Summary
Diferentes modelos de oclusión de la arteria cerebral media (MCAo) se utilizan en la investigación experimental del accidente cerebrovascular. Aquí, se describe un modelo experimental de accidente cerebrovascular de MCAo transitorio a través de la arteria carótida externa (ECA), que tiene como objetivo imitar el accidente cerebrovascular humano, en el que el trombo cerebrovascular se elimina debido a la lisis o terapia espontánea del coágulo.
Abstract
El accidente cerebrovascular es la tercera causa más común de mortalidad y la principal causa de discapacidad adquirida en adultos en los países desarrollados. Hasta la fecha, las opciones terapéuticas se limitan a una pequeña proporción de pacientes con accidente cerebrovascular dentro de las primeras horas después del accidente cerebrovascular. Se están investigando ampliamente nuevas estrategias terapéuticas, especialmente para prolongar la ventana de tiempo terapéutico. Estas investigaciones actuales incluyen el estudio de importantes vías fisiopatológicas después del accidente cerebrovascular, como la inflamación posterior al accidente cerebrovascular, la angiogénesis, la plasticidad neuronal y la regeneración. Durante la última década, ha habido una creciente preocupación por la escasa reproducibilidad de los resultados experimentales y los hallazgos científicos entre los grupos de investigación independientes. Para superar la llamada "crisis de replicación", se necesitan urgentemente modelos estandarizados detallados para todos los procedimientos. Como un esfuerzo dentro del consorcio de investigación "ImmunoStroke" (https://immunostroke.de/), se propone un modelo de ratón estandarizado de oclusión transitoria de la arteria cerebral media (MCAo). Este modelo permite la restauración completa del flujo sanguíneo tras la eliminación del filamento, simulando la lisis de coágulos terapéutica o espontánea que se produce en una gran proporción de accidentes cerebrovasculares humanos. El procedimiento quirúrgico de este modelo de accidente cerebrovascular de "filamento" y las herramientas para su análisis funcional se muestran en el video adjunto.
Introduction
El accidente cerebrovascular es una de las causas más comunes de muerte y discapacidad en todo el mundo. Aunque hay principalmente dos formas distintas de accidente cerebrovascular, isquémico y hemorrágico, el 80-85% de todos los casos de accidente cerebrovascular son isquémicos1. Actualmente, solo hay dos tratamientos disponibles para pacientes con accidente cerebrovascular isquémico: tratamiento farmacológico con activador tisular recombinante del plasminógeno (rtPA) o trombectomía mecánica. Sin embargo, debido a la estrecha ventana de tiempo terapéutico y los múltiples criterios de exclusión, solo un número selecto de pacientes puede beneficiarse de estas opciones de tratamiento específicas. Durante las últimas dos décadas, la investigación preclínica y traslacional del accidente cerebrovascular se ha centrado en el estudio de los enfoques neuroprotectores. Sin embargo, todos los compuestos que llegaron a los ensayos clínicos hasta ahora no han mostrado mejoras para el paciente2.
Dado que los modelos in vitro no pueden reproducir con precisión todas las interacciones cerebrales y los mecanismos fisiopatológicos del accidente cerebrovascular, los modelos animales son cruciales para la investigación preclínica del accidente cerebrovascular. Sin embargo, imitar todos los aspectos del accidente cerebrovascular isquémico humano en un solo modelo animal no es factible, ya que el accidente cerebrovascular isquémico es una enfermedad altamente compleja y heterogénea. Por esta razón, se han desarrollado diferentes modelos de accidente cerebrovascular isquémico a lo largo del tiempo en diferentes especies. La fototrombosis de las arteriolas cerebrales o la oclusión distal permanente de la arteria cerebral media (ACM) son modelos de uso común que inducen lesiones pequeñas y localmente definidas en el neocórtex3,4. Además de esos, el modelo de accidente cerebrovascular más utilizado es probablemente el llamado "modelo de filamento", en el que se logra una oclusión transitoria de MCA. Este modelo consiste en una introducción transitoria de un filamento de sutura al origen del ACM, dando lugar a una reducción brusca del flujo sanguíneo cerebral y al posterior gran infarto de regiones cerebrales subcorticales y corticales5. Aunque la mayoría de los modelos de trazo imitan las oclusiones MCA 6,el "modelo de filamento" permite la delimitación precisa del tiempo isquémico. La reperfusión por eliminación de filamentos imita el escenario clínico humano de la restauración del flujo sanguíneo cerebral después de la lisis espontánea o terapéutica (rtPA o trombectomía mecánica). Hasta la fecha, se han descrito diferentes modificaciones de este "modelo de filamento". En el enfoque más común, descrito por primera vez por Longa et al. en 19895, se introduce un filamento recubierto de silicio a través de la arteria carótida común (CCA) al origen del MCA7. Aunque es un enfoque ampliamente utilizado, este modelo no permite la restauración completa del flujo sanguíneo durante la reperfusión, ya que el CCA se liga permanentemente después de la eliminación del filamento.
