Her presenterer vi en tumortransplantasjonsprotokoll for karakterisering av tumor-iboende og periferi-avledede tumorinfiltrerte lymfocytter i en musesvulstmodell. Spesifikk sporing av tilstrømningen av mottakeravledede immunceller med strømningscytometri avslører dynamikken i fenotypiske og funksjonelle endringer i disse cellene under antitumor immunresponser.
T cellemediert immunitet spiller en avgjørende rolle i immunresponser mot svulster, med cytotoksiske T-lymfocytter (CTLer) som spiller hovedrollen i å utrydde kreftceller. Opprinnelsen og etterfyllingen av tumorantigenspesifikke CD8+ T-celler i tumormikromiljøet (TME) forblir imidlertid uklare. Denne protokollen bruker cellelinjen B16F10-OVA melanom, som stabilt uttrykker surrogat neoantigen, ovalbumin (OVA) og TCR transgene OT-I mus, der over 90% av CD8 + T-cellene spesifikt gjenkjenner det OVA-avledede peptidet OVA257-264 (SIINFEKL) bundet til klassen I store histokompatibilitetskompleks (MHC) molekyl H2-Kb. Disse funksjonene muliggjør studiet av antigenspesifikke T-celleresponser under tumorigenese.
Ved å kombinere denne modellen med tumortransplantasjonskirurgi ble tumorvev fra donorer transplantert til tumortilpassede syngeneiske mottakermus for å spore tilstrømningen av mottakeravledede immunceller til transplantert donorvev, slik at analysen av immunresponsene til tumor-iboende og periferi-stammer antigenspesifikk CD8+ T celler. Det ble funnet en dynamisk overgang mellom disse to populasjonene. Samlet har denne eksperimentelle designen gitt en annen tilnærming for å nøyaktig undersøke immunresponsene til CD8 + T-celler i TME, som vil kaste nytt lys over tumorimmunologi.
CD8+ T cellemediert immunrespons spiller en sentral rolle i å kontrollere tumorvekst. Under tumorigenese aktiveres naive CD8+ T-celler ved antigengjenkjenning på en MHC-klasse I-begrenset måte og skiller seg deretter ut i effektorceller og infiltrerer i tumormasse 1,2. Men innenfor tumormikromiljøet (TME), langvarig antigeneksponering, samt immundempende faktorer, driver infiltrerte tumorspesifikke CD8+ T-celler inn i en hyporesponsiv tilstand kjent som “utmattelse”3. Utmattede T-celler (Tex) skiller seg fra effektor- eller minne T-celler generert i akutt virusinfeksjon, både transkripsjonelt og epigenetisk. Disse Tex-cellene er hovedsakelig preget av det vedvarende og forhøyede uttrykket av en rekke hemmende reseptorer, samt det hierarkiske tapet av effektorfunksjoner. Videre resulterer den svekkede proliferative kapasiteten til utmattede CD8 + T-celler i synkende antall tumorspesifikke T-celler, slik at de resterende CD8 + T-cellene i TME knapt kan gi tilstrekkelig beskyttende immunitet mot tumorprogresjon3. Dermed er vedlikehold eller forsterkning av intratumorale antigenspesifikke CD8 + T-celler uunnværlig for tumorundertrykkelse.
Videre antas immunkontrollpunktblokade (ICB) terapi å gjenopplive Tex i svulster ved å øke T-celleinfiltrasjonen og dermed T-celletall og forynge T-cellefunksjoner for å øke tumorundertrykkelsen. Den utbredte anvendelsen av ICB-behandling har endret kreftterapilandskapet, med en betydelig undergruppe av pasienter som opplever holdbare responser 4,5,6. Likevel reagerer de fleste pasienter og krefttyper ikke eller bare midlertidig på ICB. Utilstrekkelig T-celleinfiltrasjon i TME er postulert til å være en av de underliggende mekanismene som står for ICB-resistens 7,8.
Flere studier har vist heterogeniteten til tumorinfiltrerende CD8+ T-celler (TILer) hos både pasienter og musemodeller 9,10,11,12. Det har blitt bekreftet at en undergruppe av CD8+ T-celler som uttrykker T-cellefaktor-1 (TCF1) i en tumormasse viser stamcellelignende egenskaper, noe som ytterligere kan gi opphav til terminalt utmattede T-celler og er ansvarlig for spredningsutbruddet etter ICB-terapi 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Imidlertid har det vist seg at bare en liten andel av antigenspesifikke TCF1 + CD8 + T-celler eksisterer i TME og genererer et utvidet utvalg av differensiert avkom som svar på ICB 23,24,25,26. Hvorvidt den begrensede størrelsen på denne befolkningen er nok til å sikre utholdenheten til cytotoksiske T-lymfocytter (CTLer) for å kontrollere tumorprogresjon, forblir ukjent, og om det er etterfylling fra periferivev krever videre undersøkelse. Videre antyder nyere forskning den utilstrekkelige gjenoppfriskningskapasiteten til eksisterende tumorspesifikke T-celler og utseendet på nye, tidligere ikke-eksisterende clonotyper etter antiprogrammert celledødsprotein 1-behandling. Dette indikerer at T-cellerespons på kontrollpunktblokade kan skyldes den nye tilstrømningen av et tydelig repertoar av T-cellekloner27. Sammen med tilstedeværelsen av tilskuer ikke-tumor-reaktiv cytotoksisk T-cellefraksjon i TME, førte disse funnene til etableringen av en tumor allograft modell for å studere rollen som periferi-avledede CD8 + T-celler11.
Inntil nå har flere typer tumorimplantasjon, samt immuncelle adoptivoverføring, blitt mye brukt innen tumorimmunologi28. TILer, perifere mononukleære celler i blodet og tumorreaktive immunceller som stammer fra andre vev, kan karakteriseres godt ved hjelp av disse metodene. Men når man studerer interaksjonene mellom systemisk og lokal antitumorimmunitet, virker disse modellene utilstrekkelige til å undersøke samspillet mellom immunceller avledet fra periferien og TME. Her ble tumorvev transplantert fra donorer til tumortilpassede mottakermus for å spore tilstrømningen av mottakeravledede immunceller og observere donoravledede celler i TME samtidig.
I denne studien ble det etablert en murine syngeneisk modell av melanom med cellelinjen B16F10-OVA melanom, som stabilt uttrykker surrogat neoantigen ovalbumin. TCR transgene OT-I-mus, der over 90% av CD8 + T-cellene spesifikt gjenkjenner det OVA-avledede peptidet OVA257-264 (SIINFEKL) bundet til klassen I MHC-molekyl H2-Kb, muliggjør studiet av antigenspesifikke T-celleresponser utviklet i B16F10-OVA tumormodellen. Ved å kombinere denne modellen med tumortransplantasjon ble immunresponsene til tumor-iboende og periferi-stammer antigenspesifikke CD8+ T-celler sammenlignet med å avsløre en dynamisk overgang mellom disse to populasjonene. Samlet har denne eksperimentelle designen gitt en annen tilnærming for å nøyaktig undersøke immunresponsene til CD8 + T-celler i TME, som kaster nytt lys over dynamikken i tumorspesifikke T-celleimmuneresponser i TME.
T cellemediert immunitet spiller en avgjørende rolle i immunresponser mot svulster, med CTLer som spiller hovedrollen i å utrydde kreftceller. Opprinnelsen til tumorantigenspesifikke CTLer i TME har imidlertid ikke blitt belyst30. Bruken av denne tumortransplantasjonsprotokollen har gitt en viktig anelse om at intratumorale antigenspesifikke CD8+ T-celler kanskje ikke vedvarer i lang tid, til tross for eksistensen av stamceller som TCF1 + stamfar CD8 + T-celler. …
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (No. 31825011 to LY) og National Natural Science Foundation of China (Nr. 31900643 til QH, Nr. 31900656 til ZW).
0.22 μm filter | Millipore | SLGPR33RB | |
1 mL tuberculin syringe | KDL | BB000925 | |
1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
B16F10-OVA cell line | bluefbio | BFN607200447 | |
BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2 | BD Horizon | 562895 | Clone:104 |
cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19853 | |
EDTA | Sigma | EDS-500g | |
FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
sodium azide | Sigma | S2002 | |
surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |