Summary
Præsenteret her er en protokol til bevarelse af vaskulær kontraktilitet AF PCLS murin lungevæv, hvilket resulterer i en sofistikeret tre-dimensionelle billede af lunge vasulatur og luftveje, som kan bevares i op til 10 dage, der er modtagelige for mange procedurer.
Abstract
Visualiseringen af murin lungevæv giver værdifulde strukturelle og cellulære oplysninger om de underliggende luftveje og vaskulatur. Men bevarelsen af lungekar, der virkelig repræsenterer fysiologiske forhold, giver stadig udfordringer. Derudover resulterer den delikate konfiguration af murin lunger i tekniske udfordringer med at forberede prøver til billeder af høj kvalitet, der bevarer både cellulær sammensætning og arkitektur. Tilsvarende cellulære kontraktilitet assays kan udføres for at studere potentialet i celler til at reagere på vasoconstrictors in vitro, men disse analyser ikke gengive det komplekse miljø af den intakte lunge. I modsætning til disse tekniske problemer, præcision-cut lunge skive (PCLS) metode kan anvendes som et effektivt alternativ til at visualisere lungevæv i tre dimensioner uden regional bias og tjene som en levende surrogat kontraktilitet model i op til 10 dage. Væv fremstillet ved hjælp af PCLS har bevaret struktur og rumlig orientering, hvilket gør det ideelt at studere sygdomsprocesser ex vivo. Placeringen af endogene tdTomato-mærkede celler i PCLS høstet fra en inucible tdTomato reporter murine model kan med succes visualiseres ved konfokal mikroskopi. Efter eksponering for vasoconstrictors demonstrerer PCLS bevarelsen af både fartøjskontraktilitet og lungestruktur, som kan fanges af et time-lapse-modul. I kombination med de andre procedurer, såsom western blot og RNA-analyse, kan PCLS bidrage til den omfattende forståelse af signaleringskaskader, der ligger til grund for en bred vifte af lidelser og fører til en bedre forståelse af patofysiologien i lungesygdomme.
Introduction
Fremskridt i forberedelsen og billeddannelsen af lungevæv, der bevarer cellulære komponenter uden at ofre anatomisk struktur, giver en detaljeret forståelse af lungesygdomme. Evnen til at identificere proteiner, RNA og andre biologiske forbindelser og samtidig opretholde fysiologisk struktur giver vigtige oplysninger om det rumlige arrangement af celler, der kan udvide forståelsen af patofysiologien i mange lungesygdomme. Disse detaljerede billeder kan føre til en bedre forståelse af lungesygdomme, såsom lungepulsåren hypertension, når de anvendes på dyremodeller, potentielt fører til forbedrede terapeutiske strategier.
På trods af teknologiske fremskridt er det fortsat en udfordring at få billeder af murin lungevæv af høj kvalitet. Åndedrætscyklussen er drevet af et negativt intrathoracisk tryk, der genereres under indånding1. Når der traditionelt opnås biopsier og forbereder lungeprøver til billeddannelse, går negativtryksgradienten tabt, hvilket resulterer i sammenbruddet af luftvejene og vaskulaturen, som ikke længere repræsenterer sig selv i sin nuværende tilstand. For at opnå realistiske billeder, der afspejler de aktuelle forhold, skal lungeluftvejene genbøjes, og vaskulaturen gennemsyres, ændre den dynamiske lunge til en statisk armatur. Anvendelsen af disse forskellige teknikker gør det muligt at bevare strukturel integritet, lunge-vaskulatur, og cellulære komponenter, herunder immunceller såsom makrofager, så lungevæv, der skal ses så tæt på sin fysiologiske tilstand som muligt.
