Tumortransplantation til vurdering af dynamikken i tumorinfiltrerende CD8 + T-celler i mus
Summary
Her præsenterer vi en tumortransplantationsprotokol til karakterisering af tumor-iboende og periferi-afledte tumorinfiltrerede lymfocytter i en musetumormodel. Specifik sporing af tilstrømningen af modtagerafledte immunceller med flowcytometri afslører dynamikken i de fænotypiske og funktionelle ændringer af disse celler under antitumorimmunresponser.
Abstract
T-cellemedieret immunitet spiller en afgørende rolle i immunresponser mod tumorer, hvor cytotoksiske T-lymfocytter (CTL’er) spiller hovedrollen i udryddelsen af kræftceller. Oprindelsen og genopfyldningen af tumorantigenspecifikke CD8 + T-celler i tumormikromiljøet (TME) forbliver imidlertid uklar. Denne protokol anvender B16F10-OVA melanomcellelinjen, som stabilt udtrykker surrogatneoantigenet, ovalbumin (OVA) og TCR transgene OT-I-mus, hvor over 90% af CD8 + T-cellerne specifikt genkender det OVA-afledte peptid OVA257-264 (SIINFEKL) bundet til klasse I større histokompatibilitetskompleks (MHC) molekyle H2-Kb. Disse funktioner muliggør undersøgelse af antigenspecifikke T-celleresponser under tumorgenese.
Ved at kombinere denne model med tumortransplantationskirurgi blev tumorvæv fra donorer transplanteret i tumormatchede syngeneiske modtagermus for præcist at spore tilstrømningen af modtagerafledte immunceller til transplanterede donorvæv, hvilket ifølge analysen af immunresponserne fra tumor-iboende og periferi-stammer antigenspecifik CD8+ T-celler. En dynamisk overgang viste sig at forekomme mellem disse to populationer. Samlet set har dette eksperimentelle design givet en anden tilgang til præcist at undersøge immunresponserne fra CD8 + T-celler i TME, hvilket vil kaste nyt lys over tumorimmunologi.
Introduction
CD8 + T-cellemedieret immunrespons spiller en central rolle i at kontrollere tumorvækst. Under tumorgenese aktiveres naive CD8 + T-celler ved antigengenkendelse på en MHC klasse I-begrænset måde og differentieres derefter til effektorceller og infiltreres i tumormasse 1,2. Inden for tumormikromiljøet (TME) driver langvarig antigeneksponering såvel som immunsuppressive faktorer imidlertid infiltrerede tumorspecifikke CD8 + T-celler i en hyporesponsiv tilstand kendt som “udmattelse”3. Udmattede T-celler (Tex) adskiller sig fra effektor- eller hukommelses-T-celler, der genereres ved akut virusinfektion, både transkriptionelt og epigenetisk. Disse Tex-celler er hovedsageligt karakteriseret ved den vedvarende og forhøjede ekspression af en række hæmmende receptorer samt det hierarkiske tab af effektorfunktioner. Endvidere resulterer den nedsatte proliferative kapacitet af udmattede CD8 + T-celler i faldende antal tumorspecifikke T-celler, således at de resterende CD8 + T-celler i TME næppe kan tilvejebringe tilstrækkelig beskyttende immunitet mod tumorprogression3. Således er vedligeholdelse eller forstærkning af intratumorale antigenspecifikke CD8 + T-celler uundværlig for tumorundertrykkelse.
Desuden menes immun checkpoint blokade (ICB) terapi at genoplive Tex i tumorer ved at øge T-celleinfiltration og dermed T-cellenumre og foryngende T-cellefunktioner for at øge tumorundertrykkelsen. Den udbredte anvendelse af ICB-behandling har ændret kræftbehandlingslandskabet, hvor en betydelig delmængde af patienter oplever holdbare reaktioner 4,5,6. Ikke desto mindre reagerer størstedelen af patienterne og kræfttyperne ikke eller kun midlertidigt på ICB. Utilstrækkelig T-celleinfiltration i TME er blevet postuleret at være en af de underliggende mekanismer, der tegner sig for ICB-resistens 7,8.
Flere undersøgelser har vist heterogeniteten af tumorinfiltrerende CD8 + T-celler (TIL’er) hos både patienter og musemodeller 9,10,11,12. Det er blevet bekræftet, at en delmængde af CD8 + T-celler, der udtrykker T-cellefaktor-1 (TCF1) i en tumormasse, udviser stamcellelignende egenskaber, hvilket yderligere kan give anledning til terminalt udmattede T-celler og er ansvarlig for proliferationsudbruddet efter ICB-terapi 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Det er imidlertid blevet bevist, at kun en lille del af antigenspecifikke TCF1 + CD8 + T-celler findes i TME og genererer en udvidet pulje af differentierede afkom som reaktion på ICB 23,24,25,26. Hvorvidt den begrænsede størrelse af denne population er tilstrækkelig til at sikre persistensen af cytotoksiske T-lymfocytter (CTL’er) til at kontrollere tumorprogression forbliver ukendt, og om der er genopfyldning fra periferivæv, kræver yderligere undersøgelse. Desuden tyder nyere forskning på den utilstrækkelige genoplivningskapacitet af allerede eksisterende tumorspecifikke T-celler og udseendet af nye, tidligere ikke-eksisterende clonotyper efter anti-programmeret celledødsprotein 1-behandling. Dette indikerer, at T-cellerespons på checkpoint-blokade kan skyldes den nye tilstrømning af et særskilt repertoire af T-cellekloner27. Sammen med tilstedeværelsen af tilskuer ikke-tumor-reaktiv cytotoksisk T-cellefraktion i TME førte disse fund til etablering af en tumorallograftmodel til at studere rollen som periferiafledte CD8 + T-celler11.
Indtil nu har flere former for tumorimplantation samt immuncelleadopteloverførsel været meget udbredt inden for tumorimmunologi28. TIG’er, mononukleære celler i perifert blod og tumorreaktive immunceller, der stammer fra andre væv, kan karakteriseres godt ved hjælp af disse metoder. Når man studerer interaktionerne mellem systemisk og lokal antitumorimmunitet, synes disse modeller imidlertid utilstrækkelige til at undersøge interaktionerne mellem immunceller afledt af periferien og TME. Her blev tumorvæv transplanteret fra donorer til tumormatchede modtagermus for præcist at spore tilstrømningen af modtagerafledte immunceller og observere de donorafledte celler i TME samtidigt.
I denne undersøgelse blev der etableret en murine syngeneisk model af melanom med B16F10-OVA melanomcellelinjen, som stabilt udtrykker surrogat neoantigen ovalbumin. TCR-transgene OT-I-mus, hvor over 90% af CD8 + T-cellerne specifikt genkender det OVA-afledte peptid OVA257-264 (SIINFEKL), der er bundet til klasse I MHC-molekylet H2-Kb, muliggør undersøgelse af antigenspecifikke T-celleresponser udviklet i B16F10-OVA-tumormodellen. Ved at kombinere denne model med tumortransplantation blev immunresponserne fra tumor-iboende og periferi-stammer antigenspecifikke CD8 + T-celler sammenlignet for at afsløre en dynamisk overgang mellem disse to populationer. Samlet set har dette eksperimentelle design givet en anden tilgang til præcist at undersøge immunresponserne fra CD8 + T-celler i TME, hvilket kaster nyt lys over dynamikken i tumorspecifikke T-celleimmunresponser i TME.
Protocol
Representative Results
Discussion
T-cellemedieret immunitet spiller en afgørende rolle i immunresponser mod tumorer, hvor CTL’er spiller hovedrollen i udryddelsen af kræftceller. Oprindelsen af tumorantigenspecifikke CTL’er inden for TME er imidlertid ikke blevet belyst30. Anvendelsen af denne tumortransplantationsprotokol har givet et vigtigt fingerpeg om, at intratumorale antigenspecifikke CD8 + T-celler muligvis ikke vedvarer i lang tid på trods af eksistensen af stamlignende TCF1+ stamcelle CD8 +<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (nr. 31825011 til LY) og National Natural Science Foundation of China (nr. 31900643 til QH, nr. 31900656 til ZW).
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGPR33RB | |
| 1 mL tuberculin syringe | KDL | BB000925 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16F10-OVA cell line | bluefbio | BFN607200447 | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2 | BD Horizon | 562895 | Clone:104 |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19853 | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
Referências
- Blank, C. U., et al. Defining ‘T cell exhaustion. Nature Reviews Immunology. 19 (11), 665-674 (2019).
- Leko, V., Rosenberg, S. A. Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors. Cancer Cell. 38 (4), 454-472 (2020).
- McLane, L. M., Abdel-Hakeem, M. S., Wherry, E. J. CD8 T cell exhaustion during chronic viral infection and cancer. Annual Review of Immunology. 37, 457-495 (2019).
- Davis, M. M., Brodin, P. Rebooting human immunology. Annual Review of Immunology. 36, 843-864 (2018).
- Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
- Littman, D. R. Releasing the brakes on cancer immunotherapy. Cell. 373 (16), 1490-1492 (2015).
- Verma, V., et al. PD-1 blockade in subprimed CD8 cells induces dysfunctional PD-1(+)CD38(hi) cells and anti-PD-1 resistance. Nature Immunology. 20, 1231-1243 (2019).
- Hashimoto, M., et al. CD8 T cell exhaustion in chronic infection and cancer: opportunities for interventions. Annual Review of Medicine. 69, 301-318 (2018).
- Dammeijer, F., et al. The PD-1/PD-L1-checkpoint restrains T cell immunity in tumor-draining lymph nodes. Cancer Cell. 38 (5), 685-700 (2020).
- Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 8 (2), 000867 (2020).
- Philip, M., Schietinger, A. Heterogeneity and fate choice: T cell exhaustion in cancer and chronic infections. Current Opinion in Immunology. 58, 98-103 (2019).
- Miller, B. C., et al. Subsets of exhausted CD8(+) T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade. Nature Immunology. 20, 326-336 (2019).
- Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579, 274-278 (2020).
- Im, S. J., Konieczny, B. T., Hudson, W. H., Masopust, D., Ahmed, R. PD-1+ stemlike CD8 T cells are resident in lymphoid tissues during persistent LCMV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 117 (8), 4292-4299 (2020).
- Beltra, J. C., et al. Developmental relationships of four exhausted CD8(+) T cell subsets reveals underlying transcriptional and epigenetic landscape control mechanisms. Immunity. 52 (5), 825-841 (2020).
- Myers, L. M., et al. A functional subset of CD8(+) T cells during chronic exhaustion is defined by SIRPalpha expression. Nature Communications. 10 (1), 794 (2019).
- Jansen, C. S., et al. An intra-tumoral niche maintains and differentiates stem-like CD8 T cells. Nature. 576, 465-470 (2019).
- Jadhav, R. R., et al. Epigenetic signature of PD-1+ TCF1+ CD8 T cells that act as resource cells during chronic viral infection and respond to PD-1 blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 116 (28), 14113-14118 (2019).
- Li, H., et al. Dysfunctional CD8 T cells form a proliferative, dynamically regulated compartment within human melanoma. Cell. 176 (4), 775-789 (2018).
- Kurtulus, S., et al. Checkpoint blockade immunotherapy induces dynamic changes in PD-1(-)CD8(+) tumor-infiltrating T cells. Immunity. 50 (1), 181-194 (2019).
- Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in PD-1/PD-L1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), 124507 (2018).
- E, J. F., et al. CD8(+)CXCR5(+) T cells in tumor-draining lymph nodes are highly activated and predict better prognosis in colorectal cancer. Human Immunology. 79 (6), 446-452 (2018).
- Snell, L. M., et al. CD8(+) T cell priming in established chronic viral infection preferentially directs differentiation of memory-like cells for sustained immunity. Immunity. 49 (4), 678-694 (2018).
- Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+) T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195-211 (2019).
- Wang, Y., et al. The transcription factor TCF1 preserves the effector function of exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Frontiers in Immunology. 10, 169 (2019).
- Krishna, S., et al. Stem-like CD8 T cells mediate response of adoptive cell immunotherapy against human cancer. Science. 370 (6522), 1328-1334 (2020).
- Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nature Medicine. 25, 1251-1259 (2019).
- Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillere, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. Mouse models in oncoimmunology. Nature Reviews Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).
- Li, Y., et al. Bcl6 preserves the suppressive function of regulatory T cells during tumorigenesis. Frontiers in Immunology. 11, 806 (2020).
- Yu, D., Ye, L. A portrait of CXCR5(+) follicular cytotoxic CD8(+) T cells. Trends in Immunology. 39 (12), 965-979 (2018).
- Bracci, L., et al. Cyclophosphamide enhances the antitumor efficacy of adoptively transferred immune cells through the induction of cytokine expression, B-cell and T-cell homeostatic proliferation, and specific tumor infiltration. Clinical Cancer Research. 13 (2), 644-653 (2007).
- Salem, M. L., El-Naggar, S. A., Mahmoud, H. A., Elgharabawy, R. M., Bader, A. M. Cyclophosphamide eradicates murine immunogenic tumor coding for a non-self-antigen and induces antitumor immunity. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 32, 1-5 (2018).
- Thorsson, V., et al. The Immune landscape of cancer. Immunity. 48 (4), 812-830 (2018).