Durante la última década, un número creciente de grupos de investigación se han interesado en modelar el accidente cerebrovascular en ratones utilizando este "modelo de filamento". Sin embargo, la considerable variabilidad de este modelo y la falta de estandarización de los procedimientos son algunas de las razones de la alta variabilidad y escasa reproducibilidad de los resultados experimentales y hallazgos científicos reportados hasta el momento2,8. Una causa potencial de la actual "crisis de replicación", refiriéndose a la baja reproducibilidad entre los laboratorios de investigación, son los volúmenes de infarto de ictus no comparables entre grupos de investigación que utilizan la misma metodología experimental9. De hecho, después de realizar el primer estudio preclínico aleatorizado controlado multicéntrico10,pudimos confirmar que la falta de estandarización suficiente de este modelo experimental de accidente cerebrovascular y los parámetros de resultado posteriores fueron las principales razones del fracaso de la reproducibilidad en estudios preclínicos entre laboratorios independientes11 . Estas diferencias drásticas en los tamaños de infarto resultantes, a pesar de usar el mismo modelo de accidente cerebrovascular, representan justificadamente no solo una amenaza para la investigación confirmatoria, sino también para las colaboraciones científicas debido a la falta de modelos robustos y reproducibles.
A la luz de estos desafíos, nuestro objetivo fue desarrollar y describir en detalle el procedimiento para un modelo MCAo transitorio estandarizado utilizado para los esfuerzos de investigación colaborativa dentro del consorcio de investigación "ImmunoStroke" (https://immunostroke.de/). Este consorcio tiene como objetivo comprender las interacciones cerebro-inmunidad subyacentes a los principios mecanicistas de la recuperación del accidente cerebrovascular. Además, se presentan métodos histológicos y funcionales relacionados para el análisis de resultados de accidente cerebrovascular. Todos los métodos se basan en procedimientos operativos estándar establecidos utilizados en todos los laboratorios de investigación del consorcio ImmunoStroke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Los experimentos reportados en este video se llevaron a cabo siguiendo las pautas nacionales para el uso de animales de experimentación, y los protocolos fueron aprobados por los comités gubernamentales alemanes (Regierung von Oberbayern, Munich, Alemania). Se utilizaron ratones machos C57Bl/6J de diez semanas de edad y se alojaron a temperatura controlada (22 ± 2 °C), con un período de ciclo de luz-oscuridad de 12 h y acceso a alimentos granulados y agua ad libitum.
1. Preparación del material y los instrumentos
- Conecte la manta térmica para mantener la temperatura del área de operación y la temperatura corporal del ratón durante la anestesia a 37 °C.
- Tijeras y fórceps en autoclave, prepare una solución de etanol al 70% y mantenga disponible el ungüento ocular dexpantenol, varias piezas de algodón y la sutura de poliéster trenzado recubierto 5-0 listo para su uso. Prepare una jeringa de 1 ml con solución salina al 0,9% (sin aguja) para mantener hidratado el sitio de incisión del animal. Preparar el gasestésico (100% O2 + isoflurano).
- Prepare un soporte para la sonda Láser Doppler cortando la punta de una punta de pipeta de 10 μL (longitud de 3-5 mm).
NOTA: Todos los instrumentos se esterilizan utilizando un esterilizador de cuentas calientes. Las superficies también se desinfectan antes y después de la cirugía con un aerosol desinfectante microbiano. Antes de la cirugía, las áreas que rodean la cabeza y el pecho de los ratones se desinfectan con un aerosol de desinfección de heridas.
2. Preparación del láser Doppler
- Inyecte analgesia al ratón 30 min antes de la cirugía (4 mg/kg de carprofeno y 0,1 mg/kg de buprenorfina, por vía intraperitoneal).
- Anestesiar al ratón colocándolo en la cámara de inducción con un caudal de isoflurano del 4% hasta el cese del movimiento espontáneo del cuerpo y las vibrisas.
- Coloque el ratón en posición prona en el área de operación con la nariz en la máscara de anestesia. Mantenga la concentración de isoflurano al 4% durante otro minuto, luego redúzcala y manténgala en un 2%.
- Ajuste la almohadilla térmica controlada por retroalimentación asociada para mantener la temperatura corporal del ratón a 37 ° C e inserte suavemente la sonda rectal para controlar la temperatura durante los procedimientos quirúrgicos.
- Aplique ungüento ocular dexpantenol en ambos ojos.
- Desinfecte la piel y el cabello que rodea el ojo izquierdo y el oído con etanol al 70%.
- Corte el cuero cabelludo entre la oreja izquierda y el ojo (1 cm de largo) para exponer el hueso del cráneo.
- Cortar y retirar el músculo temporal para visualizar el MCA debajo del cráneo.
