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Comportamento

Análisis comparativo de métodos experimentales para cuantificar la actividad animal en modelos de enfermedad mitocondrial de Caenorhabditis elegans

Published: April 04, 2021
doi:
10.3791/62244
, , , ,
1Mitochondrial Medicine Frontier Program, Division of Human Genetics, Department of Pediatrics,The Children’s Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics,University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

Summary

Este estudio presenta protocolos para dos enfoques semiautomatizado de análisis de actividad locomotora en gusanos gas-1(fc21)de la enfermedad de C. elegans complejo I, a saber, ZebraLab (un ensayo de rendimiento medio) y WormScan (un ensayo de alto rendimiento) y proporcionan un análisis comparativo entre una amplia gama de métodos de investigación para cuantificar el comportamiento de los nematodos y la función neuromuscular integrada.

Abstract

Caenorhabditis elegans es ampliamente reconocido por su utilidad central como modelo animal traslacional para interrogar eficientemente los mecanismos y terapias de diversas enfermedades humanas. Los gusanos son particularmente adecuados para pantallas genéticas y farmacológicas de alto rendimiento para obtener una visión más profunda de las dianas terapéuticas y las terapias al explotar su rápido ciclo de desarrollo, gran tamaño de cría, corta vida útil, transparencia microscópica, bajos costos de mantenimiento, conjunto robusto de herramientas genómicas, repositorios de mutantes y metodologías experimentales para interrogar la fisiología in vivo y ex vivo. La actividad locomotora del gusano representa un fenotipo particularmente relevante que con frecuencia se ve afectado en la enfermedad mitocondrial, que es altamente heterogénea en causas y manifestaciones, pero colectivamente comparte una capacidad deteriorada para producir energía celular. Si bien se puede usar un conjunto de metodologías diferentes para interrogar el comportamiento de los gusanos, estas varían mucho en costos experimentales, complejidad y utilidad para las pantallas genómicas o de alto rendimiento de medicamentos. Aquí, se compararon el rendimiento relativo, las ventajas y las limitaciones de 16 metodologías diferentes de análisis de actividad que cuantifican la locomoción de nematodos, la golpiza, el bombeo faríngeo y / o la quimiotaxis en gusanos individuales o poblaciones de gusanos de C. elegans en diferentes etapas, edades y duraciones experimentales. Se demostraron protocolos detallados para dos métodos semiautomatizados para cuantificar la actividad locomotora de los nematodos que representan nuevas aplicaciones de las herramientas de software disponibles, a saber, ZebraLab (un enfoque de rendimiento medio) y WormScan (un enfoque de alto rendimiento). Los datos de la aplicación de estos métodos demostraron grados similares de actividad animal reducida que ocurrieron en la etapa larvaria L4, y progresaron en adultos del día 1, en la enfermedad mitocondrial del complejo I (gas-1(fc21) )gusanos mutantes en relación con el tipo salvaje (N2 Bristol) C. elegans. Estos datos validan la utilidad para estas nuevas aplicaciones del uso de las herramientas de software ZebraLab o WormScan para cuantificar la actividad locomotora del gusano de manera eficiente y objetiva, con capacidad variable para apoyar la detección de fármacos de alto rendimiento en el comportamiento de los gusanos en modelos animales preclínicos de enfermedad mitocondrial.

Introduction

Caenorhabiditis elegans es ampliamente reconocido como un modelo sobresaliente en neurociencia basado en que tiene 302 neuronas que coordinan todos los comportamientos de los gusanos, incluido el apareamiento, la alimentación, la puesta de huevos, la defecación, la natación y la locomoción en medios sólidos1. Estos nematodos hermafroditas también se utilizan ampliamente para comprender una amplia gama de mecanismos de enfermedades humanas, lo que es posible gracias a su genoma bien caracterizado y su alta homología de ~ 80% de genes entre C. elegans y humanos2,3,4. C. elegans se ha utilizado durante mucho tiempo para interrogar la enfermedad mitocondrial humana5,6,7,8,9,10,que es un grupo altamente heterogéneo genética y fenotípicamente heterogéneo de trastornos metabólicos hereditarios que comparten una capacidad deteriorada para generar energía celular y, a menudo, clínicamente presentes con una función neuromuscular sustancialmente deteriorada, intolerancia al ejercicio y fatiga11 ,12,13,14. Con este fin, el uso de modelos de C. elegans permite el modelado preclínico de aspectos cuantitativos de la actividad animal y la función neuromuscular en diferentes subtipos genéticos de enfermedad mitocondrial, así como su respuesta a terapias candidatas que pueden mejorar su función neuromuscular y actividad general.

