Tumortransplantation zur Beurteilung der Dynamik tumorinfiltrierender CD8+ T-Zellen in Mäusen
Summary
Hier stellen wir ein Tumortransplantationsprotokoll zur Charakterisierung von tumorinhärenten und peripherieabgeleiteten tumorinfiltrierten Lymphozyten in einem Maustumormodell vor. Die spezifische Verfolgung des Zustroms von Empfänger-abgeleiteten Immunzellen mit Durchflusszytometrie zeigt die Dynamik der phänotypischen und funktionellen Veränderungen dieser Zellen während der Antitumor-Immunantwort.
Abstract
T-Zell-vermittelte Immunität spielt eine entscheidende Rolle bei der Immunantwort gegen Tumore, wobei zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) die führende Rolle bei der Ausrottung von Krebszellen spielen. Die Entstehung und der Nachschub von Tumorantigen-spezifischen CD8+ T-Zellen innerhalb der Tumormikroumgebung (TME) bleiben jedoch unklar. Dieses Protokoll verwendet die B16F10-OVA-Melanomzelllinie, die stabil das Surrogat-Neoantigen, das Ovalbumin (OVA) und die transgenen OT-I-Mäuse der TCR exprimiert, in der über 90% der CD8+ T-Zellen spezifisch das von der OVA abgeleitete Peptid OVA257-264 (SIINFEKL) erkennen, das an das MHC-Molekül (Major Histocompatibility Complex) der Klasse I H2-Kb gebunden ist. Diese Merkmale ermöglichen die Untersuchung von Antigen-spezifischen T-Zell-Reaktionen während der Tumorgenese.
Durch die Kombination dieses Modells mit der Tumortransplantationschirurgie wurden Tumorgewebe von Spendern in tumorangepasste syngene Empfängermäuse transplantiert, um den Zustrom von vom Empfänger abgeleiteten Immunzellen in transplantiertes Spendergewebe genau zu verfolgen, was die Analyse der Immunantworten von tumorinhärenten und peripheriebedingten antigenspezifischen CD8+ ermöglicht. T-Zellen. Es wurde ein dynamischer Übergang zwischen diesen beiden Populationen festgestellt. Insgesamt hat dieses experimentelle Design einen weiteren Ansatz zur präzisen Untersuchung der Immunantworten von CD8+ T-Zellen in TME geliefert, was ein neues Licht auf die Tumorimmunologie werfen wird.
Introduction
CD8+ T-Zell-vermittelte Immunantwort spielt eine zentrale Rolle bei der Kontrolle des Tumorwachstums. Während der Tumorentstehung werden naive CD8+ T-Zellen bei Antigenerkennung in einer MHC-Klasse I-eingeschränkten Weise aktiviert und differenzieren anschließend in Effektorzellen und infiltrieren in Tumormasse 1,2. Innerhalb der Tumormikroumgebung (TME) treiben jedoch eine längere Antigenexposition sowie immunsuppressive Faktoren infiltrierte tumorspezifische CD8+ T-Zellen in einen hyporesponsiven Zustand, der als “Erschöpfung” bezeichnet wird3. Erschöpfte T-Zellen (Tex) unterscheiden sich von Effektor- oder Gedächtnis-T-Zellen, die bei akuten Virusinfektionen sowohl transkriptionell als auch epigenetisch erzeugt werden. Diese Tex-Zellen zeichnen sich hauptsächlich durch die anhaltende und erhöhte Expression einer Reihe von hemmenden Rezeptoren sowie den hierarchischen Verlust von Effektorfunktionen aus. Darüber hinaus führt die beeinträchtigte proliferative Kapazität erschöpfter CD8+ T-Zellen zu einer abnehmenden Anzahl tumorspezifischer T-Zellen, so dass die verbleibenden CD8+ T-Zellen innerhalb der TME kaum eine ausreichende schützende Immunität gegen Tumorprogressionbieten können 3. Daher ist die Aufrechterhaltung oder Verstärkung von intratumoralen antigenspezifischen CD8+ T-Zellen für die Tumorrepression unverzichtbar.
Darüber hinaus wird angenommen, dass die Therapie der Immun-Checkpoint-Blockade (ICB) Tex in Tumoren wiederbelebt, indem sie die T-Zell-Infiltration und damit die T-Zell-Anzahl erhöht und die T-Zell-Funktionen verjüngt, um die Tumorrepression zu verstärken. Die weit verbreitete Anwendung der ICB-Behandlung hat die Krebstherapielandschaft verändert, wobei eine beträchtliche Untergruppe von Patienten ein dauerhaftes Ansprechen aufweist 4,5,6. Dennoch spricht die Mehrheit der Patienten und Krebsarten nicht oder nur vorübergehend auf ICB an. Eine unzureichende T-Zell-Infiltration in der TME wurde als einer der zugrunde liegenden Mechanismen postuliert, die für den ICB-Widerstand verantwortlich sind 7,8.
Mehrere Studien haben die Heterogenität von tumorinfiltrierenden CD8+ T-Zellen (TILs) sowohl bei Patienten als auch bei Mausmodellen 9,10,11,12 gezeigt. Es wurde bestätigt, dass eine Untergruppe von CD8+ T-Zellen, die T-Zell-1 (TCF1) in einer Tumormasse exprimieren, stammzellähnliche Eigenschaften aufweist, die weiter zu terminalen erschöpften T-Zellen führen könnten und für den Proliferationsausbruch nach ICB-Therapie 12,13,14,15,16,17,18,19,20 verantwortlich sind. 21,22 Es wurde jedoch nachgewiesen, dass nur ein kleiner Teil der antigenspezifischen TCF1 + CD8 + T-Zellen in der TME existiert und einen erweiterten Pool differenzierter Nachkommen als Reaktion auf ICB23,24,25,26 erzeugt. Ob die begrenzte Größe dieser Population ausreicht, um die Persistenz zytotoxischer T-Lymphozyten (CTLs) zur Kontrolle der Tumorprogression sicherzustellen, bleibt unbekannt, und ob es zu einer Auffüllung aus peripheren Geweben kommt, bedarf weiterer Untersuchungen. Darüber hinaus deuten neuere Forschungen auf die unzureichende Wiederbelebungskapazität vorbestehender tumorspezifischer T-Zellen und das Auftreten neuartiger, zuvor nicht existierender Klonotypen nach einer anti-programmierten Zelltodprotein-1-Behandlung hin. Dies deutet darauf hin, dass die Reaktion der T-Zellen auf die Checkpoint-Blockade auf den neuen Zustrom eines ausgeprägten Repertoires von T-Zell-Klonenzurückzuführen sein könnte 27. Zusammen mit dem Vorhandensein von nicht tumorreaktiver zytotoxischer T-Zellfraktion in der TME führten diese Ergebnisse zur Etablierung eines Tumorallotransplantatmodells, um die Rolle von peripherieabgeleiteten CD8 + T-Zellen zu untersuchen11.
Bisher waren verschiedene Arten der Tumorimplantation sowie des adoptiven Transfers von Immunzellen im Bereich der Tumorimmunologieweit verbreitet 28. TILs, mononukleäre Zellen im peripheren Blut und tumorreaktive Immunzellen, die aus anderen Geweben stammen, können mit diesen Methoden gut charakterisiert werden. Bei der Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen systemischer und lokaler Antitumorimmunität scheinen diese Modelle jedoch unzureichend zu sein, um die Interaktionen zwischen Immunzellen, die aus der Peripherie stammen, und der TME zu untersuchen. Hier wurde Tumorgewebe von Spendern in tumorangepasste Empfängermäuse transplantiert, um den Zustrom von Empfänger-abgeleiteten Immunzellen genau zu verfolgen und die von Spendern abgeleiteten Zellen in der TME gleichzeitig zu beobachten.
In dieser Studie wurde ein murines syngenes Modell des Melanoms mit der B16F10-OVA-Melanomzelllinie etabliert, die das Surrogat Neoantigen Ovalbumin stabil exprimiert. TCR-transgene OT-I-Mäuse, bei denen über 90% der CD8+ T-Zellen spezifisch das von OVA abgeleitete Peptid OVA257-264 (SIINFEKL) erkennen, das an das MHC-Molekül H2-Kb der Klasse I gebunden ist, ermöglichen die Untersuchung antigenspezifischer T-Zell-Antworten, die im B16F10-OVA-Tumormodell entwickelt wurden. Durch die Kombination dieses Modells mit der Tumortransplantation wurden die Immunantworten von tumorinhärenten und peripheriebasierten antigenspezifischen CD8+ T-Zellen verglichen, um einen dynamischen Übergang zwischen diesen beiden Populationen zu zeigen. Insgesamt hat dieses experimentelle Design einen weiteren Ansatz zur präzisen Untersuchung der Immunantworten von CD8 + T-Zellen in der TME geliefert, was ein neues Licht auf die Dynamik tumorspezifischer T-Zell-Immunantworten in der TME wirft.
Protocol
Representative Results
Discussion
T-Zell-vermittelte Immunität spielt eine entscheidende Rolle bei der Immunantwort gegen Tumore, wobei CTLs die führende Rolle bei der Ausrottung von Krebszellen spielen. Die Ursprünge von tumorantigenspezifischen CTLs innerhalb von TME wurden jedoch nicht aufgeklärt30. Die Verwendung dieses Tumortransplantationsprotokolls hat einen wichtigen Hinweis darauf geliefert, dass intratumorale antigenspezifische CD8+ T-Zellen trotz der Existenz stammartiger TCF1+ Vorläufer-CD8+ …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde durch Zuschüsse des National Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (Nr. 31825011 an LY) und der National Natural Science Foundation of China (Nr. 31900643 an QH, Nr. 31900656 an ZW) unterstützt.
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGPR33RB | |
| 1 mL tuberculin syringe | KDL | BB000925 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16F10-OVA cell line | bluefbio | BFN607200447 | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2 | BD Horizon | 562895 | Clone:104 |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19853 | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
Referências
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