- Fije con pegamento la parte exterior de la punta que sujeta la sonda/ fibra Doppler láser en la parte superior del MCA izquierdo con pegamento. Luego, pegue la piel para cerrar la herida alrededor del soporte de la punta. Aplique 2-3 gotas de pegamento endurecedor para acelerar el proceso. Asegúrese de que la fibra Doppler láser no esté pegada y se pueda quitar fácilmente del soporte de la punta en cualquier momento.
3. Modelo MCAo transitorio (oclusión)
- Gire el ratón en posición supina. Coloque el hocico en el cono de anestesia y fije las patas con cinta adhesiva.
- Desinfecte la piel y el cabello que rodea el pecho y haga una incisión en la línea media de 2 cm de largo en el cuello.
- Use fórceps para separar la piel y las glándulas submandibulares. Use retractores para sostener el músculo esternomastoideo, exponer el campo quirúrgico y encontrar la arteria carótida común izquierda (CCA). Diseccionar el CCA libre de tejido conectivo y nervios circundantes (sin dañar el nervio vago) y realizar una ligadura transitoria antes de la bifurcación.
- Diseccionar la arteria carótida externa (ECA) y atar un nudo permanente en la parte visible más distal. Coloque otra sutura debajo del ECA, cerca de la bifurcación, y prepare un nudo suelto para usarlo más tarde.
- Diseccionar la arteria carótida interna (ICA) y colocar un clip microvascular sobre ella, 5 mm sobre la bifurcación. Asegúrese de no dañar el nervio vago.
- Cortar un pequeño agujero en el ECA entre las ligaduras apretadas y sueltas; tenga cuidado de no cortar todo el TCE.
- Introduce el filamento y avanza hacia el CCA. Apriete la ligadura suelta en la ECA alrededor de la luz para asegurar brevemente el filamento en esa posición y evitar el sangrado al retirar el clip microvascular.
- Retire el clip microvascular e inserte el filamento a través del ICA hasta que se alcance el origen del MCA mediante la detección de una reducción brusca (>80%) en el flujo sanguíneo cerebral medido por el láser Doppler. Fije el filamento en esta posición apretando aún más el nudo alrededor del ECA.
NOTA: Cuando el filamento va hacia la dirección apropiada, avanza suavemente y no se debe observar resistencia. - Registre los valores doppler del láser antes y después de la inserción del filamento.
- Retire el retractor y reubique el músculo esternomastoideo y las glándulas submandibulares antes de suturar la herida. Retire la sonda Láser Doppler y coloque al animal en una cámara de recuperación a 37 °C durante 1 h (hasta la extracción del filamento).
4. Modelo MCAo transitorio (reperfusión)
- Anestesiar al ratón colocándolo en la cámara de inducción con un caudal de isoflurano del 4% hasta el cese del movimiento espontáneo del cuerpo y las vibrisas.
- Aplique ungüento ocular dexpantenol en ambos ojos.
- Coloque el ratón en posición prona en el área de operación con su hocico en la máscara de anestesia. Mantenga la concentración de isoflurano al 4% durante otro minuto, luego redúzcala y manténgala en un 2%. Fije las patas del animal con cinta adhesiva.
- Inserte la sonda Doppler láser en el soporte de la sonda.
- Retire la sutura de la herida, use fórceps para separar la piel y las glándulas submandibulares. Use retractores para tirar suavemente del músculo esternomastoideo y exponer el campo quirúrgico.
- Afloje la sutura ECA que aprieta el filamento y tire suavemente del filamento. Evite dañar el recubrimiento de caucho de silicona del filamento durante la extracción.
- Ata bien la sutura ECA.
- Confirmar el aumento del flujo sanguíneo cerebral en el dispositivo Doppler láser (>80% del valor inicial antes de la reperfusión).
- Registre los valores de Doppler láser antes y después de la eliminación del filamento.
- Abra la ligadura transitoria antes de la bifurcación del CCA.
- Retire el retractor y reubique el músculo esternomastoideo y las glándulas submandibulares antes de suturar la herida. Coloque al animal en una cámara de recuperación a 37 °C durante 1 h para recuperarse de la anestesia.
- Después de la recuperación, devuelva a los ratones a sus jaulas en una habitación con temperatura controlada.
- Cuide a los animales agregando gránulos de comida húmeda e hidrogel en pequeñas placas de Petri en el piso de la jaula hasta el día 3 después de la cirugía.
- Inyecte analgesia cada 12 h durante 3 días después de la cirugía (4 mg/kg de carprofeno y 0,1 mg/kg de buprenorfina).
5. Operación simulada
- Realice todos los procedimientos descritos anteriormente, incluida la ligadura de las arterias y la introducción del filamento (pasos 1-3.7).
- Retire el filamento inmediatamente después de su inserción. Luego, coloque al animal en la cámara de recuperación durante 1 h.
- Coloque al animal en el área de operación nuevamente y retire la ligadura transitoria del CCA para garantizar la restauración completa del flujo sanguíneo cerebral.
