Tumörtransplantation för att bedöma dynamiken hos tumörinfiltrerande CD8 + T-celler hos möss
Summary
Här presenterar vi ett tumörtransplantationsprotokoll för karakterisering av tumör-inneboende och periferi-härledda tumörinfiltrerade lymfocyter i en mustumörmodell. Specifik spårning av tillströmningen av mottagarhärledda immunceller med flödescytometri avslöjar dynamiken i de fenotypiska och funktionella förändringarna hos dessa celler under antitumörimmunsvar.
Abstract
T-cellmedierad immunitet spelar en avgörande roll i immunsvar mot tumörer, med cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) som spelar den ledande rollen för att utrota cancerceller. Ursprunget och påfyllningen av tumörantigenspecifika CD8 + T-celler inom tumörmikromiljön (TME) förblir emellertid oklara. Detta protokoll använder B16F10-OVA melanomcellinjen, som stabilt uttrycker surrogatneoantigen, ovalbumin (OVA) och TCR-transgena OT-I-möss, där över 90% av CD8 + T-cellerna specifikt känner igen den OVA-härledda peptiden OVA257-264 (SIINFEKL) bunden till klass I-molekylen H2-Kb. Dessa funktioner möjliggör studier av antigenspecifika T-cellsvar under tumorigenes.
Genom att kombinera denna modell med tumörtransplantationskirurgi transplanterades tumörvävnader från givare till tumörmatchade syngena mottagarmöss för att exakt spåra tillströmningen av mottagarhärledda immunceller till transplanterade donatorvävnader, vilket möjliggjorde analys av immunsvaren hos tumör-inneboende och periferi-ursprung antigenspecifik CD8+ T-celler. En dynamisk övergång visade sig inträffa mellan dessa två populationer. Sammantaget har denna experimentella design gett ett annat tillvägagångssätt för att exakt undersöka immunsvaren hos CD8 + T-celler i TME, vilket kommer att kasta nytt ljus på tumörimmunologi.
Introduction
CD8+ T-cellmedierat immunsvar spelar en avgörande roll för att kontrollera tumörtillväxt. Under tumorigenes aktiveras naiva CD8 + T-celler vid antigenigenkänning på ett MHC klass I-begränsat sätt och differentieras därefter till effektorceller och infiltrerar i tumörmassa 1,2. Inom tumörmikromiljön (TME) driver emellertid långvarig antigenexponering, liksom immunsuppressiva faktorer, infiltrerade tumörspecifika CD8 + T-celler till ett hyporesponsivt tillstånd som kallas “utmattning”3. Utmattade T-celler (Tex) skiljer sig från effektor- eller minnes-T-celler som genereras vid akut virusinfektion, både transkriptionellt och epigenetiskt. Dessa Tex-celler kännetecknas huvudsakligen av det ihållande och förhöjda uttrycket av en serie hämmande receptorer samt den hierarkiska förlusten av effektorfunktioner. Vidare resulterar den försämrade proliferativa kapaciteten hos utmattade CD8 + T-celler i minskande antal tumörspecifika T-celler, så att de återstående CD8 + T-cellerna i TME knappt kan ge tillräcklig skyddande immunitet mot tumörprogression3. Således är underhåll eller förstärkning av intratumorala antigenspecifika CD8 + T-celler oumbärliga för tumörförtryck.
Dessutom antas immunkontrollpunktsblockad (ICB) -terapi återuppliva Tex i tumörer genom att öka T-cellinfiltrationen och därmed T-cellnummer och föryngra T-cellfunktioner för att öka tumörrepressionen. Den utbredda tillämpningen av ICB-behandling har förändrat cancerterapilandskapet, med en betydande delmängd av patienterna som upplever varaktiga svar 4,5,6. Ändå svarar majoriteten av patienter och cancertyper inte eller bara tillfälligt på ICB. Otillräcklig T-cellinfiltration i TME har postulerats vara en av de underliggande mekanismerna som står för ICB-resistens 7,8.
Flera studier har visat heterogeniteten hos tumörinfiltrerande CD8 + T-celler (TILs) hos både patienter och musmodeller 9,10,11,12. Det har bekräftats att en delmängd av CD8 + T-celler som uttrycker T-cellfaktor-1 (TCF1) i en tumörmassa uppvisar stamcellsliknande egenskaper, vilket ytterligare kan ge upphov till terminalt utmattade T-celler och är ansvarig för spridningsutbrottet efter ICB-terapi 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Det har emellertid visat sig att endast en liten andel antigenspecifika TCF1 + CD8 + T-celler finns i TME och genererar en utökad pool av differentierad avkomma som svar på ICB 23,24,25,26. Huruvida den begränsade storleken på denna population är tillräcklig för att säkerställa persistensen av cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) för att kontrollera tumörprogression är fortfarande okänd, och om det finns påfyllning från periferivävnader kräver ytterligare undersökning. Vidare tyder ny forskning på otillräcklig återupplivningskapacitet hos redan existerande tumörspecifika T-celler och utseendet på nya, tidigare icke-existerande klonotyper efter antiprogrammerad celldödsprotein 1-behandling. Detta indikerar att T-cellsvaret på kontrollpunktsblockad kan bero på den nya tillströmningen av en distinkt repertoar av T-cellkloner27. Tillsammans med närvaron av åskådare icke-tumörreaktiv cytotoxisk T-cellfraktion i TME, föranledde dessa fynd inrättandet av en tumör allograftmodell för att studera rollen av periferi-härledda CD8 + T-celler11.
Hittills har flera typer av tumörimplantation, liksom immuncellsad adoptivöverföring, använts i stor utsträckning inom tumörimmunologi28. TILs, perifera blodmononukleära celler och tumörreaktiva immunceller som härrör från andra vävnader kan karakteriseras väl med hjälp av dessa metoder. Men när man studerar interaktionerna mellan systemisk och lokal antitumörimmunitet verkar dessa modeller otillräckliga för att undersöka interaktionerna mellan immunceller som härrör från periferin och TME. Här transplanterades tumörvävnader från donatorer till tumörmatchade mottagarmöss för att exakt spåra tillströmningen av mottagarhärledda immunceller och observera de givar-härledda cellerna i TME samtidigt.
I denna studie etablerades en murin syngen modell av melanom med B16F10-OVA melanomcellinjen, som stabilt uttrycker surrogat neoantigen ovalbumin. TCR-transgena OT-I-möss, där över 90% av CD8 + T-cellerna specifikt känner igen den OVA-härledda peptiden OVA257-264 (SIINFEKL) bunden till klass I MHC-molekylen H2-Kb, möjliggör studier av antigenspecifika T-cellsvar som utvecklats i B16F10-OVA-tumörmodellen. Genom att kombinera denna modell med tumörtransplantation jämfördes immunsvaren hos tumör-inneboende och periferi-originerade antigenspecifika CD8 + T-celler för att avslöja en dynamisk övergång mellan dessa två populationer. Sammantaget har denna experimentella design gett ett annat tillvägagångssätt för att exakt undersöka immunsvaren hos CD8 + T-celler i TME, vilket ger nytt ljus på dynamiken i tumörspecifika T-cellsimmunsvar i TME.
Protocol
Representative Results
Discussion
T-cellmedierad immunitet spelar en avgörande roll i immunsvar mot tumörer, med CTL som spelar den ledande rollen för att utrota cancerceller. Ursprunget till tumörantigenspecifika CTL inom TME har dock inte belysts30. Användningen av detta tumörtransplantationsprotokoll har gett en viktig ledtråd om att intratumorala antigenspecifika CD8 + T-celler kanske inte kvarstår under lång tid, trots förekomsten av stamliknande TCF1 + stamfader CD8 + T-celler. I sy…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av bidrag från National Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (nr 31825011 till LY) och National Natural Science Foundation of China (nr 31900643 till QH, nr 31900656 till ZW).
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGPR33RB | |
| 1 mL tuberculin syringe | KDL | BB000925 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16F10-OVA cell line | bluefbio | BFN607200447 | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2 | BD Horizon | 562895 | Clone:104 |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19853 | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
Referências
- Blank, C. U., et al. Defining ‘T cell exhaustion. Nature Reviews Immunology. 19 (11), 665-674 (2019).
- Leko, V., Rosenberg, S. A. Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors. Cancer Cell. 38 (4), 454-472 (2020).
- McLane, L. M., Abdel-Hakeem, M. S., Wherry, E. J. CD8 T cell exhaustion during chronic viral infection and cancer. Annual Review of Immunology. 37, 457-495 (2019).
- Davis, M. M., Brodin, P. Rebooting human immunology. Annual Review of Immunology. 36, 843-864 (2018).
- Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
- Littman, D. R. Releasing the brakes on cancer immunotherapy. Cell. 373 (16), 1490-1492 (2015).
- Verma, V., et al. PD-1 blockade in subprimed CD8 cells induces dysfunctional PD-1(+)CD38(hi) cells and anti-PD-1 resistance. Nature Immunology. 20, 1231-1243 (2019).
- Hashimoto, M., et al. CD8 T cell exhaustion in chronic infection and cancer: opportunities for interventions. Annual Review of Medicine. 69, 301-318 (2018).
- Dammeijer, F., et al. The PD-1/PD-L1-checkpoint restrains T cell immunity in tumor-draining lymph nodes. Cancer Cell. 38 (5), 685-700 (2020).
- Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 8 (2), 000867 (2020).
- Philip, M., Schietinger, A. Heterogeneity and fate choice: T cell exhaustion in cancer and chronic infections. Current Opinion in Immunology. 58, 98-103 (2019).
- Miller, B. C., et al. Subsets of exhausted CD8(+) T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade. Nature Immunology. 20, 326-336 (2019).
- Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579, 274-278 (2020).
- Im, S. J., Konieczny, B. T., Hudson, W. H., Masopust, D., Ahmed, R. PD-1+ stemlike CD8 T cells are resident in lymphoid tissues during persistent LCMV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 117 (8), 4292-4299 (2020).
- Beltra, J. C., et al. Developmental relationships of four exhausted CD8(+) T cell subsets reveals underlying transcriptional and epigenetic landscape control mechanisms. Immunity. 52 (5), 825-841 (2020).
- Myers, L. M., et al. A functional subset of CD8(+) T cells during chronic exhaustion is defined by SIRPalpha expression. Nature Communications. 10 (1), 794 (2019).
- Jansen, C. S., et al. An intra-tumoral niche maintains and differentiates stem-like CD8 T cells. Nature. 576, 465-470 (2019).
- Jadhav, R. R., et al. Epigenetic signature of PD-1+ TCF1+ CD8 T cells that act as resource cells during chronic viral infection and respond to PD-1 blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 116 (28), 14113-14118 (2019).
- Li, H., et al. Dysfunctional CD8 T cells form a proliferative, dynamically regulated compartment within human melanoma. Cell. 176 (4), 775-789 (2018).
- Kurtulus, S., et al. Checkpoint blockade immunotherapy induces dynamic changes in PD-1(-)CD8(+) tumor-infiltrating T cells. Immunity. 50 (1), 181-194 (2019).
- Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in PD-1/PD-L1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), 124507 (2018).
- E, J. F., et al. CD8(+)CXCR5(+) T cells in tumor-draining lymph nodes are highly activated and predict better prognosis in colorectal cancer. Human Immunology. 79 (6), 446-452 (2018).
- Snell, L. M., et al. CD8(+) T cell priming in established chronic viral infection preferentially directs differentiation of memory-like cells for sustained immunity. Immunity. 49 (4), 678-694 (2018).
- Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+) T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195-211 (2019).
- Wang, Y., et al. The transcription factor TCF1 preserves the effector function of exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Frontiers in Immunology. 10, 169 (2019).
- Krishna, S., et al. Stem-like CD8 T cells mediate response of adoptive cell immunotherapy against human cancer. Science. 370 (6522), 1328-1334 (2020).
- Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nature Medicine. 25, 1251-1259 (2019).
- Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillere, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. Mouse models in oncoimmunology. Nature Reviews Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).
- Li, Y., et al. Bcl6 preserves the suppressive function of regulatory T cells during tumorigenesis. Frontiers in Immunology. 11, 806 (2020).
- Yu, D., Ye, L. A portrait of CXCR5(+) follicular cytotoxic CD8(+) T cells. Trends in Immunology. 39 (12), 965-979 (2018).
- Bracci, L., et al. Cyclophosphamide enhances the antitumor efficacy of adoptively transferred immune cells through the induction of cytokine expression, B-cell and T-cell homeostatic proliferation, and specific tumor infiltration. Clinical Cancer Research. 13 (2), 644-653 (2007).
- Salem, M. L., El-Naggar, S. A., Mahmoud, H. A., Elgharabawy, R. M., Bader, A. M. Cyclophosphamide eradicates murine immunogenic tumor coding for a non-self-antigen and induces antitumor immunity. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 32, 1-5 (2018).
- Thorsson, V., et al. The Immune landscape of cancer. Immunity. 48 (4), 812-830 (2018).
