Här presenterar vi ett tumörtransplantationsprotokoll för karakterisering av tumör-inneboende och periferi-härledda tumörinfiltrerade lymfocyter i en mustumörmodell. Specifik spårning av tillströmningen av mottagarhärledda immunceller med flödescytometri avslöjar dynamiken i de fenotypiska och funktionella förändringarna hos dessa celler under antitumörimmunsvar.
T-cellmedierad immunitet spelar en avgörande roll i immunsvar mot tumörer, med cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) som spelar den ledande rollen för att utrota cancerceller. Ursprunget och påfyllningen av tumörantigenspecifika CD8 + T-celler inom tumörmikromiljön (TME) förblir emellertid oklara. Detta protokoll använder B16F10-OVA melanomcellinjen, som stabilt uttrycker surrogatneoantigen, ovalbumin (OVA) och TCR-transgena OT-I-möss, där över 90% av CD8 + T-cellerna specifikt känner igen den OVA-härledda peptiden OVA257-264 (SIINFEKL) bunden till klass I-molekylen H2-Kb. Dessa funktioner möjliggör studier av antigenspecifika T-cellsvar under tumorigenes.
Genom att kombinera denna modell med tumörtransplantationskirurgi transplanterades tumörvävnader från givare till tumörmatchade syngena mottagarmöss för att exakt spåra tillströmningen av mottagarhärledda immunceller till transplanterade donatorvävnader, vilket möjliggjorde analys av immunsvaren hos tumör-inneboende och periferi-ursprung antigenspecifik CD8+ T-celler. En dynamisk övergång visade sig inträffa mellan dessa två populationer. Sammantaget har denna experimentella design gett ett annat tillvägagångssätt för att exakt undersöka immunsvaren hos CD8 + T-celler i TME, vilket kommer att kasta nytt ljus på tumörimmunologi.
CD8+ T-cellmedierat immunsvar spelar en avgörande roll för att kontrollera tumörtillväxt. Under tumorigenes aktiveras naiva CD8 + T-celler vid antigenigenkänning på ett MHC klass I-begränsat sätt och differentieras därefter till effektorceller och infiltrerar i tumörmassa 1,2. Inom tumörmikromiljön (TME) driver emellertid långvarig antigenexponering, liksom immunsuppressiva faktorer, infiltrerade tumörspecifika CD8 + T-celler till ett hyporesponsivt tillstånd som kallas “utmattning”3. Utmattade T-celler (Tex) skiljer sig från effektor- eller minnes-T-celler som genereras vid akut virusinfektion, både transkriptionellt och epigenetiskt. Dessa Tex-celler kännetecknas huvudsakligen av det ihållande och förhöjda uttrycket av en serie hämmande receptorer samt den hierarkiska förlusten av effektorfunktioner. Vidare resulterar den försämrade proliferativa kapaciteten hos utmattade CD8 + T-celler i minskande antal tumörspecifika T-celler, så att de återstående CD8 + T-cellerna i TME knappt kan ge tillräcklig skyddande immunitet mot tumörprogression3. Således är underhåll eller förstärkning av intratumorala antigenspecifika CD8 + T-celler oumbärliga för tumörförtryck.
Dessutom antas immunkontrollpunktsblockad (ICB) -terapi återuppliva Tex i tumörer genom att öka T-cellinfiltrationen och därmed T-cellnummer och föryngra T-cellfunktioner för att öka tumörrepressionen. Den utbredda tillämpningen av ICB-behandling har förändrat cancerterapilandskapet, med en betydande delmängd av patienterna som upplever varaktiga svar 4,5,6. Ändå svarar majoriteten av patienter och cancertyper inte eller bara tillfälligt på ICB. Otillräcklig T-cellinfiltration i TME har postulerats vara en av de underliggande mekanismerna som står för ICB-resistens 7,8.