- Sutura la herida y coloca al animal en una cámara de recuperación a 37 °C durante 1 h para recuperarse de la anestesia. Después de la recuperación, devuelva a los ratones a sus jaulas en una habitación con temperatura controlada.
- Cuide a los animales agregando gránulos de comida húmeda e hidrogel en pequeñas placas de Petri en el piso de la jaula hasta el día 3 después de la cirugía.
- Inyecte analgesia cada 12 h durante 3 días después de la cirugía (4 mg/kg de carprofeno y 0,1 mg/kg de buprenorfina).
6. Neuropuntuación
- Realice el Neuroscore siempre a la misma hora del día y use ropa quirúrgica para mantener un "olor neutro" entre los cirujanos individuales.
- Deje que los ratones descansen durante 30 minutos en la habitación con una jaula "abierta" antes de la prueba.
- Observe cada elemento en la Tabla 1 y la Tabla 2 durante 30 s.
7. Perfusión intracardíaca
- Prepare una jeringa de 20 ml que contenga solución salina tamponada con fosfato (PBS)-heparina (2 U/ml) y colóquela 1 m por encima del banco para facilitar la perfusión impulsada por la gravedad. (OPCIONAL: Realizar perfusión intracardíaca con paraformaldehído (PFA) al 4% utilizando una jeringa de 20 ml que contiene 4% de PFA en PBS, pH 7.4).
- Inyectar intrperitonealmente 100 μL de ketamina y xilazina (120 y 16 mg/kg de peso corporal, respectivamente). Espere 5 minutos y confirme el cese del movimiento espontáneo del cuerpo y las vibrisas.
- Fije al animal en posición supina y desinfecte la superficie corporal abdominal con etanol al 70%.
- Haga una incisión de 3 cm de largo en el abdomen; cortar el diafragma, las costillas y el esternón para visualizar el corazón por completo.
- Haga una pequeña incisión en la aurícula derecha e inserte la cánula de perfusión en el ventrículo izquierdo.
- Perfusión con 20 ml de PBS-heparina.
- Después de la perfusión, decapita al animal y elimina el cerebro.
- Congele el cerebro sobre hielo seco en polvo y guárdelo a -80 °C hasta su uso posterior.
8. Volumetría de infarto
- Para la crioseccionación, use un criostato para cortar los cerebros en secciones de 20 μm de espesor cada 400 μm. Coloque las secciones en las diapositivas y guárdelas a -80 °C hasta su uso.
- Tinción de violeta cresil (CV)
- Preparar la solución de tinción agitando y calentando (60 °C) 0,5 g de acetato CV en 500 mL de H2O hasta que los cristales se disuelvan. Después de que la solución se haya enfriado, guárdela en una botella oscura. Vuelva a calentar a 60 °C y filtre antes de cada uso.
- Deje que los portaobjetos se sequen a temperatura ambiente durante 30 min. Sumergirlos en etanol al 95% durante 15 min, en etanol al 70% durante 1 min, y luego en etanol al 50% durante 1 min.
- Sumergir los toboganes en agua destilada durante 2 min; refresque el agua destilada y coloque los toboganes en el agua durante 1 min. Después, sumerja los portaobjetos en la solución de tinción precalentada durante 10 min a 60 °C. Lave los toboganes dos veces en agua destilada durante 1 min.
- Sumergir los portaobjetos en etanol al 95% durante 2 min. Colóquelos en etanol al 100% durante 5 minutos; refresque el etanol 100% y coloque las diapositivas nuevamente en el etanol durante 2 min. Después, cubra las diapositivas con un medio de montaje.
- Análisis (Figura 4C)
- Escanee las diapositivas y analice el volumen del infarto indirecto mediante el método de Swanson12 para corregir el edema mediante el uso de la siguiente ecuación:
(Área isquémica) = (región isquémica)-((hemisferio ipsilateral)-(hemisferio contralateral))
- Escanee las diapositivas y analice el volumen del infarto indirecto mediante el método de Swanson12 para corregir el edema mediante el uso de la siguiente ecuación:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El modelo aquí descrito es una modificación del modelo de trazo de "filamento" comúnmente utilizado, que consiste en introducir un filamento recubierto de silicio a través del ECA para bloquear transitoriamente el origen del MCA(Figura 1). Después de retirar el filamento, solo el flujo sanguíneo en la ECA se detiene permanentemente, lo que permite la recanalización completa del CCA y el ICA. Esto permite una adecuada reperfusión del cerebro (Figura 2), similar a la situación observada después de una trombólisis farmacológica exitosa o una trombectomía mecánica en pacientes humanos. Además, este trabajo también describe un método para medir el flujo sanguíneo cerebral durante los procedimientos de oclusión y reperfusión mediante la fijación de una cánula conectada a la sonda Doppler láser en el cráneo sobre el territorio MCA.
