השתלת גידול להערכת הדינמיקה של תאי T המסתננים לגידולים CD8+ בעכברים
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול השתלת גידול לאפיון לימפוציטים חודרים לגידולים שמקורם בגידול ובפריפריה במודל גידול בעכבר. מעקב ספציפי אחר זרם תאי מערכת החיסון שמקורם במקבל עם ציטומטריה של זרימה חושף את הדינמיקה של השינויים הפנוטיפיים והתפקודיים של תאים אלה במהלך תגובות חיסוניות אנטי-סרטניות.
Abstract
חסינות המתווכת על ידי תאי T ממלאת תפקיד מכריע בתגובות חיסוניות נגד גידולים, כאשר לימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T (CTLs) ממלאים את התפקיד המוביל במיגור תאים סרטניים. עם זאת, המקורות והחידוש של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן הגידול בתוך המיקרו-סביבה של הגידול (TME) נותרים מעורפלים. פרוטוקול זה משתמש בקו תאי המלנומה B16F10-OVA, המבטא ביציבות את הניאו-אנטיגן הפונדקאי, אובלבומין (OVA) ועכברי TCR מהונדסים OT-I, שבהם יותר מ-90% מתאי ה-T של CD8+ מזהים באופן ספציפי את הפפטיד הנגזר מ-OVA OVA257-264 (SIINFEKL) הקשור למולקולה הגדולה מסוג I של קומפלקס היסטו-קומפטביליות (MHC) H2-Kb. תכונות אלה מאפשרות לחקור תגובות של תאי T ספציפיים לאנטיגן במהלך הגידול.
בשילוב מודל זה עם ניתוח השתלת גידולים, רקמות גידול מתורמים הושתלו בעכברים מושתלים סינגניים המותאמים לגידול כדי להתחקות במדויק אחר זרם תאי החיסון שמקורם במקבל לרקמות תורם מושתלות, מה שמאפשר ניתוח של התגובות החיסוניות של CD8+ הטבוע בגידול ומקורו בפריפריה תאי T. נמצא כי בין שתי האוכלוסיות הללו מתרחש מעבר דינמי. באופן קולקטיבי, תכנון ניסיוני זה סיפק גישה נוספת כדי לחקור במדויק את התגובה החיסונית של תאי CD8+ T ב- TME, אשר ישפוך אור חדש על אימונולוגיה של גידולים.
Introduction
לתגובה חיסונית בתיווך תאי T CD8+ יש תפקיד מרכזי בשליטה על צמיחת הגידול. במהלך הגידול, תאי T תמימים מסוג CD8+ מופעלים עם זיהוי אנטיגן באופן מוגבל I מסוג MHC ולאחר מכן מתמיינים לתאים אפקטיביים ומסתננים למסת הגידול 1,2. עם זאת, בתוך המיקרו-סביבה של הגידול (TME), חשיפה ממושכת לאנטיגן, כמו גם גורמים מדכאי חיסון, דוחפים תאי CD8+ T ספציפיים לגידולים חודרים למצב היפו-רספונסיבי המכונה “תשישות”3. תאי T מותשים (Tex) נבדלים מתאי T משפיעים או זיכרון הנוצרים בזיהום נגיפי חריף, הן מבחינה שעתוקית והן מבחינה אפיגנטית. תאי טקס אלה מאופיינים בעיקר בביטוי מתמשך ומוגבה של סדרה של קולטנים מעכבים, כמו גם באובדן היררכי של תפקודי אפקטור. יתר על כן, יכולת ההתפשטות הפגומה של תאי CD8+ T מותשים גורמת לירידה במספר תאי ה-T הספציפיים לגידול, כך שתאי ה-CD8+ T השיוריים בתוך ה-TME בקושי יכולים לספק חסינות מגנה מספקת מפני התקדמות הגידול3. לפיכך, תחזוקה או חיזוק של תאי T ספציפיים לאנטיגן תוך-סרטניים מסוג CD8+ חיוניים להדחקת הגידול.
יתר על כן, טיפול בחסימת מחסום חיסוני (ICB) הוא האמין להמריץ מחדש את טקס בגידולים על ידי הגדלת חדירת תאי T ומכאן, מספרי תאי T וחידוש תפקודי תאי T להגברת דיכוי הגידול. היישום הנרחב של טיפול ICB שינה את נוף הטיפול בסרטן, עם תת-קבוצה משמעותית של חולים שחוו תגובות עמידות 4,5,6. עם זאת, רוב החולים וסוגי הסרטן אינם מגיבים או רק באופן זמני ל- ICB. חדירה לא מספקת של תאי T ב-TME הונחה כאחד המנגנונים הבסיסיים האחראים להתנגדות ל-ICB 7,8.