Flera studier har visat heterogeniteten hos tumörinfiltrerande CD8 + T-celler (TILs) hos både patienter och musmodeller 9,10,11,12. Det har bekräftats att en delmängd av CD8 + T-celler som uttrycker T-cellfaktor-1 (TCF1) i en tumörmassa uppvisar stamcellsliknande egenskaper, vilket ytterligare kan ge upphov till terminalt utmattade T-celler och är ansvarig för spridningsutbrottet efter ICB-terapi 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Det har emellertid visat sig att endast en liten andel antigenspecifika TCF1 + CD8 + T-celler finns i TME och genererar en utökad pool av differentierad avkomma som svar på ICB 23,24,25,26. Huruvida den begränsade storleken på denna population är tillräcklig för att säkerställa persistensen av cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) för att kontrollera tumörprogression är fortfarande okänd, och om det finns påfyllning från periferivävnader kräver ytterligare undersökning. Vidare tyder ny forskning på otillräcklig återupplivningskapacitet hos redan existerande tumörspecifika T-celler och utseendet på nya, tidigare icke-existerande klonotyper efter antiprogrammerad celldödsprotein 1-behandling. Detta indikerar att T-cellsvaret på kontrollpunktsblockad kan bero på den nya tillströmningen av en distinkt repertoar av T-cellkloner27. Tillsammans med närvaron av åskådare icke-tumörreaktiv cytotoxisk T-cellfraktion i TME, föranledde dessa fynd inrättandet av en tumör allograftmodell för att studera rollen av periferi-härledda CD8 + T-celler11.
Hittills har flera typer av tumörimplantation, liksom immuncellsad adoptivöverföring, använts i stor utsträckning inom tumörimmunologi28. TILs, perifera blodmononukleära celler och tumörreaktiva immunceller som härrör från andra vävnader kan karakteriseras väl med hjälp av dessa metoder. Men när man studerar interaktionerna mellan systemisk och lokal antitumörimmunitet verkar dessa modeller otillräckliga för att undersöka interaktionerna mellan immunceller som härrör från periferin och TME. Här transplanterades tumörvävnader från donatorer till tumörmatchade mottagarmöss för att exakt spåra tillströmningen av mottagarhärledda immunceller och observera de givar-härledda cellerna i TME samtidigt.
I denna studie etablerades en murin syngen modell av melanom med B16F10-OVA melanomcellinjen, som stabilt uttrycker surrogat neoantigen ovalbumin. TCR-transgena OT-I-möss, där över 90% av CD8 + T-cellerna specifikt känner igen den OVA-härledda peptiden OVA257-264 (SIINFEKL) bunden till klass I MHC-molekylen H2-Kb, möjliggör studier av antigenspecifika T-cellsvar som utvecklats i B16F10-OVA-tumörmodellen. Genom att kombinera denna modell med tumörtransplantation jämfördes immunsvaren hos tumör-inneboende och periferi-originerade antigenspecifika CD8 + T-celler för att avslöja en dynamisk övergång mellan dessa två populationer. Sammantaget har denna experimentella design gett ett annat tillvägagångssätt för att exakt undersöka immunsvaren hos CD8 + T-celler i TME, vilket ger nytt ljus på dynamiken i tumörspecifika T-cellsimmunsvar i TME.
T-cellmedierad immunitet spelar en avgörande roll i immunsvar mot tumörer, med CTL som spelar den ledande rollen för att utrota cancerceller. Ursprunget till tumörantigenspecifika CTL inom TME har dock inte belysts30. Användningen av detta tumörtransplantationsprotokoll har gett en viktig ledtråd om att intratumorala antigenspecifika CD8 + T-celler kanske inte kvarstår under lång tid, trots förekomsten av stamliknande TCF1 + stamfader CD8 + T-celler. I sy…
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av bidrag från National Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (nr 31825011 till LY) och National Natural Science Foundation of China (nr 31900643 till QH, nr 31900656 till ZW).
0.22 μm filter | Millipore | SLGPR33RB | |
1 mL tuberculin syringe | KDL | BB000925 | |
1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
B16F10-OVA cell line | bluefbio | BFN607200447 | |
BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2 | BD Horizon | 562895 | Clone:104 |
cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19853 | |
EDTA | Sigma | EDS-500g | |
FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
sodium azide | Sigma | S2002 | |
surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |