Трансплантация опухоли для оценки динамики инфильтрирующих опухоль CD8+ Т-клеток у мышей
Summary
Здесь мы представляем протокол трансплантации опухоли для характеристики присущих опухоли и периферийных инфильтрированных опухолью лимфоцитов в модели опухоли мыши. Специфическое отслеживание притока иммунных клеток реципиентного происхождения с помощью проточной цитометрии выявляет динамику фенотипических и функциональных изменений этих клеток при противоопухолевых иммунных реакциях.
Abstract
Т-клеточный иммунитет играет решающую роль в иммунных реакциях против опухолей, причем цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) играют ведущую роль в искоренении раковых клеток. Однако происхождение и пополнение опухолевых антиген-специфических CD8+ Т-клеток в микроокружении опухоли (TME) остаются неясными. В этом протоколе используется клеточная линия меланомы B16F10-OVA, которая стабильно экспрессирует суррогатный неоантиген, овальбумин (OVA) и трансгенные TCR OT-I мыши, у которых более 90% CD8+ Т-клеток специфически распознают OVA-производный пептид OVA257-264 (SIINFEKL), связанный с молекулой основного комплекса гистосовместимости класса I (MHC) H2-Kb. Эти особенности позволяют изучать антиген-специфические ответы Т-клеток во время опухолевого генеза.
Комбинируя эту модель с хирургией трансплантации опухоли, опухолевые ткани от доноров были пересажены опухолевым сингенным мышам-реципиентам, чтобы точно проследить приток иммунных клеток реципиентного происхождения в трансплантированные донорские ткани, что позволяет анализировать иммунные реакции опухолевых и периферийно-специфических антиген-специфических CD8 + Т-клетки. Было обнаружено, что между этими двумя популяциями происходит динамический переход. В совокупности этот экспериментальный проект обеспечил еще один подход к точному исследованию иммунных реакций CD8 + Т-клеток в TME, что прольет новый свет на иммунологию опухолей.
Introduction
CD8 + Т-клеточный иммунный ответ играет ключевую роль в контроле роста опухоли. Во время опухолевого генеза наивные CD8+ Т-клетки активируются при распознавании антигена ограниченным способом MHC класса I и впоследствии дифференцируются в эффекторные клетки и проникают в опухолевую массу 1,2. Однако в микроокружении опухоли (TME) длительное воздействие антигена, а также иммуносупрессивные факторы приводят инфильтрированные опухолеспецифические CD8 + Т-клетки в гипочувствительное состояние, известное как «истощение»3. Истощенные Т-клетки (Tex) отличаются от эффекторных Т-клеток или Т-клеток памяти, генерируемых при острой вирусной инфекции, как транскрипционно, так и эпигенетически. Эти текс-клетки в основном характеризуются устойчивой и повышенной экспрессией ряда тормозных рецепторов, а также иерархической потерей эффекторных функций. Кроме того, нарушение пролиферативной способности истощенных CD8+ Т-клеток приводит к уменьшению количества опухолеспецифических Т-клеток, так что остаточные CD8+ Т-клетки в TME едва ли могут обеспечить достаточный защитный иммунитет против прогрессирования опухоли3. Таким образом, поддержание или подкрепление внутриопухолевых антиген-специфических CD8+ Т-клеток незаменимо для подавления опухоли.
Кроме того, считается, что терапия блокады иммунных контрольных точек (ICB) оживляет Tex в опухолях, увеличивая инфильтрацию Т-клеток и, следовательно, количество Т-клеток и омолаживая функции Т-клеток для усиления подавления опухоли. Широкое применение лечения ICB изменило ландшафт терапии рака, при этом значительная часть пациентов испытывает длительные ответы 4,5,6. Тем не менее, большинство пациентов и типов рака не реагируют или только временно реагируют на ICB. Неадекватная инфильтрация Т-клеток в TME была постулирована как один из основных механизмов, объясняющих устойчивость ICB 7,8.