Præcision skåret lunge udskæring (PCLS) er et ideelt værktøj til at studere anatomi og fysiologi af lunge vasulatur2. PCLS giver detaljeret billeddannelse af lungevævet i tre dimensioner, samtidig med at strukturelle og cellulære komponenter bevares. PCLS er blevet brugt i dyre- og menneskelige modeller for at give mulighed for levende billeder i høj opløsning af cellulære funktioner i tre dimensioner, hvilket gør det til et ideelt værktøj til at studere potentielle terapeutiske mål, måle små luftvejssammentrækning og studere patofysiologien af kroniske lungesygdomme som KOL, ILS og lungekræft3. Ved hjælp af lignende teknikker kan eksponeringen af PCLS-prøver for vasoconstrictors bevare lungestruktur og fartøjskontraktilitet og replikere in vitro-forhold. Sammen med at bevare sammentrækning, forberedte prøver kan gennemgå yderligere analyse såsom RNA sekventering, Vestlige blot, og flow cytometri, når de fremstilles korrekt. Endelig kan reporter farvemærkede celler markeret med tdTomato fluorescens efter lungehøst bevare mærkning efter fremstilling af mikroslices, hvilket gør den ideel til cellesporingsundersøgelser. Integrationen af disse teknikker giver en sofistikeret model, der bevarer den rumlige placering af celler og fartøjskontraktilitet, der kan føre til en mere detaljeret forståelse af signalkaskader og potentielle terapeutiske muligheder i lunge vaskulatursygdom.
I dette manuskript udsættes PCLS murine lungevæv for vasoconstrictors, der demonstrerer bevaret strukturel integritet og fartøjskontraktilitet. Undersøgelsen viser, at vævet, der fremstilles og håndteres korrekt, kan forblive levedygtigt i 10 dage. Undersøgelsen viser også bevarelsen af celler med endogen fluorescens (tdTomato), så prøver kan give billeder i høj opløsning af lungekarkulaturen og arkitekturen. Endelig er der beskrevet måder at håndtere og forberede vævsskiver til RNA-måling og western blot for at undersøge underliggende mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al dyrepleje var i overensstemmelse med retningslinjerne fra Boston Children's Hospital og Institutional Animal Care and Use Committee godkendte protokoller. De mus, der anvendes i denne undersøgelse, er vilde type C57/B6-mus og Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato krydsede mus.
1. Udarbejdelse af løsninger
- Forbered fosfat buffer løsning (1x PBS) og 2% agarose løsning kræves under forsøget på forhånd.
- Bland 2 g agarosepulver i 100 mL autoklavet vand. Varm det i mikrobølgeovnen et par sekunder ad gangen, indtil opløsningen er klar.
- Opløsningen placeres i et vandbad ved 42 °C, indtil den anvendes.
BEMÆRK: Både PBS og 2% agarose kan opbevares ved stuetemperatur i ugevis.
2. Udvinding af musen lunge
- Aflive musen ved isoflurane overdosis. Opnå isoflurane overdosis ved at placere en lille mængde isoflurane på silkepapir i det lavere niveau og placere musen i det øverste niveau i en udtørrer. Musen forbliver i udtørreren, indtil den er bevidstløs.
- Sørg for musens død ved at lægge et lavere tryk på halsen og trække caudal på halen. Bring musen til dissekering overfladen.
- Placer musen i liggende stilling og fastgør den på plads tape poter og næse til bord med tape.
- Spray musens ventrale overflade med 70% ethanol og tør den overskydende ethanol af.
- Løft musens mavehud med sammentrækninger på blærens placering og skær i midterlinjen med kirurgisk saks, der bevæger sig overlegent til livmoderhalsregionen og udsætter luftrøret.
- Løft det underliggende fasciallag med pincet og skær med kirurgisk saks for at eksponere viscerale organer og mediastinalt rum, igen skære ringere end overlegen.
- Skær brystbenet i midten af halven for at udsætte hjertet og lungen.
- Brug stump dissektion, løsne mellemgulvet fra leveren og maverummet.
- Find den ringere vena cava (IVC) under tarmene og skær IVC.
- Find højre ventrikel.
BEMÆRK: Højre ventrikel vil have et lettere udseende i forhold til venstre ventrikel og intraventtrikulær septum bør visualiseres, adskille højre ventrikel fra venstre ventrikel. - Indsprøjt 0,5 mL 1% fraktioneret heparin til højre ventrikel med en 25-30 G butterfly nål og derefter skylle langsomt, men støt med 10-15 mL af 1x PBS (Figur 1A).