La tasa de mortalidad general del procedimiento quirúrgico es del <5% cuando es realizada por un cirujano capacitado. En los primeros puntos de tiempo después de MCAo, los animales generalmente presentan déficits posturales y de movimiento severos, debilidad general y pérdida de peso corporal13. Estos déficits severos son transitorios, y los animales muestran una mejor actividad después de aproximadamente 1 semana; por lo tanto, los déficits son más específicos para los síntomas neurológicos focales.
Los déficits conductuales después de la oclusión de MCA fueron evaluados por el compuesto Neuroscore14; los déficits generales y focales se midieron 24 h y 3 d después de la cirugía. El Neuroscore general integra 5 ítems(Tabla 1),incluyendo la evaluación del pelaje, orejas, ojos, postura y actividad espontánea, con una puntuación máxima de 18. El Neuroscore focal comprende 7 ítems(Tabla 2),incluyendo la evaluación de la simetría corporal, la marcha, la escalada, el comportamiento en círculos, la simetría de las extremidades anteriores, el ciclismo obligatorio y la respuesta de los bigotes, con una puntuación máxima de 28. La escala compuesta oscila entre 0 (sin déficits) y 46 (deficiencias graves). Los animales con accidente cerebrovascular presentaron un cambio significativo en el Neuroscore compuesto y focal, pero no en el Neuroscore general, en comparación con los animales simulados(Figura 3).
La volumetría del infarto también se realizó mediante la tinción de Cresyl Violet de las secciones cerebrales seriadas coronales 24 h después de la inducción del accidente cerebrovascular. La media del volumen de infarto fue de 61,69 mm3,representando el 48% del hemisferio cerebral afectado(Figura 4). Cuando es realizado por un cirujano capacitado, la variabilidad general de este modelo de accidente cerebrovascular es baja, con un coeficiente de variación de <6%. El área de la lesión incluye la corteza somatosensorial y motora, así como estructuras subcorticales como el cuerpo estriado(Figura 4).
Figura 1: Esquema para el acceso y la oclusión intraluminal del MCA. El filamento (línea punteada) se inserta entre los nudos de sutura proximal y distal en el ECA y avanza a lo largo del ICA hasta llegar al origen del MCA (ver recuadro). Una vez en su lugar, el ECA se liga con una sutura para fijar el filamento. Abreviaturas: ACA = arteria cerebral anterior; BA = arteria basilar; CCA = arteria carótida común; ECA = arteria carótida externa; ICA = arteria carótida interna; MCA = arteria cerebral media; PCA = arteria comunicante posterior; PTG = arteria pterigopalatina. Esta figura ha sido modificada a partir de Jackman etal. 15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Flujo sanguíneo durante la oclusión y reperfusión. El flujo sanguíneo se registra antes y después de la inserción del filamento y antes y después de la extracción del filamento. Se observó una reducción en el flujo sanguíneo durante la oclusión y la restauración del flujo sanguíneo durante la reperfusión. Cada color representa un animal. Abreviaturas: MCA = arteria cerebral media; CBF = flujo sanguíneo cerebral; A.U. = unidades arbitrarias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Neuropuntuación para déficits funcionales después de tMCAo. (A) Total, (B) focal, y (C) Neuroscore general antes y 24 h y 3 d después de tMCAo. Barras abiertas: sham; Barras negras: tMCAo. n=10 por grupo. *p < 0,05. Abreviaturas: tMCAo = oclusión transitoria de la arteria cerebral media; BL = antes de tMCAo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis volumétrico del infarto y resultado del infarto 24 h después de tMCAo. (A) Secciones cerebrales coronales teñidas de violeta cresil cada 400 μm a las 24 h después de tMCAo. Las líneas discontinuas demarcan el área de la lesión. (B) Análisis del volumen de infarto de 10 cerebros (cada punto representa un cerebro individual) 24 h después de tMCAo. La línea roja horizontal representa la media (61,69 mm3), las barras de error indican la desviación estándar (3,78 mm3). (C) Imagen representativa para el cálculo del volumen del infarto a partir de una sección coronal de color violeta cresil. Azul = Hemisferio contralateral; Rojo = hemisferio ipsilateral; Área rayada pálida = Región isquémica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tiempo-punto de puntuación | puntuación | ||
| Neuropuntuación general | Cabello | 0. Cabello limpio y ordenado | |
| 1. Piloerección localizada y cabello sucio en 2 partes del cuerpo (nariz y ojos) | |||
| 2. Piloerección y cabello sucio en >2 partes del cuerpo | |||
| Orejas (ratón en una mesa de trabajo abierta) | 0. Normal (las orejas se estiran lateralmente y detrás, reaccionan enderezándose después del ruido) | ||