Несколько исследований продемонстрировали гетерогенность инфильтрирующих опухоль CD8+ Т-клеток (ТИЛ) как у пациентов, так и у мышеймоделей 9,10,11,12. Было подтверждено, что подмножество CD8+ Т-клеток, экспрессирующих Т-клеточный фактор-1 (TCF1) в опухолевой массе, проявляет свойства, подобные стволовым клеткам, которые могут в дальнейшем привести к терминально истощенным Т-клеткам и ответственны за всплеск пролиферации после терапии ICB 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Однако было доказано, что лишь небольшая доля антиген-специфических TCF1+CD8+ Т-клеток существует в TME и генерирует расширенный пул дифференцированного потомства в ответ на ICB 23,24,25,26. Достаточно ли ограниченного размера этой популяции для обеспечения персистенции цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) для контроля прогрессирования опухоли, остается неизвестным, и есть ли пополнение из периферийных тканей, требует дальнейшего изучения. Кроме того, недавние исследования свидетельствуют о недостаточной способности к оживлению ранее существовавших опухолеспецифических Т-клеток и появлении новых, ранее не существовавших клонотипов после антизапрограммированного лечения белком гибели клеток 1. Это указывает на то, что реакция Т-клеток на блокаду контрольных точек может быть обусловлена новым притоком отдельного репертуара клонов Т-клеток27. Вместе с присутствием неопухолевой цитотоксической фракции Т-клеток в ТМЭ эти результаты побудили к созданию модели аллотрансплантата опухоли для изучения роли периферийных CD8+ Т-клеток11.
До сих пор несколько видов имплантации опухолей, а также приемный перенос иммунных клеток широко использовались в области иммунологии опухолей28. ТИЛ, мононуклеарные клетки периферической крови и опухолеспособные иммунные клетки, происходящие из других тканей, могут быть хорошо охарактеризованы с помощью этих методов. Однако при изучении взаимодействий между системным и местным противоопухолевым иммунитетом эти модели оказываются недостаточными для изучения взаимодействий между иммунными клетками, полученными с периферии и ТМЭ. Здесь опухолевые ткани были пересажены от доноров мышам-реципиентам, чтобы точно проследить приток иммунных клеток реципиентного происхождения и одновременно наблюдать за клетками донорского происхождения в TME.
В этом исследовании была установлена мышиная сингенная модель меланомы с клеточной линией меланомы B16F10-OVA, которая стабильно экспрессирует суррогатный неоантиген овальбумин. Трансгенные мыши TCR OT-I, у которых более 90% CD8+ Т-клеток специфически распознают OVA-производный пептид OVA257-264 (SIINFEKL), связанный с молекулой MHC класса I H2-Kb, позволяют изучать антиген-специфические ответы Т-клеток, разработанные в модели опухоли B16F10-OVA. Сочетая эту модель с трансплантацией опухоли, иммунные реакции присущих опухоли и происходящих на периферии антиген-специфических CD8 + Т-клеток сравнивались, чтобы выявить динамический переход между этими двумя популяциями. В совокупности этот экспериментальный проект обеспечил еще один подход к точному исследованию иммунных реакций CD8 + Т-клеток в TME, что проливает новый свет на динамику опухолеспецифических иммунных реакций Т-клеток в TME.
Protocol
Representative Results
Discussion
Т-клеточный иммунитет играет решающую роль в иммунных реакциях против опухолей, причем CTL играют ведущую роль в искоренении раковых клеток. Однако происхождение опухолевых антиген-специфических CTL в TME не было выяснено30. Использование этого протокола трансплантации опухо?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами Национального фонда естественных наук для выдающихся молодых ученых (No 31825011 для LY) и Национального фонда естественных наук Китая (No 31900643 для QH, No 31900656 для ZW).
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGPR33RB | |
| 1 mL tuberculin syringe | KDL | BB000925 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16F10-OVA cell line | bluefbio | BFN607200447 | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2 | BD Horizon | 562895 | Clone:104 |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19853 | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
Referências
- Blank, C. U., et al. Defining ‘T cell exhaustion. Nature Reviews Immunology. 19 (11), 665-674 (2019).
- Leko, V., Rosenberg, S. A. Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors. Cancer Cell. 38 (4), 454-472 (2020).
- McLane, L. M., Abdel-Hakeem, M. S., Wherry, E. J. CD8 T cell exhaustion during chronic viral infection and cancer. Annual Review of Immunology. 37, 457-495 (2019).
- Davis, M. M., Brodin, P. Rebooting human immunology. Annual Review of Immunology. 36, 843-864 (2018).
- Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
- Littman, D. R. Releasing the brakes on cancer immunotherapy. Cell. 373 (16), 1490-1492 (2015).