La actividad neuromuscular en C. elegans es objetivamente medible por una serie de metodologías experimentales, incluyendo enfoques manuales y semiautomatizados que permiten análisis funcionales en medios sólidos o líquidos(Tabla 1)1,15. La cuantificación precisa de la actividad de C. elegans ha demostrado ser importante para permitir descubrimientos relacionados con la función y el desarrollo del sistema muscular y nervioso16,17,18. Este estudio resume y compara los requisitos experimentales, las ventajas y las limitaciones de 17 ensayos diferentes que se pueden realizar en laboratorios de investigación para evaluar la función y la actividad neuromuscular en cuatro resultados clave en modelos de enfermedades por C. elegans, tanto al inicio en un rango de etapas y edades de desarrollo como en respuesta a terapias candidatas (Tabla 1 ). De hecho, el estudio proporciona una visión detallada de la gama de enfoques experimentales disponibles para caracterizar las tasas de golpeo de C. elegans (curvas corporales por minuto), la actividad locomotora, el bombeo faríngeo y la quimiotaxis, en cada caso especificando la metodología experimental y analítica utilizada, las ventajas y limitaciones de cada método, el equipo y el software necesarios para realizar y analizar cada ensayo, y la capacidad de rendimiento de cada método para apoyar su uso con fines de detección genética o de drogas de alto rendimiento. La capacidad de rendimiento de cada ensayo se describe como baja, media o alta en función de la complejidad del protocolo experimental, incluido el mantenimiento del gusano, el tiempo de procesamiento, el uso de placas de uno o varios pozos y / o el tiempo del experimentador necesario para completar el entorno experimental y los análisis de datos.

Los análisis manuales de thrashing19,actividad locomotora20,bombeo faríngeo17,21y quimiotaxis22, 23 son metodologías bien establecidas para evaluar la actividad de los gusanos que requieren un estereomicroscopio24. Mientras que la medición de la actividad de los gusanos requiere un análisis en medios líquidos para determinar la frecuencia de las curvas del cuerpo por minuto, la actividad locomotora del gusano se puede medir en medios sólidos o en medios líquidos. Sin embargo, los análisis manuales de la actividad individual del gusano son intrínsecamente lentos e implican un sesgo inevitable generado por el usuario. La automatización de los análisis de actividad de gusanos minimiza el sesgo generado por el usuario y puede aumentar en gran medida el rendimiento experimental25. Las grabaciones de video de la actividad de golpeo de gusanos en medios líquidos se pueden analizar utilizando wrMTrck, un complemento de ImageJ26. Sin embargo, la configuración experimental original que se desarrolló para wrMTrck limitó su utilidad, ya que demasiados gusanos en una sola gota líquida llevaron a la superposición de gusanos que dificultaron el seguimiento preciso. Si bien esta limitación experimental se ha resuelto27, el método wrMTrck no es capaz de soportar la detección de alto rendimiento.

Existe una variedad de métodos para cuantificar la actividad locomotora del gusano al inicio y en respuesta a las terapias candidatas en modelos de enfermedad mitocondrial de C. elegans. Estos incluyen ZebraLab (ViewPoint Life Sciences), Tierpsy Tracker28,amplia plataforma de seguimiento de nematodos de campo de visión (WF-NTP)29,WormMotel, WormWatcher30,WormLab31,Infinity Chip32y WMicrotracker One33 (Tabla 1). Estos métodos permiten el análisis simultáneo de la locomoción en múltiples cepas o condiciones de gusanos, generalmente en placas de múltiples pozos, lo que respalda aplicaciones de detección de fármacos de mayor rendimiento. Algunos de estos métodos tienen consideraciones únicas que pueden limitar o mejorar su utilidad general, como la necesidad de equipos costosos en comparación con el software de acceso abierto, y la facilidad variable de realizar protocolos experimentales. En general, ningún sistema o protocolo experimental es ideal para todos los experimentos de actividad locomotora de C. elegans. Más bien, es importante elegir cuidadosamente qué método se adapta mejor a los objetivos y requisitos experimentales del investigador específico.

