parte dei metodi si basa sull’uso di uno stereomicroscopio e di una telecamera per visualizzare e registrare la frequenza di pompaggio faringeo con conteggio diretto da parte dell’osservatore sperimentale²¹. L’analisi automatizzata della velocità di pompaggio faringeo è possibile eseguendo una registrazione extracellulare denominata elettrofaringeogramma (EPG), che fornisce ulteriori informazioni sulla durata di ciascuna pompa³⁹. L’analisi della velocità di pompaggio faringea è possibile anche in un sistema microfluidico, WormSpa, dove i singoli vermi sono confinati nelle camere^40,41. Un metodo commerciale disponibile per facilitare l’analisi della velocità della pompa faringea è il sistema ScreenChip (InVivo Biosystems), che misura, visualizza e analizza gli aspetti neuromuscolari del comportamento alimentare in un singolo verme immobilizzato in un chip personalizzato. Questo approccio di quantificazione del pompaggio faringeo può essere utilizzato per valutare le risposte sia neuronali che fisiologiche ai farmaci, all’invecchiamento e ad altri fattori^42,43,44,45.

La chemiotassi descrive il movimento di C. elegans in risposta a un odorante posto lontano dai vermi in un’area definita della piastra del mezzo di crescita dei nematodi (NGM). La valutazione della risposta alla chemiotassi fornisce una misura integrata dell’attività neuronale e neuromuscolare del verme che è quantificabile osservando e misurando la distanza fisica percorsa dai vermi verso l’odorante in un periodo di tempo definito⁴⁶. Il Multi-Worm Tracker è un metodo automatico che può essere utilizzato per migliorare l’efficienza sperimentale di quantificazione della distanza percorsa dai vermi verso un attrattivo o da un repellente⁴⁷.

Qui viene descritto il protocollo dettagliato per due nuovi metodi semi-automatizzati stabiliti per quantificare l’attività dei worm. Il primo approccio utilizza ZebraLab, un software commerciale originariamente sviluppato per studiare l’attività di nuoto di Danio rerio (zebrafish), per una nuova applicazione a medio rendimento per quantificare l’attività locomotoria complessiva nei mezzi liquidi di C. elegans in base ai cambiamenti dei pixel durante il movimento (Tabella 1, Figura 1). L’output dei dati viene ottenuto rapidamente da un gran numero di condizioni e campioni simultanei analizzati su un vetrino, sebbene questo metodo non sia adatto a un formato di piastra multi-pozzo. Il secondo approccio è un nuovo adattamento della metodologia WormScan^48,49 ( Figura2), che utilizza uno scanner piano per creare un’immagine differenziale di due scansioni sequenziali che possono essere utilizzate in modo variabile con software open source per consentire l’analisi quantitativa semi-automatizzata di risultati fisiologici integrati come la fecondità e la sopravvivenza. Qui è stato sviluppato un nuovo adattamento ad alto rendimento della metodologia WormScan per quantificare l’attività locomotoria dei vermi in mezzi liquidi in popolazioni di quindici vermi allo stadio larvale 4 (L4) per pozzetti di una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. Questa metodologia WormScan semi-automatizzata e a basso costo può essere facilmente adattata a schermi di farmaci ad alto rendimento, nonché ad analisi di vari stadi animali e di età^{compresa tra 48e49 anni.}