מספר מחקרים הדגימו את ההטרוגניות של תאי T מסתננים לגידולים מסוג CD8+ (TILs) הן בחולים והן במודלים של עכברים 9,10,11,12. אושר כי תת-קבוצה של תאי T מסוג CD8+ המבטאים את פקטור תאי T 1 (TCF1) במסת הגידול מפגינים תכונות דמויות תאי גזע, מה שעלול להוליד עוד יותר תאי T מותשים סופניים ואחראי להתפרצות ההתפשטות לאחר טיפול ICB 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. עם זאת, הוכח כי רק חלק קטן מתאי TCF1+CD8+ T הספציפיים לאנטיגן קיימים ב-TME ומייצרים מאגר מורחב של צאצאים ממוינים בתגובה ל-ICB 23,24,25,26. האם הגודל המוגבל של אוכלוסייה זו מספיק כדי להבטיח את ההתמדה של לימפוציטים T ציטוטוקסיים (CTLs) כדי לשלוט בהתקדמות הגידול עדיין לא ידוע, והאם יש חידוש מרקמות פריפריה דורש חקירה נוספת. יתר על כן, מחקרים עדכניים מצביעים על יכולת ההתחדשות הבלתי מספקת של תאי T ספציפיים לגידול הקיימים מראש ועל הופעתם של קלונוטיפים חדשים, שבעבר לא היו קיימים, לאחר טיפול אנטי-מתוכנת בחלבון מוות תאי 1. זה מצביע על כך שתגובת תאי T לחסימת מחסום עשויה לנבוע מהזרם החדש של רפרטואר מובהק של שיבוטים של תאי T27. יחד עם הימצאותו של שבר תאי T ציטוטוקסיים שאינם תגובתיים לגידולים ב-TME, ממצאים אלה הניעו את הקמתו של מודל אלוגרפט גידולי כדי לחקור את תפקידם של תאי CD8+ T שמקורם בפריפריה11.
עד כה, מספר סוגים של השתלת גידול, כמו גם העברה מאמצת של תאים חיסוניים, היו בשימוש נרחב בתחום האימונולוגיה של הגידול28. TILs, תאים חד-גרעיניים בדם היקפי ותאי חיסון תגובתיים לגידול שמקורם ברקמות אחרות יכולים להיות מאופיינים היטב בשיטות אלה. עם זאת, כאשר חוקרים את יחסי הגומלין בין חסינות מערכתית לחסינות מקומית נגד סרטנים, נראה כי מודלים אלה אינם מספיקים כדי לבחון את האינטראקציות בין תאי מערכת החיסון שמקורם בפריפריה לבין ה-TME. כאן, רקמות הגידול הושתלו מתורמים לעכברים מושתלים המותאמים לגידול כדי להתחקות במדויק אחר זרם תאי החיסון שמקורם במקבלי ההשתנה ולבחון את התאים שמקורם בתורמים ב-TME במקביל.
במחקר זה, מודל סיgeneic של מורין של מלנומה נקבע עם קו תאי מלנומה B16F10-OVA, אשר מבטא ביציבות את הפונדקאית neoantigen ovalbumin. עכברי TCR מהונדסים OT-I, שבהם יותר מ-90% מתאי ה-T של CD8+ מזהים באופן ספציפי את הפפטיד OVA OVA257-264 שמקורו ב-OVA (SIINFEKL) הקשור למולקולת ה-MHC H2-Kb מסוג I, מאפשרים לחקור את תגובות תאי ה-T הספציפיים לאנטיגן שפותחו במודל הגידול B16F10-OVA. בשילוב מודל זה עם השתלת גידולים, הושוו התגובה החיסונית של תאי CD8+ T הטבועים בגידול ובפריפריה כדי לחשוף מעבר דינמי בין שתי אוכלוסיות אלה. באופן קולקטיבי, תכנון ניסיוני זה סיפק גישה נוספת כדי לחקור במדויק את התגובות החיסוניות של תאי CD8+ T ב-TME, מה ששופך אור חדש על הדינמיקה של תגובות חיסוניות של תאי T ספציפיים לגידול ב-TME.
Protocol
Representative Results
Discussion
חסינות המתווכת על ידי תאי T ממלאת תפקיד מכריע בתגובות חיסוניות נגד גידולים, כאשר CTLs ממלאים את התפקיד המוביל במיגור תאים סרטניים. עם זאת, המקורות של CTLs ספציפיים לאנטיגן הגידול בתוך TME לא הובהרו30. השימוש בפרוטוקול השתלת גידול זה סיפק רמז חשוב לכך שתאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן ת…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע לחוקרים צעירים מצטיינים (מס ‘31825011 ל- LY) ומהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס ‘31900643 ל- QH, מס ‘ 31900656 עד ZW).
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGPR33RB | |
| 1 mL tuberculin syringe | KDL | BB000925 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16F10-OVA cell line | bluefbio | BFN607200447 | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2 | BD Horizon | 562895 | Clone:104 |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19853 | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
Referências
- Blank, C. U., et al. Defining ‘T cell exhaustion. Nature Reviews Immunology. 19 (11), 665-674 (2019).