- Vær forsigtig med ikke at indsætte nålen gennem hjertet og injicere heparin i mediastinal hulrum.
BEMÆRK: Injektionen af 1x PBS gør lungevævet hvidt. Væsken ekstravasating fra abdominal aorta skal være klar og farveløs og leveren kan blive hvid i udseende efter vellykket skylning.
- Vær forsigtig med ikke at indsætte nålen gennem hjertet og injicere heparin i mediastinal hulrum.
- Find strubehovedet og dissekere de omkringliggende fascia og væv ved hjælp af stump spids pincet.
- Placer den kirurgiske sutur under luftrøret og løst binde en kirurgisk knude.
- Placer et lille hul i luftrøret overlegen i forhold til strengen og kanulate med 20 G stump-ended nål.
- Stram suturen omkring nålen og luftrøret ved hjælp af en kirurgisk knude.
- Indsprøjt 2,5-4 mL agarose i luftrøret og monitor for inflation af lungen.
- Efter agarose er indpodet, hæld koldt, kølet 1x PBS over lungen for at størkne agarose.
- Skær luftrøret overlegen i forhold til kirurgisk sutur og dissekere lunge og hjerte fra mediastinum ved at fjerne eventuelle vedhæftninger og fascia.
- Efter størkning, sted i 1x DMEM (nok til at nedsænke væv) i en petriskål til at holde på is. Skær straks en lap i skiver ved hjælp af en vibratommaskine (Figur 1B).
3. Præcisionsskårne lungeskiver
- Fastgør prøven til platformen med superlim, og hold den mediale side af prøven med forsiden nedad.
- Fyld prøvebeholderen med 1x PBS, så prøven er helt nedsænket.
- Fyld beholderen omkring prøvebeholderen med is for at holde omkringliggende PBS og prøve kold.
- Tænd vibratomen, og juster den til de ønskede indstillinger nedenfor.
- Indstil tykkelsen til 300um.
- Indstil frekvensen til 100 Hz.
- Indstil amplituden til 0,6 mm.
- Indstil hastigheden til 5 μm/s.
- Ved hjælp af en skruenøgle skal du dreje knivholderen i sikker position og åbne kæberne for at indsætte en klinge.
- Stram kæberne med en skruenøgle med allen og drej knivholderen i den rette position til udskæring.
- Sæt prøven og platformen på kassen, og skub foran klingen.
- Fyld kassen rundt om prøveplatformen med 1x PBS, indtil prøven er nedsænket.
- Bring vibratombladet op til kanten af blokken, og sænk klingen manuelt, indtil den er helt oppe i toppen af prøven.
- Bekræft de relevante indstillinger, og kør vibratomen (Figur 2).
- Når der skæres friske skiver, skal prøverne fjernes fra PBS og placeres i en steril petriskål med 10 mL 1x DMEM, der indeholder 1x antibiotisk antimykotisk.
- Når du er færdig, trækkes klingen helt tilbage og derefter bruge skruenøglen til at hæve klingen i en sikker position.
- Prøverne opbevares i 1x DMEM i en inkubator ved 37 °C med levedygtighed bevaret i op til 10 dage (se levedygtighedseksperimentet nedenfor).
4. Eksempel vasoconstrictor eksperiment
- Placer en vibratom skive på et mikroskop dias.
- Før du placerer den på diaset, skal du bruge en rengøringsstørring for at slippe af med det overskydende medium (PBS).
- Prøven anbringes under fasekontrastmikroskopi, og brug 10-20x forstørrelse til at identificere et fartøj.
- Sæt 500 μL vasoconstrictors, såsom 60 mM KCl eller 1 μM Endothelin-1 for helt at nedsænke diaset.
- Overhold og opfang videoen ved optagelse i 30 s-60 s (Video 1).
5. Forberedelse af vævet til RNA eller protein lysis på PCLS
- Før du begynder forsøget, skal du fylde en lille polystyren skumkasse med 1 L flydende nitrogen.