Qui, il protocollo e l’efficacia dell’analisi dell’attività locomotoria di C. elegans utilizzando sia i metodi semi-automatizzati ZebraLab che WormScan sono dimostrati in un modello ben consolidato di C. elegans per la malattia del complesso mitocondriale I, gas-1(fc21). gas-1 (gene K09A9.5) è un ortologo di NDUFS2 umano (NADH: nucleo di ubichinone ossidoreduttasi (proteina ferro-zolfo) subunità 2) (Figura 3). Il ceppo mutante C. elegans gas-1(fc21) porta una mutazione omozigote p.R290K missenso nell’ortologo umano di NDUFS2⁵⁰, causando una significativa diminuzione della fecondità e della durata della vita, compromissione della capacità di fosforilazione ossidativa della catena respiratoria (OXPHOS)⁵¹, nonché diminuzione della massa mitocondriale e del potenziale di membrana con aumento dello stress ossidativo^5,8 . Nonostante il suo uso consolidato negli ultimi due decenni per studiare la malattia mitocondriale, l’attività locomotoria dei mutanti gassosi 1(fc21)non è stata precedentemente segnalata. Qui, i metodi ZebraLab e WormScan sono stati applicati per quantificare in modo indipendente l’attività locomotoria del gas-1(fc21)rispetto ai vermi wild-type (WT, N2 Bristol), sia come un modo per convalidare i metodi, sia per dimostrare la loro utilità comparativa ed efficienza dei protocolli sperimentali e delle analisi informatiche. Il software ZebraLab ha permesso una rapida quantificazione di diverse condizioni simultanee di attività locomotoria del verme in modelli di malattia mitocondriale di C. elegans, con potenziale applicazione per lo screening mirato dei farmaci o studi di convalida. L’analisi wormScan, in particolare, è adatta per abilitare prontamente screening farmacologici ad alto rendimento di librerie di composti e dare priorità ai lead che migliorano la funzione neuromuscolare animale e l’attività locomotoria nei modelli preclinici di C. elegans della malattia mitocondriale primaria.

Protocol

1. Analisi dell’attività locomotoria worm in mezzi liquidi su vetrini utilizzando il software ZebraLab Crescita e manipolazione dei nematodi Coltivare C. elegans su piastre di Petri contenenti mezzi di crescita di nematodi (NGM) e diffondersi con Escherichia coli OP50 come fonte di cibo. Mantenere la coltura di vermi a 20 °C, come descritto in precedenza8. Sincronizza i vermi eseguendo un uovo a tempodea 52 e studia i vermi n…

Representative Results

L’analisi dell’attività locomotoria di C. elegans nel mezzo liquido potrebbe facilmente catturare un fenotipo integrato di modelli di vermi della malattia mitocondriale che potrebbero non essere facilmente quantificabili su mezzi solidi. ZebraLab è stato utilizzato per quantificare l’attività locomotoria del ceppo ben consolidato di gas-1della malattia mitocondriale I(fc21)rispetto ai WTworms in mezzi liquidi allo stadio larvale L4. L’attività di 5 vermi in una singola goccia liquida è sta…

Discussion

Qui, lo studio ha riassunto informazioni dettagliate e razionali per studiare l’attività neuromuscolare di C. elegans a livello di risultati diversi, tra cui il worm thrashing, la locomozione, il pompaggio faringeo e la chemiotassi. Il confronto di 16 diverse metodologie di analisi dell’attività è stato eseguito in termini di throughput relativo, vantaggi e limiti di quantificare le attività dei nematodi in una singola popolazione di vermi o vermi a diverse età e durate sperimentali. Tra questi, sono stati …

Materials

C. elegans wild isolate	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	N2 Bristol
Camera	Olympus	DP73
gas-1(fc-21)	CGC	CW152
Microscope slides	ThermoFisher	4951PLUS
Nematode Growth Medium (NGM)	Research Products International Corp.	N81800-1000.0
OP50 Escherichia coli	CGC		Uracil auxotroph E. coli strain
Petri dishes (60 mm)	VWR international	25373-085
S. Basal	VWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4, and 5 mg cholesterol, in 1 l H2O	VWR 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660
Scanner	EPSON	V800
Stereomicroscope	Olympus	MVX10 microscope
96-well flat bottom	VWR international	29442-056
WormScan software	Mathew et al. 45	S1 Standalone Java platform	Software for automation of difference image of scanned plates
ZebraLab software	ViewPoint		Software for automated quantization and tracking of zebrafish behavior, designed by ViewPoint (http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening) and here applied to C. elegans. This system is applicable for high-throughput behavioral analysis