Summary
Hier beschrijven we een correlatieve workflow voor de excisie, druk, fixatie en beeldvorming van de muriene longklep om de bruto-conformatie en lokale extracellulaire matrixstructuren te bepalen.
Abstract
De onderliggende oorzaken van hartklepgerelateerde ziekte (HVD) zijn ongrijpbaar. Murine diermodellen bieden een uitstekend hulpmiddel voor het bestuderen van HVD, maar de chirurgische en instrumentale expertise die nodig is om de structuur en organisatie nauwkeurig te kwantificeren over meerdere lengteschalen heeft de vooruitgang belemmerd. Dit werk biedt een gedetailleerde beschrijving van de muriene dissectie, en bloc kleuring, monsterverwerking en correlatieve beeldvormingsprocedures voor het weergeven van de hartklep op verschillende lengteschalen. Hydrostatische transvalvulaire druk werd gebruikt om de temporele heterogeniteit te beheersen door de hartklepconformatie chemisch te bevestigen. Micro-computertomografie (μCT) werd gebruikt om de geometrie van de hartklep te bevestigen en een referentie te geven voor de downstream monsterverwerking die nodig is voor de seriële blokkoping elektronenmicroscopie (SBF-SEM). Seriële SEM-beelden met hoge resolutie van de extracellulaire matrix (ECM) werden genomen en gereconstrueerd om een lokale 3D-weergave van de organisatie te bieden. μCT- en SBF-SEM-beeldvormingsmethoden werden vervolgens gecorreleerd om de ruimtelijke variatie over de longklep te overwinnen. Hoewel het gepresenteerde werk uitsluitend op de longklep is, kan deze methodologie worden gebruikt voor het beschrijven van de hiërarchische organisatie in biologische systemen en is cruciaal voor de structurele karakterisering over meerdere lengteschalen.
Introduction
De longklep (PV) dient om eenrichtingsbloeding tussen de rechterventrikel en de longslagader te garanderen. Longklepmisvormingen worden geassocieerd met verschillende vormen van aangeboren hartaandoeningen. De huidige behandeling voor aangeboren hartklepziekte (HVD) is valvulaire reparatie of klepvervanging, die meerdere invasieve operaties gedurende de hele levensduur van een patiënt kan vereisen1. Het is algemeen aanvaard dat de functie van de hartklep is afgeleid van de structuur, vaak aangeduid als de structuur-functie correleren. Meer specifiek bepalen de geometrische en biomechanische eigenschappen van het hart zijn functie. De mechanische eigenschappen worden op hun beurt bepaald door de samenstelling en organisatie van de ECM. Door een methode te ontwikkelen voor het bepalen van de biomechanische eigenschappen van muriene hartkleppen, kunnen transgene diermodellen worden gebruikt om de rol van het ECM op de hartklepfunctie en disfunctie2,3,4,5te ondervragen.
Het muriene diermodel wordt al lang beschouwd als de standaard voor moleculaire studies omdat transgene modellen gemakkelijker beschikbaar zijn bij muizen in vergelijking met andere soorten. Murine transgene modellen bieden een veelzijdig platform voor het onderzoeken van hartklep-gerelateerde ziekten6. De chirurgische expertise en instrumentatievereisten om zowel de geometrie als de ECM-organisatie te karakteriseren, zijn echter een belangrijke hindernis geweest bij het voortgang van HVD-onderzoek. Hstologische gegevens in de literatuur geven een beeld van het extracellulaire matrixgehalte van de muriene hartklep, maar alleen in de vorm van 2D-afbeeldingen, en kunnen de 3D-architectuur7,8niet beschrijven . Bovendien is de hartklep zowel ruimtelijk als tijdelijk heterogeen, waardoor het moeilijk is om conclusies te trekken over experimenten met betrekking tot ECM-organisatie als de bemonstering en exterieur niet vastliggen. Conventionele 3D-karakteriseringsmethoden, zoals MRI of 3D-echocardiografie, bieden niet de resolutie die nodig is om ECM-componenten9,10op te lossen .