El bombeo faríngeo representa otro resultado importante para evaluar la actividad neuromuscular en C. elegans. La faringe de C. elegans está compuesta por 20 células musculares, 20 neuronas y otras 20 células que permiten la ingestión de Escherichia coli (E. coli)en el extremo anterior del tracto alimentario del gusano34,35,36. Se han establecido varios métodos manuales para determinar las tasas de bombeo faríngeo17,21,37,38. La mayoría de los métodos se basan en el uso de un estereomicroscopio y una cámara para visualizar y registrar la frecuencia de bombeo faríngeo con conteo directo por el observador experimental21. El análisis automatizado de la velocidad de bombeo faríngeo es posible mediante la realización de un registro extracelular denominado electrofaringigograma (EPG), que proporciona información adicional sobre la duración de cada bomba39. El análisis de la velocidad de bombeo faríngeo también es posible en un sistema microfluídico, WormSpa, donde los gusanos individuales están confinados en cámaras40,41. Un método comercial disponible para facilitar el análisis de la tasa de bombeo faríngeo es el sistema ScreenChip (InVivo Biosystems), que mide, visualiza y analiza los aspectos neuromusculares del comportamiento de alimentación en un solo gusano que se inmoviliza en un chip personalizado. Este enfoque de cuantificación del bombeo faríngeo se puede utilizar para evaluar las respuestas neuronales y fisiológicas a los fármacos, el envejecimiento y otros factores42,43,44,45.

La quimiotaxis describe el movimiento de C. elegans en respuesta a un odorante colocado lejos de los gusanos en un área definida de la placa de medios de crecimiento de nematodos (NGM). La evaluación de la respuesta de quimiotaxis proporciona una medida integrada de la actividad neuronal y neuromuscular del gusano que es cuantificable al observar y medir la distancia física recorrida por los gusanos hacia el odorante en un período de tiempo definido46. El Multi-Worm Tracker es un método automático que se puede utilizar para mejorar la eficiencia experimental de cuantificar la distancia recorrida por los gusanos hacia un atrayente o desde un repelente47.

Aquí, se describe el protocolo detallado para dos métodos novedosos y semiautomatizados establecidos para cuantificar la actividad del gusano. El primer enfoque utiliza ZebraLab, un software comercial que se desarrolló originalmente para estudiar la actividad de natación de Danio rerio (pez cebra), para una nueva aplicación de rendimiento medio para cuantificar la actividad locomotora general en medios líquidos de C. elegans en función de los cambios de píxeles durante el movimiento(Tabla 1, Figura 1). La salida de datos se obtiene rápidamente de un gran número de condiciones concurrentes y muestras analizadas en un portaobjetos de vidrio, aunque este método no es adecuado para un formato de placa de múltiples pozos. El segundo enfoque es una adaptación novedosa de la metodología WormScan48,49 (Figura 2), que utiliza un escáner de cama plana para crear una imagen diferencial de dos escaneos secuenciales que se pueden usar de manera variable con software de código abierto para permitir el análisis cuantitativo semiautomatizado de resultados fisiológicos integrados como la fecundidad y la supervivencia. Aquí, se desarrolló una nueva adaptación de alto rendimiento de la metodología WormScan para cuantificar la actividad locomotora del gusano en medios líquidos en poblaciones de quince gusanos larvales en etapa 4 (L4) por pozo de una placa de fondo plano de 96 pozos. Esta metodología WormScan semiautomatizada y de bajo costo se puede adaptar fácilmente a las pruebas de detección de medicamentos de alto rendimiento, así como a los análisis de varias etapas animales y edadesde 48,49.

