Transplantation tumorale pour évaluer la dynamique des lymphocytes T CD8+ infiltrant la tumeur chez la souris
Summary
Ici, nous présentons un protocole de transplantation tumorale pour la caractérisation des lymphocytes infiltrés tumoraux inhérents à la tumeur et dérivés de la périphérie dans un modèle tumoral murin. Le traçage spécifique de l’afflux de cellules immunitaires dérivées du receveur avec cytométrie en flux révèle la dynamique des changements phénotypiques et fonctionnels de ces cellules au cours des réponses immunitaires antitumorales.
Abstract
L’immunité médiée par les lymphocytes T joue un rôle crucial dans les réponses immunitaires contre les tumeurs, les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) jouant le rôle principal dans l’éradication des cellules cancéreuses. Cependant, les origines et la reconstitution des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène tumoral dans le microenvironnement tumoral (TME) restent obscures. Ce protocole utilise la lignée cellulaire de mélanome B16F10-OVA, qui exprime de manière stable le néoantigène de substitution, l’ovalbumine (OVA) et les souris OT-I transgéniques TCR, dans lesquelles plus de 90% des lymphocytes T CD8+ reconnaissent spécifiquement le peptide dérivé de l’OVA OVA257-264 (SIINFEKL) lié à la molécule H2-Kb du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I. Ces caractéristiques permettent d’étudier les réponses des lymphocytes T spécifiques de l’antigène au cours de la tumorigenèse.
En combinant ce modèle avec la chirurgie de transplantation tumorale, les tissus tumoraux de donneurs ont été transplantés dans des souris receveuses syngéniques appariées à une tumeur pour tracer avec précision l’afflux de cellules immunitaires dérivées du receveur dans les tissus de donneurs transplantés, permettant l’analyse des réponses immunitaires de CD8+ spécifiques à l’antigène inhérent à la tumeur et d’origine périphérique Lymphocytes T. Une transition dynamique s’est produite entre ces deux populations. Collectivement, cette conception expérimentale a fourni une autre approche pour étudier avec précision les réponses immunitaires des lymphocytes T CD8+ dans le TME, ce qui apportera un nouvel éclairage sur l’immunologie tumorale.
Introduction
La réponse immunitaire médiée par les lymphocytes T CD8+ joue un rôle central dans le contrôle de la croissance tumorale. Au cours de la tumorigenèse, les lymphocytes T CD8+ naïfs sont activés lors de la reconnaissance de l’antigène d’une manière restreinte au CMH de classe I, puis se différencient en cellules effectrices et s’infiltrent dans la masse tumorale 1,2. Cependant, dans le microenvironnement tumoral (TME), une exposition prolongée à l’antigène, ainsi que des facteurs immunosuppresseurs, conduisent les lymphocytes T CD8+ spécifiques à la tumeur infiltrés dans un état hyporésensible connu sous le nom d’« épuisement »3. Les lymphocytes T épuisés (Tex) sont distincts des lymphocytes T effecteurs ou mémoire générés lors d’une infection virale aiguë, à la fois transcriptionnellement et épigénétiquement. Ces cellules Tex sont principalement caractérisées par l’expression soutenue et élevée d’une série de récepteurs inhibiteurs ainsi que par la perte hiérarchique des fonctions effectrices. En outre, l’altération de la capacité proliférative des lymphocytes T CD8+ épuisés entraîne une diminution du nombre de lymphocytes T spécifiques à la tumeur, de sorte que les lymphocytes T CD8+ résiduels dans le TME peuvent à peine fournir une immunité protectrice suffisante contre la progression tumorale3. Ainsi, le maintien ou le renforcement des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène intratumoral est indispensable à la répression tumorale.
De plus, on pense que la thérapie de blocage des points de contrôle immunitaires (ICB) revigore Tex dans les tumeurs en augmentant l’infiltration des lymphocytes T et, par conséquent, le nombre de lymphocytes T et en rajeunissant les fonctions des lymphocytes T pour stimuler la répression tumorale. L’application généralisée du traitement par ICB a changé le paysage du traitement du cancer, avec un sous-ensemble substantiel de patients présentant des réponses durables 4,5,6. Néanmoins, la majorité des patients et des types de cancer ne répondent pas ou seulement temporairement à l’ICB. Une infiltration inadéquate des lymphocytes T dans le TME a été postulée comme l’un des mécanismes sous-jacents expliquant la résistance iCB 7,8.
Plusieurs études ont démontré l’hétérogénéité des lymphocytes T CD8+ (TIL) infiltrant les tumeurs chez les patients et les modèles murins 9,10,11,12. Il a été confirmé qu’un sous-ensemble de lymphocytes T CD8+ exprimant le facteur T-1 (TCF1) dans une masse tumorale présente des propriétés semblables à celles des cellules souches, ce qui pourrait donner lieu à des lymphocytes T épuisés en phase terminale et est responsable de l’éclatement de la prolifération après le traitement par ICB 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Cependant, il a été prouvé que seule une faible proportion de lymphocytes TCF1+CD8+ spécifiques de l’antigène existent dans le TME et génèrent un pool élargi de descendance différenciée en réponse à l’ICB 23,24,25,26. On ne sait pas si la taille limitée de cette population est suffisante pour assurer la persistance des lymphocytes T cytotoxiques (LCR) pour contrôler la progression tumorale, et s’il y a réapprovisionnement des tissus périphériques nécessite des recherches plus approfondies. En outre, des recherches récentes suggèrent la capacité de revitalisation insuffisante des lymphocytes T spécifiques de la tumeur préexistants et l’apparition de nouveaux clonotypes auparavant inexistants après un traitement antiprogrammé de la protéine de mort cellulaire 1. Cela indique que la réponse des lymphocytes T au blocage des points de contrôle peut être due au nouvel afflux d’un répertoire distinct de clones de lymphocytes T27. Avec la présence de la fraction de lymphocytes T cytotoxiques non réactifs à la tumeur dans le TME, ces résultats ont incité à l’établissement d’un modèle d’allogreffe tumorale pour étudier le rôle des lymphocytes T CD8+ dérivés de la périphérie11.
Jusqu’à présent, plusieurs types d’implantation tumorale, ainsi que le transfert adoptif de cellules immunitaires, ont été largement utilisés dans le domaine de l’immunologie tumorale28. Les TIL, les cellules mononucléaires du sang périphérique et les cellules immunitaires réactives à la tumeur provenant d’autres tissus peuvent être bien caractérisés à l’aide de ces méthodes. Cependant, lors de l’étude des interactions entre l’immunité antitumorale systémique et locale, ces modèles semblent inadéquats pour examiner les interactions entre les cellules immunitaires dérivées de la périphérie et le TME. Ici, les tissus tumoraux ont été transplantés de donneurs dans des souris receveuses appariées par tumeur pour suivre avec précision l’afflux de cellules immunitaires dérivées de receveurs et observer les cellules dérivées de donneurs dans le TME en concomitance.
Dans cette étude, un modèle syngénique murin du mélanome a été établi avec la lignée cellulaire de mélanome B16F10-OVA, qui exprime de manière stable l’ovalbumine néoantigène de substitution. Les souris OT-I transgéniques TCR, dans lesquelles plus de 90% des lymphocytes T CD8+ reconnaissent spécifiquement le peptide dérivé de l’OVA OVA OVA257-264 (SIINFEKL) lié à la molécule H2-Kb du CMH de classe I, permettent l’étude des réponses des lymphocytes T spécifiques à l’antigène développées dans le modèle tumoral B16F10-OVA. En combinant ce modèle avec la transplantation tumorale, les réponses immunitaires des lymphocytes T CD8+ spécifiques à l’antigène inhérents à la tumeur et d’origine périphérique ont été comparées pour révéler une transition dynamique entre ces deux populations. Collectivement, cette conception expérimentale a fourni une autre approche pour étudier avec précision les réponses immunitaires des lymphocytes T CD8+ dans le TME, ce qui jette un nouvel éclairage sur la dynamique des réponses immunitaires des lymphocytes T spécifiques à la tumeur dans le TME.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’immunité médiée par les lymphocytes T joue un rôle crucial dans les réponses immunitaires contre les tumeurs, les CTL jouant le rôle principal dans l’éradication des cellules cancéreuses. Cependant, les origines des CTL spécifiques de l’antigène tumoral dans le TME n’ont pas été élucidées30. L’utilisation de ce protocole de transplantation tumorale a fourni un indice important que les lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène intratumoral peuvent ne pas …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par des subventions du National Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (n ° 31825011 à LY) et de la National Natural Science Foundation of China (n ° 31900643 à QH, n ° 31900656 à ZW).
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGPR33RB | |
| 1 mL tuberculin syringe | KDL | BB000925 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16F10-OVA cell line | bluefbio | BFN607200447 | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2 | BD Horizon | 562895 | Clone:104 |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19853 | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
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