Tumortransplantasjon for å vurdere dynamikken i tumorinfiltrerende CD8 + T-celler hos mus
Summary
Her presenterer vi en tumortransplantasjonsprotokoll for karakterisering av tumor-iboende og periferi-avledede tumorinfiltrerte lymfocytter i en musesvulstmodell. Spesifikk sporing av tilstrømningen av mottakeravledede immunceller med strømningscytometri avslører dynamikken i fenotypiske og funksjonelle endringer i disse cellene under antitumor immunresponser.
Abstract
T cellemediert immunitet spiller en avgjørende rolle i immunresponser mot svulster, med cytotoksiske T-lymfocytter (CTLer) som spiller hovedrollen i å utrydde kreftceller. Opprinnelsen og etterfyllingen av tumorantigenspesifikke CD8+ T-celler i tumormikromiljøet (TME) forblir imidlertid uklare. Denne protokollen bruker cellelinjen B16F10-OVA melanom, som stabilt uttrykker surrogat neoantigen, ovalbumin (OVA) og TCR transgene OT-I mus, der over 90% av CD8 + T-cellene spesifikt gjenkjenner det OVA-avledede peptidet OVA257-264 (SIINFEKL) bundet til klassen I store histokompatibilitetskompleks (MHC) molekyl H2-Kb. Disse funksjonene muliggjør studiet av antigenspesifikke T-celleresponser under tumorigenese.
Ved å kombinere denne modellen med tumortransplantasjonskirurgi ble tumorvev fra donorer transplantert til tumortilpassede syngeneiske mottakermus for å spore tilstrømningen av mottakeravledede immunceller til transplantert donorvev, slik at analysen av immunresponsene til tumor-iboende og periferi-stammer antigenspesifikk CD8+ T celler. Det ble funnet en dynamisk overgang mellom disse to populasjonene. Samlet har denne eksperimentelle designen gitt en annen tilnærming for å nøyaktig undersøke immunresponsene til CD8 + T-celler i TME, som vil kaste nytt lys over tumorimmunologi.
Introduction
CD8+ T cellemediert immunrespons spiller en sentral rolle i å kontrollere tumorvekst. Under tumorigenese aktiveres naive CD8+ T-celler ved antigengjenkjenning på en MHC-klasse I-begrenset måte og skiller seg deretter ut i effektorceller og infiltrerer i tumormasse 1,2. Men innenfor tumormikromiljøet (TME), langvarig antigeneksponering, samt immundempende faktorer, driver infiltrerte tumorspesifikke CD8+ T-celler inn i en hyporesponsiv tilstand kjent som “utmattelse”3. Utmattede T-celler (Tex) skiller seg fra effektor- eller minne T-celler generert i akutt virusinfeksjon, både transkripsjonelt og epigenetisk. Disse Tex-cellene er hovedsakelig preget av det vedvarende og forhøyede uttrykket av en rekke hemmende reseptorer, samt det hierarkiske tapet av effektorfunksjoner. Videre resulterer den svekkede proliferative kapasiteten til utmattede CD8 + T-celler i synkende antall tumorspesifikke T-celler, slik at de resterende CD8 + T-cellene i TME knapt kan gi tilstrekkelig beskyttende immunitet mot tumorprogresjon3. Dermed er vedlikehold eller forsterkning av intratumorale antigenspesifikke CD8 + T-celler uunnværlig for tumorundertrykkelse.
Videre antas immunkontrollpunktblokade (ICB) terapi å gjenopplive Tex i svulster ved å øke T-celleinfiltrasjonen og dermed T-celletall og forynge T-cellefunksjoner for å øke tumorundertrykkelsen. Den utbredte anvendelsen av ICB-behandling har endret kreftterapilandskapet, med en betydelig undergruppe av pasienter som opplever holdbare responser 4,5,6. Likevel reagerer de fleste pasienter og krefttyper ikke eller bare midlertidig på ICB. Utilstrekkelig T-celleinfiltrasjon i TME er postulert til å være en av de underliggende mekanismene som står for ICB-resistens 7,8.
Flere studier har vist heterogeniteten til tumorinfiltrerende CD8+ T-celler (TILer) hos både pasienter og musemodeller 9,10,11,12. Det har blitt bekreftet at en undergruppe av CD8+ T-celler som uttrykker T-cellefaktor-1 (TCF1) i en tumormasse viser stamcellelignende egenskaper, noe som ytterligere kan gi opphav til terminalt utmattede T-celler og er ansvarlig for spredningsutbruddet etter ICB-terapi 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Imidlertid har det vist seg at bare en liten andel av antigenspesifikke TCF1 + CD8 + T-celler eksisterer i TME og genererer et utvidet utvalg av differensiert avkom som svar på ICB 23,24,25,26. Hvorvidt den begrensede størrelsen på denne befolkningen er nok til å sikre utholdenheten til cytotoksiske T-lymfocytter (CTLer) for å kontrollere tumorprogresjon, forblir ukjent, og om det er etterfylling fra periferivev krever videre undersøkelse. Videre antyder nyere forskning den utilstrekkelige gjenoppfriskningskapasiteten til eksisterende tumorspesifikke T-celler og utseendet på nye, tidligere ikke-eksisterende clonotyper etter antiprogrammert celledødsprotein 1-behandling. Dette indikerer at T-cellerespons på kontrollpunktblokade kan skyldes den nye tilstrømningen av et tydelig repertoar av T-cellekloner27. Sammen med tilstedeværelsen av tilskuer ikke-tumor-reaktiv cytotoksisk T-cellefraksjon i TME, førte disse funnene til etableringen av en tumor allograft modell for å studere rollen som periferi-avledede CD8 + T-celler11.
Inntil nå har flere typer tumorimplantasjon, samt immuncelle adoptivoverføring, blitt mye brukt innen tumorimmunologi28. TILer, perifere mononukleære celler i blodet og tumorreaktive immunceller som stammer fra andre vev, kan karakteriseres godt ved hjelp av disse metodene. Men når man studerer interaksjonene mellom systemisk og lokal antitumorimmunitet, virker disse modellene utilstrekkelige til å undersøke samspillet mellom immunceller avledet fra periferien og TME. Her ble tumorvev transplantert fra donorer til tumortilpassede mottakermus for å spore tilstrømningen av mottakeravledede immunceller og observere donoravledede celler i TME samtidig.
I denne studien ble det etablert en murine syngeneisk modell av melanom med cellelinjen B16F10-OVA melanom, som stabilt uttrykker surrogat neoantigen ovalbumin. TCR transgene OT-I-mus, der over 90% av CD8 + T-cellene spesifikt gjenkjenner det OVA-avledede peptidet OVA257-264 (SIINFEKL) bundet til klassen I MHC-molekyl H2-Kb, muliggjør studiet av antigenspesifikke T-celleresponser utviklet i B16F10-OVA tumormodellen. Ved å kombinere denne modellen med tumortransplantasjon ble immunresponsene til tumor-iboende og periferi-stammer antigenspesifikke CD8+ T-celler sammenlignet med å avsløre en dynamisk overgang mellom disse to populasjonene. Samlet har denne eksperimentelle designen gitt en annen tilnærming for å nøyaktig undersøke immunresponsene til CD8 + T-celler i TME, som kaster nytt lys over dynamikken i tumorspesifikke T-celleimmuneresponser i TME.
Protocol
Representative Results
Discussion
T cellemediert immunitet spiller en avgjørende rolle i immunresponser mot svulster, med CTLer som spiller hovedrollen i å utrydde kreftceller. Opprinnelsen til tumorantigenspesifikke CTLer i TME har imidlertid ikke blitt belyst30. Bruken av denne tumortransplantasjonsprotokollen har gitt en viktig anelse om at intratumorale antigenspesifikke CD8+ T-celler kanskje ikke vedvarer i lang tid, til tross for eksistensen av stamceller som TCF1 + stamfar CD8 + T-celler. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (No. 31825011 to LY) og National Natural Science Foundation of China (Nr. 31900643 til QH, Nr. 31900656 til ZW).
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGPR33RB | |
| 1 mL tuberculin syringe | KDL | BB000925 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16F10-OVA cell line | bluefbio | BFN607200447 | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2 | BD Horizon | 562895 | Clone:104 |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19853 | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
Referências
- Blank, C. U., et al. Defining ‘T cell exhaustion. Nature Reviews Immunology. 19 (11), 665-674 (2019).
- Leko, V., Rosenberg, S. A. Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors. Cancer Cell. 38 (4), 454-472 (2020).
- McLane, L. M., Abdel-Hakeem, M. S., Wherry, E. J. CD8 T cell exhaustion during chronic viral infection and cancer. Annual Review of Immunology. 37, 457-495 (2019).
- Davis, M. M., Brodin, P. Rebooting human immunology. Annual Review of Immunology. 36, 843-864 (2018).
- Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
- Littman, D. R. Releasing the brakes on cancer immunotherapy. Cell. 373 (16), 1490-1492 (2015).
- Verma, V., et al. PD-1 blockade in subprimed CD8 cells induces dysfunctional PD-1(+)CD38(hi) cells and anti-PD-1 resistance. Nature Immunology. 20, 1231-1243 (2019).
- Hashimoto, M., et al. CD8 T cell exhaustion in chronic infection and cancer: opportunities for interventions. Annual Review of Medicine. 69, 301-318 (2018).
- Dammeijer, F., et al. The PD-1/PD-L1-checkpoint restrains T cell immunity in tumor-draining lymph nodes. Cancer Cell. 38 (5), 685-700 (2020).
- Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 8 (2), 000867 (2020).
- Philip, M., Schietinger, A. Heterogeneity and fate choice: T cell exhaustion in cancer and chronic infections. Current Opinion in Immunology. 58, 98-103 (2019).
- Miller, B. C., et al. Subsets of exhausted CD8(+) T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade. Nature Immunology. 20, 326-336 (2019).
- Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579, 274-278 (2020).
- Im, S. J., Konieczny, B. T., Hudson, W. H., Masopust, D., Ahmed, R. PD-1+ stemlike CD8 T cells are resident in lymphoid tissues during persistent LCMV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 117 (8), 4292-4299 (2020).
- Beltra, J. C., et al. Developmental relationships of four exhausted CD8(+) T cell subsets reveals underlying transcriptional and epigenetic landscape control mechanisms. Immunity. 52 (5), 825-841 (2020).
- Myers, L. M., et al. A functional subset of CD8(+) T cells during chronic exhaustion is defined by SIRPalpha expression. Nature Communications. 10 (1), 794 (2019).
- Jansen, C. S., et al. An intra-tumoral niche maintains and differentiates stem-like CD8 T cells. Nature. 576, 465-470 (2019).
- Jadhav, R. R., et al. Epigenetic signature of PD-1+ TCF1+ CD8 T cells that act as resource cells during chronic viral infection and respond to PD-1 blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 116 (28), 14113-14118 (2019).
- Li, H., et al. Dysfunctional CD8 T cells form a proliferative, dynamically regulated compartment within human melanoma. Cell. 176 (4), 775-789 (2018).
- Kurtulus, S., et al. Checkpoint blockade immunotherapy induces dynamic changes in PD-1(-)CD8(+) tumor-infiltrating T cells. Immunity. 50 (1), 181-194 (2019).
- Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in PD-1/PD-L1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), 124507 (2018).
- E, J. F., et al. CD8(+)CXCR5(+) T cells in tumor-draining lymph nodes are highly activated and predict better prognosis in colorectal cancer. Human Immunology. 79 (6), 446-452 (2018).
- Snell, L. M., et al. CD8(+) T cell priming in established chronic viral infection preferentially directs differentiation of memory-like cells for sustained immunity. Immunity. 49 (4), 678-694 (2018).
- Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+) T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195-211 (2019).
- Wang, Y., et al. The transcription factor TCF1 preserves the effector function of exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Frontiers in Immunology. 10, 169 (2019).
- Krishna, S., et al. Stem-like CD8 T cells mediate response of adoptive cell immunotherapy against human cancer. Science. 370 (6522), 1328-1334 (2020).
- Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nature Medicine. 25, 1251-1259 (2019).
- Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillere, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. Mouse models in oncoimmunology. Nature Reviews Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).
- Li, Y., et al. Bcl6 preserves the suppressive function of regulatory T cells during tumorigenesis. Frontiers in Immunology. 11, 806 (2020).
- Yu, D., Ye, L. A portrait of CXCR5(+) follicular cytotoxic CD8(+) T cells. Trends in Immunology. 39 (12), 965-979 (2018).
- Bracci, L., et al. Cyclophosphamide enhances the antitumor efficacy of adoptively transferred immune cells through the induction of cytokine expression, B-cell and T-cell homeostatic proliferation, and specific tumor infiltration. Clinical Cancer Research. 13 (2), 644-653 (2007).
- Salem, M. L., El-Naggar, S. A., Mahmoud, H. A., Elgharabawy, R. M., Bader, A. M. Cyclophosphamide eradicates murine immunogenic tumor coding for a non-self-antigen and induces antitumor immunity. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 32, 1-5 (2018).
- Thorsson, V., et al. The Immune landscape of cancer. Immunity. 48 (4), 812-830 (2018).