Dit werk beschrijft een volledig correlatieve workflow waarbij de temporele heterogeniteit als gevolg van de hartcyclus werd aangepakt door de conformatie van de muriene PV met hydrostatische transvalvulaire druk vast te stellen. De ruimtelijke heterogeniteit werd nauwkeurig gecontroleerd door bemonsteringsgebieden van belang en het registreren van datasets van verschillende beeldvormende modaliteiten, met name μCT en seriële blok gezichtsscan elektronenmicroscopie, over verschillende lengteschalen. Deze methode van scouting met μCT voor het begeleiden van downstreambemonstering is eerder voorgesteld, maar omdat de longklep temporele variatie vertoont, was een extra niveau van controle nodig op chirurgisch niveau11.
In vivo studies die muriene hartklepbiomechanica beschrijven, zijn schaars en vertrouwen in plaats daarvan op rekenmodellen bij het beschrijven van het vervormingsgedrag. Het is van cruciaal belang dat lokale extracellulaire gegevens op de nanometerlengteschaal verband houden met de geometrie en locatie van de hartklep. Dit biedt op zijn beurt kwantificeerbare, ruimtelijk in kaart gebrachte distributies van mechanisch bijdragende ECM-eiwitten, die kunnen worden gebruikt om bestaande biomechanische hartklepmodellen12,13,14te versterken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het gebruik van dieren in deze studie was in overeenstemming met de landelijke commissie voor de verzorging en het gebruik van dieren in het Kinderziekenhuis volgens protocol AR13-00030.
1. Pulmonale klep excisie
- Autoclaaf de benodigde tools die nodig zijn voor de muisdissectie. Dit omvat fijne scharen, micro-forceps, micro vasculaire klemmen, klem aanbrengende tang, microneedle houders, veerschaar en oprolmechanismen.
- Acclimatiseren alle muizen gedurende minimaal 2 weken voor de operatie. Verwijder C57BL/6 muizen, ongeveer 1 jaar oud, uit hun kooien en weeg, euthanaseer vervolgens met een ketamine/xylazine cocktail (3:1 ketamine:xylazine, 0,01 ml per g) overdosis.
- Plaats de muis in een dorsale lighouding op een lade en zet de ledematen vast met tape. Eenmaal vastgezet, voert u de thoracotomie uit.
- Stel het hart bloot door overtollig vetweefsel en fascia te verwijderen.
- Verwijder het rechter atrium en doordrenk door de linkerventrikel met zoutoplossing op kamertemperatuur (0,9% NaCl). De perfusie moet ongeveer 20 ml over 30 s duren. Dit resulteert in de exsanguinatie van de muis.
- Verwijder het hele hart door de superieure vena cava, inferieure vena cava, longslagader en aorta door te breken. Speciale zorg moet worden genomen voor de longslagader. Snijd ongeveer 2 mm boven de ventriculo-arteriële verbinding, omdat dit zal dienen als de buis voor druk.
- Verwijder de linker- en rechterventrikel om de kamers bloot te stellen aan atmosferische druk. Zorg ervoor dat de structuur van de longstam niet wordt aangetast door het verwijderen van de ventrikels.
2. Drukfixatie van longklep
- Anastomose drukslang met longslagader, waardoor ongeveer 1 mm afstand tussen de sino-tubulaire verbinding en het einde van de slang overblijft om grote bewegingen van de folders en de longstam mogelijk te maken.
- Verhef het reservoir tot een analoge fysiologische druk en vul het met de zoutoplossing. Test het doorstroomsysteem om er zeker van te zijn dat er geen verstoppingen of luchtbellen zijn.
- Bevestig een kraan aan de anastomosed longklep en zorg voor voldoende doorstroming door de slang (d.w.z. geen luchtbellen) door het uitstroomkanaal te schakelen. Zodra de stroom voldoende is, schakelt u de uitstroom naar de anastomosed longklep en zorgt u voor druk van de longstam. Dit wordt geïdentificeerd door pulmonale rompopstand.