| 1. Estirados lateralmente pero no detrás (uno o ambos), reaccionan al ruido | |||
| 2. Igual que 1. NO Reacción al ruido. | |||
| Ojos (ratón en OBT) | 0. Abrir, limpiar y seguir rápidamente el entorno circundante | ||
| 1. Abierto y caracterizado por moco acuoso. Siga lentamente el entorno circundante | |||
| 2. Abierto y caracterizado por moco oscuro | |||
| 3. Forma elipsoidal y caracterizada por moco oscuro | |||
| 4. Cerrado | |||
| Postura (coloque el ratón sobre la palma de la mano y balancee suavemente) | 0. El ratón se encuentra en posición vertical con la espalda paralela a la palma de la mano. Durante el swing, se mantiene rápidamente. | ||
| 1. El ratón está jorobado. Durante el swing, aplana el cuerpo para ganar estabilidad. | |||
| 2. La cabeza o parte del tronco se encuentra en la palma de la mano. | |||
| 3. El ratón se encuentra en un lado, apenas capaz de recuperar la posición vertical. | |||
| 4. El ratón se encuentra en posición prona, no capaz de recuperar la posición vertical. | |||
| Actividad espontánea (ratón en OBT) | 0.El ratón está alerta y explora activamente. | ||
| 1. El ratón parece alerta, pero es tranquilo y lento. | |||
| 2. El ratón explora de forma intermitente y lenta. | |||
| 3. El ratón es somnoliento y entumecido, pocos movimientos en el acto. | |||
| 4.No movimientos espontáneos | |||
| Puntuación total para la puntuación general | |||
| (normal=0 max=18) | |||
Tabla 1: Neuroscore General. Los animales recibieron entre 0 y 4 puntos, dependiendo de la gravedad, por cada uno de los cinco déficits generales medidos. Los puntajes en las diferentes áreas se agregan para proporcionar un puntaje general total que varía de 0 a 18. Esta tabla ha sido modificada a partir de Clark et al.14 . Abreviatura: OBT = mesa de sobremesa abierta.
| Tiempo-punto de puntuación | puntuación | ||
| Neuropuntuación focal | Simetría corporal (ratón en OBT, observe la línea nariz-cola) | 0. Normal (Cuerpo: postura normal, tronco elevado desde el banco, con las extremidades delanteras y traseras inclinadas debajo del cuerpo. Cola: recta) | |
| 1. Ligera asimetría (Cuerpo: se apoya en un lado con las extremidades delanteras y traseras inclinadas debajo del cuerpo. Cola: ligeramente doblada) | |||
| 2. Asimetría moderada (Cuerpo: se inclina hacia un lado con las extremidades delanteras y traseras estiradas. Cola: ligeramente doblada) | |||
| 3. Asimetría prominente (Cuerpo: doblado, en un lado se encuentra en el OBT. Cola: doblada) | |||
| 4. Asimetría extrema (Cuerpo: altamente doblado, en un lado se encuentra constantemente en el OBT. Cola: muy doblada) | |||
| Marcha (ratón en OBT. Observado sin ser molestado) | 0. Normal (la marcha es flexible, simétrica y rápida) | ||
| 1. Rígido, inflexible (caminata jorobada, más lento que el ratón normal) | |||
| 2. Cojera, con movimientos asimétricos | |||
| 3. Temblor, deriva, caída | |||
| 4. No camina espontáneamente (cuando se estimula empujando suavemente el ratón no camina más de 3 pasos) | |||
| Escalada (ratón sobre una superficie de 45o. Coloque el ratón en el centro de la superficie de agarre) | 0. Normal (el ratón sube rápidamente) | ||
| 1. Escaladas con tensión, debilidad de las extremidades presente | |||
| 2. Se aferra a la pendiente, no resbala ni sube | |||
| 3. Se desliza por la pendiente, esfuerzo infructuoso para evitar fallas | |||
| 4. Diapositivas inmediatamente, sin esfuerzo para evitar fallas | |||
| Comportamiento de circunvalación (ratón en OBT, observación libre) | 0. Comportamiento de círculo ausente | ||
| 1. Giros predominantemente unilaterales | |||
| 2. Círculos hacia un lado, aunque no constantemente | |||
| 3. Círculos constantemente hacia un lado | |||
| 4. Pivote, balanceo o ningún movimiento | |||
| Simetría de las extremidades anteriores (ratón suspendido por la cola) | 0. Normal | ||
| 1. Asimetría ligera: flexión leve de la extremidad anterior contralateral | |||
| 2. Asimetría marcada: flexión marcada de la extremidad contralateral, el cuerpo se dobla ligeramente en el lado ipsilateral | |||
| 3. Asimetría prominente: la extremidad anterior contralateral se adhiere al tronco | |||
| 4. Asimetría leve, sin movimiento del cuerpo / extremidad | |||
| Círculos obligatorios (extremidades anteriores en el banco, extremidades posteriores suspendidas por la cola: revela la presencia de la parálisis de la extremidad contralateral) | 0. Ausente. Extensión normal de ambas extremidades anteriores | ||
| 1. Tendencia a girar hacia un lado (el ratón extiende ambas extremidades anteriores, pero comienza a girar preferiblemente hacia un lado) | |||
| 2. Círculos hacia un lado (el ratón gira hacia un lado con un movimiento más lento en comparación con los ratones sanos) | |||
| 3. Gira hacia un lado lentamente (el ratón gira hacia un lado sin realizar un círculo completo) | |||
| 4. No avanza (la parte delantera del tronco se encuentra en el banco, movimientos lentos y breves) | |||
| Respuesta del bigotes (ratón en el OBT) | 0. Normal | ||
| 1. Asimetría ligera (el ratón se retira lentamente cuando se estimula en el lado contralateral) | |||
| 2. Asimetría prominente (sin respuesta cuando se estimula al lado contralateral) | |||
| 3. Ausencia de respuesta contralateral, respuesta lenta cuando se estimula ipsilatéralmente | |||
| 4. Respuesta bilateral ausente | |||
| Puntuación total de los déficits focales | |||
| (normal=0 max=28) | |||
Tabla 2: Neuropuntuación Focal. Los animales recibieron entre 0 y 4 puntos dependiendo de la gravedad para cada uno de los siete déficits generales medidos. Las puntuaciones en las diferentes áreas se agregan para proporcionar una puntuación focal total que varía de 0 a 28. Esta tabla ha sido modificada a partir de Clark et al.14 . Abreviatura: OBT = mesa de sobremesa abierta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El presente protocolo describe un modelo experimental de accidente cerebrovascular basado en el acuerdo de consenso de un consorcio de investigación multicéntrico alemán ("ImmunoStroke") para establecer un modelo MCAo transitorio estandarizado. El modelo MCAo transitorio establecido mediante la introducción de un filamento recubierto de silicio a través del ECA hasta el origen del MCA es uno de los modelos de ictus más utilizados para lograr la reperfusión arterial tras un periodo de oclusión delimitado. Por lo tanto, este procedimiento puede considerarse un modelo de accidente cerebrovascular relevante para la traducción.
El "modelo de filamento" presentado en el video tiene algunas ventajas en comparación con otros modelos de accidente cerebrovascular descritos anteriormente, como no requerir craneotomía y lograr una reperfusión completa del vaso ocluido transitoriamente. Sin embargo, la complejidad de la intervención quirúrgica podría considerarse como una limitación, ya que incluye la cirugía invasiva y una manipulación precisa de las diferentes arterias muy cerca de la tráquea y el nervio vago. La larga exposición del animal a los anestésicos también podría ser un factor crítico a considerar, ya que el impacto de los anestésicos en la neuroprotección y el resultado del accidente cerebrovascular ya ha sido bien documentado16. Por último, a pesar de la complejidad de este procedimiento quirúrgico, se puede completar en aprox. 20 minutos cuando lo realiza un cirujano capacitado.
A diferencia de los protocolos de accidente cerebrovascular de "filamento" descritos anteriormente17,el método descrito aquí también permite la medición del flujo sanguíneo cerebral durante las fases de oclusión y reperfusión. La monitorización del flujo sanguíneo durante la reperfusión podría ser un parámetro importante para prevenir la lesión por reperfusión por accidente cerebrovascular18,que se sabe que causa consecuencias perjudiciales en pacientes sometidos a intervenciones farmacológicas o endovasculares para la recanalización de los vasos trombosados. A pesar de las discrepancias entre las consecuencias de la restauración del flujo sanguíneo cerebral después de MCAo19,la variabilidad de la restauración del flujo sanguíneo después del accidente cerebrovascular puede influir en los eventos fisiopatológicos y bioquímicos en el cerebro, así como en el volumen de infarto y los déficits neurológicos de los ratones con accidente cerebrovascular20. Por lo tanto, en este modelo, la restauración completa del flujo sanguíneo y su registro son requisitos para garantizar infartos reproducibles entre ratones, especialmente en estudios traslacionales de accidente cerebrovascular.
La mortalidad global durante el procedimiento quirúrgico es inferior al 5% y es causada principalmente por complicaciones anestésicas, hemorragias o sacrificios debido a criterios de exclusión predefinidos. Este modelo de accidente cerebrovascular presenta, sin embargo, una tasa de mortalidad moderada dentro de las primeras 24-48 h después de la inducción del accidente cerebrovascular, lo que podría aumentar el número de animales necesarios por experimento para lograr una cohorte adecuada de ratones con accidente cerebrovascular. En términos de volumen de infarto, este modelo induce grandes infartos, con lesiones que abarcan hasta el 50% del hemisferio. También produce edema cerebral, afectando a diferentes regiones cerebrales, incluidas las regiones corticales y subcorticales.
Para lograr una baja variabilidad y alta reproducibilidad del modelo de accidente cerebrovascular, se deben tener en cuenta varios criterios de exclusión, que incluyen: 1) tiempo de operación > 20 min; 2) >20% de la reducción del flujo sanguíneo cuando se liga CCA (paso 3.3); 3) reducción del flujo sanguíneo durante la oclusión < del 80% del valor inicial previo a la oclusión; y 4) aumento del flujo sanguíneo 10 min después de la tasa de reperfusión <80% en comparación con el valor previo a la reperfusión. Para un cirujano experimentado y entrenado, no se excluyen animales debido al criterio de tiempo de operación. Sin embargo, el 10-15% de los animales muestran una reducción del 20% en el flujo sanguíneo tras la ligadura CCA, y el 5-10% no muestran una reducción o aumento adecuado en el flujo sanguíneo durante la oclusión o la reperfusión, respectivamente. Por lo tanto, la tasa de éxito después de excluir animales en función de estos criterios es de aproximadamente 75-85%.
Además, los animales son examinados diariamente después de MCAo (peso corporal, temperatura y comportamiento fisiológico básico) para controlar el comportamiento de enfermedad, dolor o incomodidad. Además de este cuidado general, se han desarrollado varias pruebas para el análisis conductual específico después de la isquemia cerebral focal, a pesar de todas las pruebas conocidas para evaluar la disfunción sensoriomotora, como la prueba Rotarod21,la prueba de etiqueta adhesiva22,la prueba de esquina23o la prueba del cilindro24. Aquí, los animales seleccionados para el establecimiento de este modelo de accidente cerebrovascular fueron evaluados para déficits focales y generales, ya que el modelo de filamento también induce un comportamiento de enfermedad de citoquinas independiente de los déficits focales (sensoriales o motores)25. Tomado en conjunto, el modelo de trazo de "filamento" descrito aquí es un modelo valioso para la investigación básica y traslacional del accidente cerebrovascular. Este modelo se propone como un modelo de accidente cerebrovascular estandarizado que se utilizará para armonizar los modelos de accidente cerebrovascular en todos los laboratorios.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen intereses contrapuestos que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a todos nuestros socios colaboradores de los Consorcios ImmunoStroke (FOR 2879, From immune cells to stroke recovery) por sus sugerencias y discusiones. Este trabajo fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) en el marco de la Estrategia de Excelencia de Alemania en el marco del Clúster de Munich para la Neurología de Sistemas (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) y bajo las subvenciones LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 y LL-112/1-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45° ramp | H&S Kunststofftechnik | height: 18 cm | |
| 5/0 threat | Pearsalls | 10C103000 | |
| 5 mL Syringe | Braun | ||
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| Bepanthen pomade | Bayer | ||
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Clamp | FST | 12500-12 | |
| Clip | FST | 18055-04 | |
| Clip holder | FST | 18057-14 | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Fine 45 angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine forceps | FST | 11252-23 | |
| Fine Scissors | FST | 14094-11 | |
| Glue | Orechseln | BSI-112 | |
| Hardener Glue | Drechseln & Mehr | BSI-151 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | ||
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Doppler | Perimed | PF 5010 LDPM, Periflux System 5000 | |
| Laser Doppler probe | Perimed | 91-00123 | |
| Phosphate Buffered Saline pH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Recovery chamber | Mediheat | ||
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Silicon-coated filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Stereomicropscope | Leica | M80 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15000-00 | |
| Xylacine | Albrecht |
References
- Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M.
- O'Collins, V. E., et al. 1,026 experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).
- Zhang, Z., et al. A new rat model of thrombotic focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 17 (2), 123-135 (1997).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423 (2011).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- McNutt, M.
- Llovera, G., et al. Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Llovera, G., Liesz, A. The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial. Journal of Neurochemistry. 139, Suppl 2 271-279 (2016).
- Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987. Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).
- Lourbopoulos, A., et al. Inadequate food and water intake determine mortality following stroke in mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2084-2097 (2017).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).
- Jackman, K., Kunz, A., Iadecola, C. Modeling focal cerebral ischemia in vivo. Methods in Molecular Biology. 793, 195-209 (2011).
- Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4038 (2012).
- Rha, J. H., Saver, J. L. The impact of recanalization on ischemic stroke outcome: a meta-analysis. Stroke. 38 (3), 967-973 (2007).
- Liu, J., et al. Transient filament occlusion of the middle cerebral artery in rats: does the reperfusion method matter 24 hours after perfusion. BMC Neuroscience. 13, 154 (2012).
- Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. A rotarod suitable for quantitative measurements of motor incoordination in naive mice. Naunyn-Schmiedebergs Archiv für Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 259 (2), 211 (1968).
- Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4 (10), 1560-1564 (2009).
- Zhang, L., et al. A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia. Journal of Neuroscience Methods. 117 (2), 207-214 (2002).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39 (5), 777-787 (2000).
- Roth, S., Yang, J., Cramer, J., Malik, R., Liesz, A. Detection of cytokine-induced sickness behavior after ischemic stroke by an optimized behavioral assessment battery. Brain, Behavior, and Immunity. 91, 668-672 (2021).