- Leko, V., Rosenberg, S. A. Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors. Cancer Cell. 38 (4), 454-472 (2020).
- McLane, L. M., Abdel-Hakeem, M. S., Wherry, E. J. CD8 T cell exhaustion during chronic viral infection and cancer. Annual Review of Immunology. 37, 457-495 (2019).
- Davis, M. M., Brodin, P. Rebooting human immunology. Annual Review of Immunology. 36, 843-864 (2018).
- Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
- Littman, D. R. Releasing the brakes on cancer immunotherapy. Cell. 373 (16), 1490-1492 (2015).
- Verma, V., et al. PD-1 blockade in subprimed CD8 cells induces dysfunctional PD-1(+)CD38(hi) cells and anti-PD-1 resistance. Nature Immunology. 20, 1231-1243 (2019).
- Hashimoto, M., et al. CD8 T cell exhaustion in chronic infection and cancer: opportunities for interventions. Annual Review of Medicine. 69, 301-318 (2018).
- Dammeijer, F., et al. The PD-1/PD-L1-checkpoint restrains T cell immunity in tumor-draining lymph nodes. Cancer Cell. 38 (5), 685-700 (2020).
- Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 8 (2), 000867 (2020).
- Philip, M., Schietinger, A. Heterogeneity and fate choice: T cell exhaustion in cancer and chronic infections. Current Opinion in Immunology. 58, 98-103 (2019).
- Miller, B. C., et al. Subsets of exhausted CD8(+) T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade. Nature Immunology. 20, 326-336 (2019).
- Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579, 274-278 (2020).
- Im, S. J., Konieczny, B. T., Hudson, W. H., Masopust, D., Ahmed, R. PD-1+ stemlike CD8 T cells are resident in lymphoid tissues during persistent LCMV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 117 (8), 4292-4299 (2020).
- Beltra, J. C., et al. Developmental relationships of four exhausted CD8(+) T cell subsets reveals underlying transcriptional and epigenetic landscape control mechanisms. Immunity. 52 (5), 825-841 (2020).
- Myers, L. M., et al. A functional subset of CD8(+) T cells during chronic exhaustion is defined by SIRPalpha expression. Nature Communications. 10 (1), 794 (2019).
- Jansen, C. S., et al. An intra-tumoral niche maintains and differentiates stem-like CD8 T cells. Nature. 576, 465-470 (2019).
- Jadhav, R. R., et al. Epigenetic signature of PD-1+ TCF1+ CD8 T cells that act as resource cells during chronic viral infection and respond to PD-1 blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 116 (28), 14113-14118 (2019).
- Li, H., et al. Dysfunctional CD8 T cells form a proliferative, dynamically regulated compartment within human melanoma. Cell. 176 (4), 775-789 (2018).
- Kurtulus, S., et al. Checkpoint blockade immunotherapy induces dynamic changes in PD-1(-)CD8(+) tumor-infiltrating T cells. Immunity. 50 (1), 181-194 (2019).
- Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in PD-1/PD-L1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), 124507 (2018).
- E, J. F., et al. CD8(+)CXCR5(+) T cells in tumor-draining lymph nodes are highly activated and predict better prognosis in colorectal cancer. Human Immunology. 79 (6), 446-452 (2018).
- Snell, L. M., et al. CD8(+) T cell priming in established chronic viral infection preferentially directs differentiation of memory-like cells for sustained immunity. Immunity. 49 (4), 678-694 (2018).
- Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+) T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195-211 (2019).
- Wang, Y., et al. The transcription factor TCF1 preserves the effector function of exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Frontiers in Immunology. 10, 169 (2019).
- Krishna, S., et al. Stem-like CD8 T cells mediate response of adoptive cell immunotherapy against human cancer. Science. 370 (6522), 1328-1334 (2020).
- Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nature Medicine. 25, 1251-1259 (2019).
- Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillere, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. Mouse models in oncoimmunology. Nature Reviews Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).
- Li, Y., et al. Bcl6 preserves the suppressive function of regulatory T cells during tumorigenesis. Frontiers in Immunology. 11, 806 (2020).
- Yu, D., Ye, L. A portrait of CXCR5(+) follicular cytotoxic CD8(+) T cells. Trends in Immunology. 39 (12), 965-979 (2018).
- Bracci, L., et al. Cyclophosphamide enhances the antitumor efficacy of adoptively transferred immune cells through the induction of cytokine expression, B-cell and T-cell homeostatic proliferation, and specific tumor infiltration. Clinical Cancer Research. 13 (2), 644-653 (2007).
- Salem, M. L., El-Naggar, S. A., Mahmoud, H. A., Elgharabawy, R. M., Bader, A. M. Cyclophosphamide eradicates murine immunogenic tumor coding for a non-self-antigen and induces antitumor immunity. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 32, 1-5 (2018).
- Thorsson, V., et al. The Immune landscape of cancer. Immunity. 48 (4), 812-830 (2018).