Aquí, el protocolo y la eficacia del análisis de la actividad locomotora de C. elegans utilizando los métodos semiautomatizados ZebraLab y WormScan se demuestran en un modelo bien establecido de C. elegans para la enfermedad mitocondrial del complejo I, gas-1(fc21). gas-1 (gen K09A9.5) es un ortólogo del NDUFS2 humano (NADH: núcleo de ubiquinona oxidorreductasa (proteína hierro-azufre) subunidad 2)(Figura 3). La cepa mutante C. elegans gas-1(fc21)porta una mutación homocigota p.R290K sin sentido en el ortólogo humano de NDUFS250,causando una disminución significativa de la fecundidad y la vida útil, deterioro de la capacidad de fosforilación oxidativa de la cadena respiratoria (OXPHOS)51,así como disminución de la masa mitocondrial y el potencial de membrana con aumento del estrés oxidativo5,8 . A pesar de su uso bien establecido en las últimas dos décadas para estudiar la enfermedad mitocondrial, la actividad locomotora de los mutantes gas-1(fc21)no se informó previamente. Aquí, los métodos ZebraLab y WormScan se aplicaron para cuantificar de forma independiente la actividad locomotora del gas-1(fc21)en comparación con los gusanos de tipo salvaje (WT, N2 Bristol), tanto como una forma de validar los métodos como para demostrar su utilidad comparativa y eficiencia de los protocolos experimentales y los análisis informáticos. El software ZebraLab permitió la cuantificación rápida de varias condiciones concurrentes de actividad locomotora del gusano en modelos de enfermedad mitocondrial de C. elegans, con aplicación potencial para estudios dirigidos de detección o validación de fármacos. El análisis de WormScan, en particular, es adecuado para permitir fácilmente cribado farmacológico de alto rendimiento de bibliotecas de compuestos y priorizar los cables que mejoran la función neuromuscular animal y la actividad locomotora en modelos preclínicos de C. elegans de enfermedad mitocondrial primaria.

Protocol

1. Análisis de la actividad locomotora del gusano en medios líquidos en portaobjetos de vidrio utilizando el software ZebraLab Crecimiento y manipulación de nematodos Cultive C. elegans en placas de Petri que contengan medios de crecimiento de nematodos (NGM) y difunda con Escherichia coli OP50 como fuente de alimento. Mantener el cultivo de gusanos a 20 °C, como se describió anteriormente8. Sincronice los gusanos realizando una puesta de huevo c…

Representative Results

El análisis de la actividad locomotora de C. elegans en el medio líquido podría capturar fácilmente un fenotipo integrado de modelos de gusanos de enfermedades mitocondriales que pueden no ser fácilmente cuantificables en medios sólidos. ZebraLab se utilizó para cuantificar la actividad locomotora de la cepa gas-1(fc21)de la enfermedad del complejo I mitocondrial bien establecida en relación con los gusanos WT en medios líquidos en la etapa larvaria L4. La actividad de 5 gusanos en una…

Discussion

Aquí, el estudio resumió información detallada y fundamentos para estudiar la actividad neuromuscular de C. elegans a nivel de diversos resultados, incluyendo golpes de gusanos, locomoción, bombeo faríngeo y quimiotaxis. La comparación de 16 metodologías diferentes de análisis de actividad se realizó en términos del rendimiento relativo, las ventajas y las limitaciones de cuantificar las actividades de los nematodos en un solo gusano o poblaciones de gusanos a diferentes edades y duraciones experimenta…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Estamos agradecidos a Anthony Rosner, PhD., con su apoyo organizativo para la preparación temprana de este proyecto, y a Erin Haus por contribuir al análisis de protocolos. Este trabajo fue financiado por el Fondo de Investigación de Enfermedades Mitocondriales FBXL4 de Juliet’s Cure, el Fondo de Investigación Jaxson Flynt C12ORF65 y los Institutos Nacionales de Salud (R01-GM120762, R01-GM120762-08S1, R35-GM134863 y T32-NS007413). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los financiadores o de los Institutos Nacionales de Salud.

Materials

C. elegans wild isolate  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2 Bristol
Camera Olympus DP73
gas-1(fc-21) CGC CW152
Microscope slides ThermoFisher 4951PLUS
Nematode Growth Medium (NGM) Research Products International Corp. N81800-1000.0
OP50 Escherichia coli CGC Uracil auxotroph E. coli strain
Petri dishes (60 mm)  VWR international 25373-085
S. Basal VWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4, and 5 mg cholesterol, in 1 l H2O VWR 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660
Scanner EPSON V800
Stereomicroscope Olympus MVX10 microscope
96-well flat bottom  VWR international 29442-056
WormScan software Mathew et al. 45 S1 Standalone Java platform Software for automation of difference image of scanned plates
ZebraLab software ViewPoint Software for automated quantization and tracking of zebrafish behavior, designed by ViewPoint (http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening) and here applied to C. elegans. This system is applicable for high-throughput behavioral analysis
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Lavorato, M., Mathew, N. D., Shah, N., Nakamaru-Ogiso, E., Falk, M. J. Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease. J. Vis. Exp. (170), e62244, doi:10.3791/62244 (2021).
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