Trasplante de tumores para evaluar la dinámica de las células T CD8+ infiltrantes de tumores en ratones
Summary
Aquí, presentamos un protocolo de trasplante tumoral para la caracterización de linfocitos infiltrados tumorales inherentes y derivados de la periferia en un modelo de tumor de ratón. El rastreo específico de la afluencia de células inmunes derivadas del receptor con citometría de flujo revela la dinámica de los cambios fenotípicos y funcionales de estas células durante las respuestas inmunes antitumorales.
Abstract
La inmunidad mediada por células T desempeña un papel crucial en las respuestas inmunes contra los tumores, con los linfocitos T citotóxicos (CTL) desempeñando el papel principal en la erradicación de las células cancerosas. Sin embargo, los orígenes y la reposición de las células T CD8+ específicas del antígeno tumoral dentro del microambiente tumoral (TME) permanecen oscuros. Este protocolo emplea la línea celular de melanoma B16F10-OVA, que expresa de manera estable el neoantígeno sustituto, la ovoalbúmina (OVA) y los ratones ot-I transgénicos T Tcr, en los que más del 90% de las células T CD8 + reconocen específicamente el péptido derivado de OVAOVA 257-264 (SIINFEKL) unido a la molécula H2-Kb del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) de clase I. Estas características permiten el estudio de las respuestas de las células T específicas del antígeno durante la tumorigénesis.
Combinando este modelo con la cirugía de trasplante tumoral, los tejidos tumorales de los donantes se trasplantaron a ratones receptores singénicos compatibles con tumores para rastrear con precisión la afluencia de células inmunes derivadas del receptor en los tejidos de donantes trasplantados, lo que permitió el análisis de las respuestas inmunes de CD8 + específico del antígeno inherente al tumor y originado en la periferia. Células T. Se encontró que se produjo una transición dinámica entre estas dos poblaciones. En conjunto, este diseño experimental ha proporcionado otro enfoque para investigar con precisión las respuestas inmunes de las células T CD8 + en TME, lo que arrojará nueva luz sobre la inmunología tumoral.
Introduction
La respuesta inmune mediada por células T CD8 + juega un papel fundamental en el control del crecimiento tumoral. Durante la tumorigénesis, las células T CD8+ naïve se activan tras el reconocimiento de antígenos de una manera restringida a MHC clase I y posteriormente se diferencian en células efectoras y se infiltran en la masa tumoral 1,2. Sin embargo, dentro del microambiente tumoral (EMT), la exposición prolongada al antígeno, así como los factores inmunosupresores, llevan a las células T CD8+ infiltradas específicas del tumor a un estado hiporesponesivo conocido como “agotamiento”3. Las células T agotadas (Tex) son distintas de las células T efectoras o de memoria generadas en la infección viral aguda, tanto transcripcional como epigenéticamente. Estas células Tex se caracterizan principalmente por la expresión sostenida y elevada de una serie de receptores inhibitorios, así como por la pérdida jerárquica de las funciones efectoras. Además, la capacidad proliferativa deteriorada de las células T CD8 + agotadas da como resultado una disminución del número de células T específicas del tumor, de modo que las células T CD8 + residuales dentro de la EMT apenas pueden proporcionar suficiente inmunidad protectora contra la progresión tumoral3. Por lo tanto, el mantenimiento o refuerzo de las células T CD8+ específicas del antígeno intratumoral es indispensable para la represión tumoral.
Además, se cree que la terapia de bloqueo del punto de control inmunitario (ICB) revitaliza el Tex en los tumores al aumentar la infiltración de células T y, por lo tanto, el número de células T y rejuvenecer las funciones de las células T para aumentar la represión tumoral. La aplicación generalizada del tratamiento con ICB ha cambiado el panorama de la terapia contra el cáncer, con un subconjunto sustancial de pacientes que experimentan respuestas duraderas 4,5,6. Sin embargo, la mayoría de los pacientes y tipos de cáncer no responden o solo responden temporalmente al ICB. Se ha postulado que la infiltración inadecuada de células T en la EMT es uno de los mecanismos subyacentes que explican la resistencia al ICB 7,8.
Diversos estudios han demostrado la heterogeneidad de las células T CD8+ infiltrantes tumorales (TIL) tanto en pacientes como en modelosde ratón 9,10,11,12. Se ha confirmado que un subconjunto de células T CD8 + que expresan factor 1 de células T (TCF1) en una masa tumoral exhibe propiedades similares a las de las células madre, lo que podría dar lugar a células T agotadas terminalmente y es responsable del estallido de proliferación después de la terapia ICB 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Sin embargo, se ha demostrado que solo una pequeña proporción de células TCF1 + CD8 + específicas de antígenos existen en la EMT y generan un grupo ampliado de progenie diferenciada en respuesta a ICB 23,24,25,26. Se desconoce si el tamaño limitado de esta población es suficiente para garantizar la persistencia de los linfocitos T citotóxicos (CTL) para controlar la progresión del tumor, y si hay reposición de los tejidos periféricos requiere más investigación. Además, investigaciones recientes sugieren la insuficiente capacidad de revitalización de las células T preexistentes específicas del tumor y la aparición de clonotipos nuevos y previamente inexistentes después del tratamiento antiprogramado con la proteína 1 de muerte celular. Esto indica que la respuesta de las células T al bloqueo del punto de control puede deberse a la nueva afluencia de un repertorio distinto de clones de células T27. Junto con la presencia de una fracción de células T citotóxicas no reactivas al tumor en la EMT, estos hallazgos impulsaron el establecimiento de un modelo de aloinjerto tumoral para estudiar el papel de las células T CD8 + derivadas de la periferia11.
Hasta ahora, varios tipos de implantación tumoral, así como la transferencia adoptiva de células inmunes, se han utilizado ampliamente en el campo de la inmunología tumoral28. Los TIL, las células mononucleares de sangre periférica y las células inmunes reactivas a tumores originadas en otros tejidos se pueden caracterizar bien utilizando estos métodos. Sin embargo, al estudiar las interacciones entre la inmunidad antitumoral sistémica y local, estos modelos parecen inadecuados para examinar las interacciones entre las células inmunes derivadas de la periferia y la EMT. Aquí, los tejidos tumorales se trasplantaron de donantes a ratones receptores compatibles con tumores para rastrear con precisión la afluencia de células inmunes derivadas del receptor y observar las células derivadas de donantes en el TME concomitantemente.
En este estudio, se estableció un modelo singénico murino de melanoma con la línea celular de melanoma B16F10-OVA, que expresa de manera estable el neoantígeno sustituto ovalbúmina. Los ratones OT-I transgénicos TCR, en los que más del 90% de las células T CD8+ reconocen específicamente el péptido derivado de OVA OVA257-264 (SIINFEKL) unido a la molécula MHC de clase I H2-Kb, permiten el estudio de las respuestas de células T específicas de antígeno desarrolladas en el modelo tumoral B16F10-OVA. Combinando este modelo con el trasplante de tumores, se compararon las respuestas inmunes de las células T CD8+ específicas del antígeno inherente al tumor y originadas en la periferia para revelar una transición dinámica entre estas dos poblaciones. En conjunto, este diseño experimental ha proporcionado otro enfoque para investigar con precisión las respuestas inmunes de las células T CD8 + en la EMT, lo que arroja nueva luz sobre la dinámica de las respuestas inmunes de las células T específicas del tumor en la EMT.
Protocol
Representative Results
Discussion
La inmunidad mediada por células T juega un papel crucial en las respuestas inmunes contra los tumores, con las CTL desempeñando el papel principal en la erradicación de las células cancerosas. Sin embargo, no se han dilucidado los orígenes de las CTL específicas de antígeno tumoral dentro de laEMT 30. El uso de este protocolo de trasplante tumoral ha proporcionado una pista importante de que las células T CD8 + específicas del antígeno intratumoral pueden no persistir durante…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por subvenciones del Fondo Nacional de Ciencias Naturales para Jóvenes Académicos Distinguidos (No. 31825011 a LY) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 31900643 a QH, No. 31900656 a ZW).
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGPR33RB | |
| 1 mL tuberculin syringe | KDL | BB000925 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16F10-OVA cell line | bluefbio | BFN607200447 | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2 | BD Horizon | 562895 | Clone:104 |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19853 | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
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