- To små mikrocentrifugrør (1,5 mL) placeres i beholderen med flydende nitrogen, inden de påbegyndes.
BEMÆRK: Flydende nitrogen skal afkøles uden for rørene, men ikke være inde. Sørg for at håndtere flydende nitrogen med omhu og ikke udsætte huden for flydende nitrogen. Brug sammentak og handsker til at placere og fjerne rør fra kassen. - Placer 4-5 friske vibratom skiver i en mørtel skål.
- Hæld 5-10 mL væske N2 oven på skiverne i mørtelskålen.
- Brug hurtigt støderen til at male flash fryse skiverne i pulver, før flydende nitrogen fordamper.
BEMÆRK: Væv skal kondensere til et fint pulver. Hvis ikke, tilsættes yderligere flydende nitrogen, indtil det er opnået. - Ved hjælp af en stållaboratorie scooper (prechilled med flydende nitrogen), scoop pulveret i de to afkølede mikrocentrifuge rør.
- Lys pulveret ved at tilsætte 500 μL RNA ekstraktionsreagens for at fortsætte med RNA-isolering eller 500 μL RIPA-buffer (indeholder 1x proteasehæmmere) for at fortsætte med proteinlyseis.
- Prøverne opbevares ved -80 °C indtil yderligere RNA-isolering, BCA-måling og vestlig blot.
6. Bestemmelse af levedygtighed
- Efter vibratompræparat skal to lungeskiver placeres i en 24-brønds kulturplade med 450 μL DMEM-medier og 50 μL celle levedygtighedsreagens (sørg for, at vævet er nedsænket helt).
- Prøverne sættes tilbage i 5 % CO2 ved 37 °C-inkubator natten over med minimal eksponering for lys.
- Om morgenen skal du observere opløsningen til farveændring. Den blå opløsning bliver lyserød, når vævet er levedygtigt.
7. Bevarelse af cellemærkning
- Behandl en transgen Cdh5-CreERT2 krydset med Ai14 tdTomato mus med en IP-injektion af Tamoxifen (2 mg/dag) i alt 5 dage (samlet dosis 10 mg Tamoxifen) for at fremkalde tdTomato-mærket Cre positive celler.
- En uge efter injektionen forberede lungerne ved hjælp af ovenstående trin 1 til 3.
- Efter fremstilling af præcisionsskåret lungeskive, placere vævet på et mikroskop dias og placere en coverlip oven på vævet.
- Brug et konfokalt mikroskop til at registrere tdTomato-farvning (ved hjælp af excitationsbølgelængde 555 nm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når det tilsættes til celler eller væv, ændres levedygtighedsreagenset ved at reducere miljøet af levedygtigt væv og bliver lyserødt / rødt og bliver meget fluorescerende. De repræsentative farveændringer, der registreres fra dag 0-1 og dag 9-10, er vist i figur 3. Som nævnt startede opløsningen blå og blev lyserød natten over, hvilket viser levedygtighed. Farveændring sker typisk inden for 1-4 timer. det kan dog være nødvendigt med længere tid. Til analyse for levedygtighed, en pladelæser blev brugt til at bestemme absorbansen af en vibratome-forberedt prøve og en 4% PFA fast lunge skive, der tjener som en kontrol. Opløsninger, hvor prøverne blev inkuberet, blev aflæst ved en absorbans på 562 nm og 630 nm efter fabrikantens anbefaling. Den daglige forskel mellem absorbans ved 562 nm og 630 nm bølgelængde for det vibratomerede væv og sammenligning med kontrolvævet er vist i figur 3.
For at påvise sammentrækning af vibratom-tilberedt lungevæv, et frisk stykke væv blev placeret under det lyse felt mikroskop på 400x og behandlet ved hjælp af KCL eller Endothelian-1, indtil vævet blev nedsænket. En video taget over 30-60 s af vævet afslører indsnævring af vaskulatur (Video 1).
For at påvise bevarelse af cellemærkning 1 uge efter tamoxifen injektion, lunge skiver opnået efter vibratom sektion ved hjælp af ovenstående protokol blev observeret under en konfokal mikroskop. TdTomato-mærkningen i lungeskiverne er påvist i figur 4.