- Verma, V., et al. PD-1 blockade in subprimed CD8 cells induces dysfunctional PD-1(+)CD38(hi) cells and anti-PD-1 resistance. Nature Immunology. 20, 1231-1243 (2019).
- Hashimoto, M., et al. CD8 T cell exhaustion in chronic infection and cancer: opportunities for interventions. Annual Review of Medicine. 69, 301-318 (2018).
- Dammeijer, F., et al. The PD-1/PD-L1-checkpoint restrains T cell immunity in tumor-draining lymph nodes. Cancer Cell. 38 (5), 685-700 (2020).
- Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 8 (2), 000867 (2020).
- Philip, M., Schietinger, A. Heterogeneity and fate choice: T cell exhaustion in cancer and chronic infections. Current Opinion in Immunology. 58, 98-103 (2019).
- Miller, B. C., et al. Subsets of exhausted CD8(+) T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade. Nature Immunology. 20, 326-336 (2019).
- Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579, 274-278 (2020).
- Im, S. J., Konieczny, B. T., Hudson, W. H., Masopust, D., Ahmed, R. PD-1+ stemlike CD8 T cells are resident in lymphoid tissues during persistent LCMV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 117 (8), 4292-4299 (2020).
- Beltra, J. C., et al. Developmental relationships of four exhausted CD8(+) T cell subsets reveals underlying transcriptional and epigenetic landscape control mechanisms. Immunity. 52 (5), 825-841 (2020).
- Myers, L. M., et al. A functional subset of CD8(+) T cells during chronic exhaustion is defined by SIRPalpha expression. Nature Communications. 10 (1), 794 (2019).
- Jansen, C. S., et al. An intra-tumoral niche maintains and differentiates stem-like CD8 T cells. Nature. 576, 465-470 (2019).
- Jadhav, R. R., et al. Epigenetic signature of PD-1+ TCF1+ CD8 T cells that act as resource cells during chronic viral infection and respond to PD-1 blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 116 (28), 14113-14118 (2019).
- Li, H., et al. Dysfunctional CD8 T cells form a proliferative, dynamically regulated compartment within human melanoma. Cell. 176 (4), 775-789 (2018).
- Kurtulus, S., et al. Checkpoint blockade immunotherapy induces dynamic changes in PD-1(-)CD8(+) tumor-infiltrating T cells. Immunity. 50 (1), 181-194 (2019).
- Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in PD-1/PD-L1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), 124507 (2018).
- E, J. F., et al. CD8(+)CXCR5(+) T cells in tumor-draining lymph nodes are highly activated and predict better prognosis in colorectal cancer. Human Immunology. 79 (6), 446-452 (2018).
- Snell, L. M., et al. CD8(+) T cell priming in established chronic viral infection preferentially directs differentiation of memory-like cells for sustained immunity. Immunity. 49 (4), 678-694 (2018).
- Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+) T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195-211 (2019).
- Wang, Y., et al. The transcription factor TCF1 preserves the effector function of exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Frontiers in Immunology. 10, 169 (2019).
- Krishna, S., et al. Stem-like CD8 T cells mediate response of adoptive cell immunotherapy against human cancer. Science. 370 (6522), 1328-1334 (2020).
- Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nature Medicine. 25, 1251-1259 (2019).
- Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillere, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. Mouse models in oncoimmunology. Nature Reviews Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).
- Li, Y., et al. Bcl6 preserves the suppressive function of regulatory T cells during tumorigenesis. Frontiers in Immunology. 11, 806 (2020).
- Yu, D., Ye, L. A portrait of CXCR5(+) follicular cytotoxic CD8(+) T cells. Trends in Immunology. 39 (12), 965-979 (2018).
- Bracci, L., et al. Cyclophosphamide enhances the antitumor efficacy of adoptively transferred immune cells through the induction of cytokine expression, B-cell and T-cell homeostatic proliferation, and specific tumor infiltration. Clinical Cancer Research. 13 (2), 644-653 (2007).
- Salem, M. L., El-Naggar, S. A., Mahmoud, H. A., Elgharabawy, R. M., Bader, A. M. Cyclophosphamide eradicates murine immunogenic tumor coding for a non-self-antigen and induces antitumor immunity. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 32, 1-5 (2018).
- Thorsson, V., et al. The Immune landscape of cancer. Immunity. 48 (4), 812-830 (2018).
