चूहों में ट्यूमर-घुसपैठ सीडी 8 + टी कोशिकाओं की गतिशीलता का आकलन करने के लिए ट्यूमर प्रत्यारोपण
Summary
यहां, हम माउस ट्यूमर मॉडल में ट्यूमर-अंतर्निहित और परिधि-व्युत्पन्न ट्यूमर-घुसपैठ लिम्फोसाइट्स के लक्षण वर्णन के लिए एक ट्यूमर प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। प्रवाह साइटोमेट्री के साथ प्राप्तकर्ता-व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं की आमद का विशिष्ट पता लगाने से एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के दौरान इन कोशिकाओं के फेनोटाइपिक और कार्यात्मक परिवर्तनों की गतिशीलता का पता चलता है।
Abstract
टी सेल-मध्यस्थता प्रतिरक्षा ट्यूमर के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, साइटोटॉक्सिक टी लिम्फोसाइट्स (सीटीएल) कैंसर कोशिकाओं को खत्म करने में अग्रणी भूमिका निभाती है। हालांकि, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) के भीतर ट्यूमर एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं की उत्पत्ति और पुनःपूर्ति अस्पष्ट रहती है। यह प्रोटोकॉल B16F10-OVA मेलेनोमा सेल लाइन को नियोजित करता है, जो सरोगेट नियोएंटीजन, ओवलबुमिन (ओवीए), और टीसीआर ट्रांसजेनिक ओटी-आई चूहों को स्थिर रूप से व्यक्त करता है, जिसमें 90% से अधिक सीडी 8 + टी कोशिकाएं विशेष रूप से ओवीए-व्युत्पन्न पेप्टाइड ओवीए257-264 (SIINFEKL) को पहचानती हैं जो कक्षा I प्रमुख हिस्टोकॉम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स (एमएचसी) अणु एच 2-केबी से बंधी हैं। ये विशेषताएं एंटीजन-विशिष्ट टी सेल प्रतिक्रियाओं के अध्ययन को सक्षम करती हैं।
ट्यूमर प्रत्यारोपण सर्जरी के साथ इस मॉडल के संयोजन, दाताओं से ट्यूमर ऊतकों को ट्यूमर-मिलान सिंजेनिक प्राप्तकर्ता चूहों में प्रत्यारोपित किया गया था ताकि प्रतिरोपित दाता ऊतकों में प्राप्तकर्ता-व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं की आमद का सटीक पता लगाया जा सके, जिससे ट्यूमर-अंतर्निहित और परिधि-उत्पन्न एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण की अनुमति मिलती है। टी कोशिकाओं. इन दो आबादी के बीच एक गतिशील संक्रमण पाया गया। सामूहिक रूप से, इस प्रयोगात्मक डिजाइन ने टीएमई में सीडी 8 + टी कोशिकाओं की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की सटीक जांच करने के लिए एक और दृष्टिकोण प्रदान किया है, जो ट्यूमर इम्यूनोलॉजी पर नया प्रकाश डालेगा।
Introduction
CD8 + T सेल-मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया ट्यूमर के विकास को नियंत्रित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। के दौरान, भोले सीडी 8 + टी कोशिकाएं एक एमएचसी वर्ग I-प्रतिबंधित तरीके से एंटीजन मान्यता पर सक्रिय हो जाती हैं और बाद में प्रभावकारी कोशिकाओं में अंतर करती हैं और ट्यूमर द्रव्यमान 1,2 में घुसपैठ करती हैं। हालांकि, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) के भीतर, लंबे समय तक एंटीजन एक्सपोजर, साथ ही साथ इम्यूनोसप्रेसिव कारक, ट्यूमर-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं को एक हाइपोरेस्पॉन्सिव राज्य में घुसपैठ करते हैं जिसे “थकावट” 3 के रूप में जाना जाता है। थका हुआ टी कोशिकाएं (टेक्स) तीव्र वायरल संक्रमण में उत्पन्न प्रभावक या स्मृति टी कोशिकाओं से अलग होती हैं, दोनों ट्रांसक्रिप्शनल और एपिजेनेटिक रूप से। इन टेक्स कोशिकाओं को मुख्य रूप से निरोधात्मक रिसेप्टर्स की एक श्रृंखला की निरंतर और उन्नत अभिव्यक्ति के साथ-साथ प्रभावकारी कार्यों के पदानुक्रमित नुकसान की विशेषता है। इसके अलावा, थका हुआ सीडी 8 + टी कोशिकाओं की बिगड़ा हुआ प्रोलिफेरेटिव क्षमता के परिणामस्वरूप ट्यूमर-विशिष्ट टी कोशिकाओं की संख्या कम हो जाती है, जैसे कि टीएमई के भीतर अवशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाएं ट्यूमर की प्रगति3 के खिलाफ पर्याप्त सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा प्रदान कर सकती हैं। इस प्रकार, इंट्राट्यूमरल एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं का रखरखाव या सुदृढीकरण ट्यूमर दमन के लिए अपरिहार्य है।
इसके अलावा, प्रतिरक्षा चेकपॉइंट नाकाबंदी (आईसीबी) थेरेपी को टी सेल घुसपैठ को बढ़ाकर ट्यूमर में टेक्स को पुनर्जीवित करने के लिए माना जाता है और इसलिए, टी सेल संख्या और ट्यूमर दमन को बढ़ावा देने के लिए टी सेल कार्यों को पुनर्जीवित करना। आईसीबी उपचार के व्यापक अनुप्रयोग ने कैंसर थेरेपी परिदृश्य को बदल दिया है, जिसमें टिकाऊ प्रतिक्रियाओं का अनुभव करने वाले रोगियों का एक पर्याप्त सबसेट 4,5,6 है। फिर भी, अधिकांश रोगी और कैंसर के प्रकार आईसीबी का जवाब नहीं देते हैं या केवल अस्थायी रूप से प्रतिक्रिया करते हैं। टीएमई में अपर्याप्त टी सेल घुसपैठ को आईसीबी प्रतिरोध 7,8 के लिए लेखांकन अंतर्निहिततंत्रों में से एक माना गया है।
कई अध्ययनों ने रोगियों और माउस मॉडल 9,10,11,12 दोनों में ट्यूमर-घुसपैठ सीडी 8 + टी कोशिकाओं (टीआईएल) की विषमता का प्रदर्शन किया है। यह पुष्टि की गई है कि ट्यूमर द्रव्यमान में टी सेल फैक्टर -1 (टीसीएफ 1) को व्यक्त करने वाली सीडी 8 + टी कोशिकाओं का एक सबसेट स्टेम सेल जैसे गुणों को प्रदर्शित करता है, जो आगे समाप्त टी कोशिकाओं को जन्म दे सकता है और आईसीबी थेरेपी 12,13,14,15,16,17,18,19,20 के बाद प्रसार फटने के लिए जिम्मेदार है, 21,22. हालांकि, यह साबित हो गया है कि टीएमई में एंटीजन-विशिष्ट टीसीएफ 1 + सीडी 8 + टी कोशिकाओं का केवल एक छोटा सा अनुपात मौजूद है और आईसीबी 23,24,25,26 के जवाब में विभेदित संतानों का एक विस्तारित पूल उत्पन्न करता है। क्या इस आबादी का सीमित आकार ट्यूमर की प्रगति को नियंत्रित करने के लिए साइटोटॉक्सिक टी लिम्फोसाइट्स (सीटीएल) की दृढ़ता सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त है, यह अज्ञात है, और क्या परिधि ऊतकों से पुनःपूर्ति है, आगे की जांच की आवश्यकता है। इसके अलावा, हाल के शोध से पता चलता है कि पहले से मौजूद ट्यूमर-विशिष्ट टी कोशिकाओं की अपर्याप्त पुनरुत्थान क्षमता और उपन्यास की उपस्थिति, एंटी-प्रोग्राम्ड सेल डेथ प्रोटीन 1 उपचार के बाद पहले गैर-मौजूदा क्लोनोटाइप। यह इंगित करता है कि चेकपॉइंट नाकाबंदी के लिए टी सेल प्रतिक्रिया टी सेल क्लोन27 के एक अलग प्रदर्शनों की सूची की नई आमद के कारण हो सकती है। टीएमई में बायस्टैंडर गैर-ट्यूमर-प्रतिक्रियाशील साइटोटॉक्सिक टी सेल अंश की उपस्थिति के साथ, इन निष्कर्षों ने परिधि-व्युत्पन्न सीडी 8 + टी कोशिकाओं11 की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक ट्यूमर एलोग्राफ्ट मॉडल की स्थापना को प्रेरित किया।
अब तक, कई प्रकार के ट्यूमर आरोपण, साथ ही साथ प्रतिरक्षा कोशिका दत्तक हस्तांतरण, ट्यूमर इम्यूनोलॉजी28 के क्षेत्र में व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। टीआईएल, परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं, और अन्य ऊतकों से उत्पन्न ट्यूमर-प्रतिक्रियाशील प्रतिरक्षा कोशिकाओं को इन तरीकों का उपयोग करके अच्छी तरह से विशेषता दी जा सकती है। हालांकि, प्रणालीगत और स्थानीय एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा के बीच बातचीत का अध्ययन करते समय, ये मॉडल परिधि और टीएमई से व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच बातचीत की जांच करने के लिए अपर्याप्त दिखाई देते हैं। यहां, ट्यूमर के ऊतकों को दाताओं से ट्यूमर-मिलान प्राप्तकर्ता चूहों में प्रत्यारोपित किया गया था ताकि प्राप्तकर्ता-व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं की आमद का सटीक रूप से पता लगाया जा सके और टीएमई में दाता-व्युत्पन्न कोशिकाओं का सहवर्ती रूप से निरीक्षण किया जा सके।
इस अध्ययन में, मेलेनोमा का एक मुरीन सिंजेनिक मॉडल बी 16 एफ 10-ओवीए मेलेनोमा सेल लाइन के साथ स्थापित किया गया था, जो सरोगेट नियोएंटीजेन ओवलबुमिन को स्थिर रूप से व्यक्त करता है। टीसीआर ट्रांसजेनिक ओटी-आई चूहों, जिसमें सीडी 8 + टी कोशिकाओं के 90% से अधिक विशेष रूप से ओवीए-व्युत्पन्न पेप्टाइड ओवीए257-264 (SIINFEKL) को पहचानते हैं, जो कक्षा I MHC अणु H2-K b से बंधे होते हैं,B16F10-OVA ट्यूमर मॉडल में विकसित एंटीजन-विशिष्ट टी सेल प्रतिक्रियाओं के अध्ययन को सक्षम करते हैं। ट्यूमर प्रत्यारोपण के साथ इस मॉडल के संयोजन से, ट्यूमर-अंतर्निहित और परिधि-उत्पन्न एंटीजन-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की तुलना इन दो आबादी के बीच एक गतिशील संक्रमण को प्रकट करने के लिए की गई थी। सामूहिक रूप से, इस प्रयोगात्मक डिजाइन ने टीएमई में सीडी 8 + टी कोशिकाओं की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की सटीक जांच करने के लिए एक और दृष्टिकोण प्रदान किया है, जो टीएमई में ट्यूमर-विशिष्ट टी सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की गतिशीलता पर नया प्रकाश डालता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
टी सेल-मध्यस्थता प्रतिरक्षा ट्यूमर के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, जिसमें सीटीएल कैंसर कोशिकाओं को खत्म करने में अग्रणी भूमिका निभाते हैं। हालांकि, टीएमई के भ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को प्रतिष्ठित युवा विद्वानों के लिए राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान कोष (एलवाई के लिए नंबर 31825011) और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (क्यूएच के लिए नंबर 31900643, जेडडब्ल्यू के लिए नंबर 31900656) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGPR33RB | |
| 1 mL tuberculin syringe | KDL | BB000925 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16F10-OVA cell line | bluefbio | BFN607200447 | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2 | BD Horizon | 562895 | Clone:104 |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19853 | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
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