Figur 1: Murine lungevæv forberedelse til vibratom sektionsopdelning. (A) RV'en er cannulated med en 30G sommerfugl nål for at lette skifteløsninger fra Heparin til PBS. (B) Hele lungen lapper efter agarose inflation Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Lungeskiver med vibratomsektion. Tykkelse: 300 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Levedygtighedseksperiment for PCLS-skiver fra dag 1 til dag 10. (A) Repræsentative billeder af reagensfarveændring af PCLS-tilberedt væv i forhold til 4% PFA-fast væv. Frisk PCLS-væv og 4 % fast PFA-væv blev anbragt i 450 μL vævsmedier og 50 μL levedygtighedsreagens. Opløsning farve oprindeligt lilla, som det kan ses på dag 0 og dag 9. Efter inkubation natten over, den opløsning, der indeholder frisklavet PCLS væv ændret til lilla / pink farve (dag 1 og dag 10) på grund af det reducerende miljø af levende væv. (B) Kvantificering af PCLS-levedygtigheden fra dag 1 til dag 10 efter forholdet mellem absorbansen ved 562 nm og 630 nm med en pladelæser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Demonstration af konserverede tdTomato-positive celler, der mærkes efter høsten. PCLS-præparatet er fra en Cdh5-tdT transgen mus. Skalalinje = 20 μm Klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: Indsnævring af fartøjer, der bruger Endothelin-1 på PCLS. Wildtype C57/B6 mus oppustet med 1,5 mL på 1,5% agarose og opdelt i 130 μm ved hjælp af en vibratom. Et frisk stykke væv blev placeret under det lyse feltmikroskop ved 400x og behandlet ved hjælp af KCL eller Endothelian-1. Forstørrelse: 400x. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskript beskrives en forbedret metode til at producere billeder i høj opløsning af murin lungevæv, der bevarer den vaskulære struktur og optimerer eksperimentel fleksibilitet, specifikt ved hjælp af anvendelsen af PCLS for at opnå mikroslices af lungevæv, der kan ses i tre dimensioner med bevaret kontraktilitet af vaskulaturen. Ved hjælp af levedygtighedsreagenset viser protokollen, at omhyggeligt forberedte og konserverede skiver kan bevare levedygtigheden i mere end en uge. Mikroslices bevarede levedygtighed gør det muligt at udføre flere og langvarige forsøg på vaskulatur- og luftvejsstrukturer, hvilket gør det til en ideel prøve at teste ex vivoresponset af flere lægemidler, evaluere underliggende molekylære mekanismer og teste reagenser. Dette gør forberedte prøver den ideelle platform til at studere potentielle terapeutiske virkninger på vaskulær tone forud for in vivo forsøg4. Bevarelsen af de lungeluftveje og vaskulatur gør det muligt at behandle forberedte prøver med yderligere teknikker som kontraktilitetstest, der er beskrevet i denne artikel og sammenfattet i tabel 1. Dette giver mulighed for at give billeder i høj opløsning, der beskriver lunge vaskulaturens rumlige arrangement og signaleringskaskader, hvilket bidrager til patogenesen af lungesygdomme.
Forberedelsen af vævsmikroslicer til eksperimenter er en teknik, der bruger en vibratom eller vibrerende klinge til at producere præcisionsskårne organotypic skiver. Dette giver mulighed for øget nøjagtighed og reproducerbarhed i forhold til traditionelle teknikker5. Mikroslices af lungerne opnået med PCLS opretholde den fysiologiske struktur af lungevæv til et cellulært niveau, hvilket gør det til et nyttigt redskab til at studere en række lunge vaskulære sygdomme. Teknologien er blevet brugt i både dyre- og menneskemodeller til at studere den komplekse lungeanatomi og lungepatologi med særligt fokus på toksiske eksponeringer, infektionssygdomme og immunologiske undersøgelser6,7,8. Afhængigt af den underliggende patofysiologi kan mikroslicer opnås af de specifikke lobes af interesse eller en / alle lobes for at sammenligne sygdoms heterogenitet. Skiver for tynde resulterer i vanskeligheder med at bevare strukturel integritet, mens tykkere skiver kan være vanskeligere at udføre yderligere farvning eller dybt i væv imaging.
Specifik for vaskulær sygdom, PCLS er blevet udnyttet til at studere lungearterie hypertension (PAH), så en sofistikeret model til at analysere virkningerne af potentielle behandlinger9,10,11. Bevarelsen af vaskulær kontraktilitet i murin lungeprøver har mange terapeutiske og investigational fordele. Ved at indarbejde en teknik, der bevarer både strukturen og sammentrækningen af lunge-vaskulaturen, kan forberedte prøver modellere lunge vaskulær sygdom ex vivo. Dette er tidligere blevet påvist af Rieg et al., der med PCLS-prøver var i stand til at påvise, at lungeårerne var mere følsomme over for a1-agonister og b2-agonister, hvilket tyder på, at brugen af disse lægemidler i venstre hjertesvigt kan forårsage øget lungeødem12. Ved hjælp af denne model til at studere virkningerne af lægemidler hjælper ex vivo med at identificere de potentielle terapeutiske midler til mulige kliniske forsøg. I dette manuskript beskriver protokollen metoder til at håndtere og opbevare vævet med levedygtighed bevaret i 10 dage, hvilket giver mulighed for overvågning af væv efter potentielle indgreb og giver større eksperimentel fleksibilitet. Tidligere undersøgelser har anvendt lignende metoder til at bevare luftvejeskontraktilitet i astmamodeller, med IL-13-effekten, der varer i op til 15 dage3. Immunstaining af RNA og cytokiner kan føre til en bedre forståelse af den underliggende patogenese, der er ansvarlig for sygdomsprogression og udvikling i forskellige vaskulære sygdomme. De forberedte prøver kan bevare cellemærkning efter tilberedning, demonstreret i dette manuskript med bevarelse af tdTomato mærket Cdh5 + endotelceller. Bevarelsen af en sådan mærkning i vibratom-forberedte prøver gør det muligt at bevare strukturen sammen med cellemærkning, hvilket gør det til et ideelt værktøj til at udføre cellesporingseksperimenter. Endelig er de forberedte prøver modtagelige for yderligere undersøgelser såsom RNA lysis eller western blot beskrevet i denne protokol for yderligere at studere den underliggende patofysiologi og mekanismer, der forårsager sygdomsprogression.
På trods af sine fordele for andre teknikker er der begrænsninger for PCLS-tilberedt væv. Udførelse PCLS forvandler den dynamiske lunge til en statisk armatur, giver et øjebliksbillede i tide af de celler og molekyler til stede i lungevæv på tidspunktet for biopsi. Medmindre der opnås mange prøver, tager det ikke højde for den enorme heterogenitet, der almindeligvis ses hos mange lungesygdomme som kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL). Væv tilberedt med PCLS er hovedsageligt begrænset til små luftveje og fartøjssygdomme. Dette skyldes de tekniske udfordringer med vævshøst, da luftrøret typisk er incised for lungeinflation og identificere og isolere store bronkier er udfordrende. Disse tekniske begrænsninger gør ved hjælp af PCLS væv suboptimal til at studere større bronkier og de ledende luftveje. Dynamisk testning er også begrænset, hvilket gør det til en mindre end ideel platform til at studere respirator-associeret lungesygdom og barotrauma. Endelig har anvendelsen af PCLS på lungemedicinsk område primært fokuseret på murin lungevæv, og der er behov for yderligere test og protokoller, før de anvendes på humant væv i et klinisk relevant scenario.
Sammenfattende giver manuskriptet en komplementær metode, der bevarer den vaskulære kontraktilitet af PCLS murine lungevæv, hvilket resulterer i billeder i høj opløsning af lungebjuturen i op til 10 dage, der indeholder endogene fluorescerende celler og mange andre procedurer.
Tabel 1: Kendetegn og anvendelse af forskellige vasoconstrictors. (*anvendt i denne undersøgelse) Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Drs. Yuan Hao og Kaifeng Liu for deres tekniske support. Dette arbejde blev støttet af en NIH 1R01 HL150106-01A1, Parker B. Francis Fellowship, og Pulmonal Hypertension Association Aldrighetti Research Award til Dr. Ke Yuan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5cc of fractionated heparin in syringe | BD | 100 USP units per mL | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CM | |
| 20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation | Cml Supply | 90120050D | |
| 30cc syringe | BD | 309650 | |
| Anti Anti solution | Gibco | 15240096 | |
| Automated vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | |
| Cell Viability Reagent (alamarBlue) | Thermofisher | DAL1025 | |
| Confocal | Zeiss | 880 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep | Gibco | 10569-010 | |
| Endothelin-1 | Sigma | E7764 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
| Mortar and Pestle | Amazon | ||
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermoscientific | 89900 | |
| Surgical suture 6/0 | FST | 18020-60 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermofisher | 15596026 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
| Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G | BD | 25-30G |
References
- Sparrow, D., Weiss, S. T.
- Gerckens, M., et al. Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437 (2019).
- Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
- Rosales Gerpe, M. C., et al. Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 10, 245-256 (2018).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liu, R., et al. Mouse lung slices: An ex vivo model for the evaluation of antiviral and anti-inflammatory agents against influenza viruses. Antiviral Research. 120, 101-111 (2015).
- de Graaf, I. A., et al. Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies. Nature Protocols. 5 (9), 1540-1551 (2010).
- Alsafadi, H. N., et al. Applications and approaches for three-dimensional precision-cut lung slices. Disease modeling and drug discovery. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (6), 681-691 (2020).
- Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
- Springer, J., Fischer, A. Substance P-induced pulmonary vascular remodelling in precision cut lung slices. The European Respiratory Journal. 22 (4), 596-601 (2003).
- Suleiman, S., et al. Argon reduces the pulmonary vascular tone in rats and humans by GABA-receptor activation. Scientific Reports. 9 (1), 1902 (2019).
- Rieg, A. D., et al. Cardiovascular agents affect the tone of pulmonary arteries and veins in precision-cut lung slices. PLoS One. 6 (12), 29698 (2011).
- Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
- Deng, C. Y., et al. Upregulation of 5-hydroxytryptamine receptor signaling in coronary arteries after organ culture. PLoS One. 9 (9), 107128 (2014).
- Sandker, S. C., et al. Adventitial dissection: A simple and effective way to reduce radial artery spasm in coronary bypass surgery. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 17 (5), 784-789 (2013).
- Naik, J. S., et al. Pressure-induced smooth muscle cell depolarization in pulmonary arteries from control and chronically hypoxic rats does not cause myogenic vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 98 (3), Bethesda, Md. 1119-1124 (2005).
- Lopez-Lopez, J. G., et al. Diabetes induces pulmonary artery endothelial dysfunction by NADPH oxidase induction. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (5), 727-732 (2008).
- Gonzalez-Tajuelo, R., et al. Spontaneous pulmonary hypertension associated with systemic sclerosis in P-selectin glycoprotein Ligand 1-deficient mice. Arthritis & Rheumatology. 72 (3), Hoboken, N.J. 477-487 (2020).
- Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
- Nishiyama, S. K., et al. Vascular function and endothelin-1: tipping the balance between vasodilation and vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 122 (2), Bethesda, Md. 354-360 (2017).
- Schneider, M. P., Inscho, E. W., Pollock, D. M. Attenuated vasoconstrictor responses to endothelin in afferent arterioles during a high-salt diet. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 292 (4), 1208-1214 (2007).
- Inscho, E. W., Imig, J. D., Cook, A. K. Afferent and efferent arteriolar vasoconstriction to angiotensin II and norepinephrine involves release of Ca2+ from intracellular stores. Hypertension. 29, Dallas, Tex. 222-227 (1997).
- Vecchione, C., et al. Protection from angiotensin II-mediated vasculotoxic and hypertensive response in mice lacking PI3Kgamma. The Journal of Experimental Medicine. 201 (8), 1217-1228 (2005).