- Zodra de druk van de longstam is bevestigd, moet geleidelijk primaire fixatieve oplossing (1,25% glutaraldehyde, 1,0% paraformaldehyde in cacodylaat van 0,15 M) worden opgenomen totdat de zoutoplossing is gezuiverd. Dit wordt gedaan door een deel, ongeveer 25% van de reservoircapaciteit, van de zoutoplossing te verwijderen en te vervangen door het primaire fixatieve.
LET OP: De gebruikte fixatsmiddelen (paraformaldehyde en glutaraldehyde) zijn zeer giftig en om de veiligheid te garanderen, moeten geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) worden gedragen. - Plaats een fixatief gedrenkt gaas over het weefselmonster om uitdroging te voorkomen.
- Doorlaat het fixatief gedurende 3 uur en vul het reservoir indien nodig bij om een constante druk te behouden. Tijdens de fixatie is het niet ongewoon dat de longklep krimpt vanwege de chemische fixatie. Als dit het geval is, vult u het reservoir voortdurend aan met primair fixatief om fysiologische druk te behouden.
- Bewaar de hartklep in de fixatieve oplossing bij 4 °C tot gebruik. Monsters werden maximaal 1 week bewaard zonder enig waarneembaar verschil.
3. En bloc monsterkleuring en inbedding15,16
LET OP: De kleuringsreagentia die in deze rubriek worden gebruikt (kaliumferrocyanide, osmiumtetroxide, thiocarbohydrazide, loodaspartaat en uranylacetaat) zijn zeer giftig en moeten met uiterste zorg worden behandeld. Het gebruik van een afzuigkap en een goede PBM wordt geadviseerd.
- Kleuring
- Was het monster van de vaste hartklep gedurende 5 minuten met een koude cacodylaatbuffer van 0,15 M. Herhaal de was nog twee keer.
- Dompel de hartklep volledig onder in een oplossing van 1,5% kaliumferrocyanide, 0,15 M cacodylaat, 2 mM calciumchloride en 2% osmiumtetroxide, gedurende 1 uur op ijs.
- Bereid tijdens het incuberen thiocarbohydrazide (TCH)-oplossing door 0,1 g TCH op te lossen in 10 ml ddH2O. Plaats de oplossing gedurende 1 uur in een oven van 60 °C. Roer voorzichtig regelmatig om ervoor te zorgen dat TCH volledig is opgelost. Filtreer de oplossing vlak voor gebruik door een spuitfilter van 0,22 μm.
- Was de monsters met kamertemperatuur ddH 2 O door ze gedurende5minuten in een buis van ddH2O te plaatsen en licht te roeren door de container te schudden. Herhaal dit proces drie keer.
- Plaats het in gefilterde TCH-oplossing gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Voer de wasstap drie keer (elk 5 min) uit met kamertemperatuur ddH2O zoals beschreven in stap 3.1.4.
- Als u klaar bent, plaatst u het monster gedurende 30 minuten op kamertemperatuur in 2% osmiumtetroxide. Was het vervolgens opnieuw gedurende in totaal drie keer gedurende 5 minuten elk met kamertemperatuur ddH2O.
- Incubeer het monster in 1% uranylacetaat 's nachts bij 4 °C.
- Maak gedurende deze tijd een oplossing van 0,066 g loodnitraat in 10 ml asparaginezuurvoorraadoplossing. Stel de pH in op 5,5 met 1 N KOH. Plaats de oplossing in een oven van 60 °C om loodnitraat op te lossen.
- Voer na de nachtelijke incubatie de wasstap uit zoals beschreven in stap 3.1.4. Herhaal dit drie keer. Incubeer vervolgens het hartklepweefsel in lood aspartaatoplossing vanaf stap 3.1.8 in een oven van 60 °C gedurende 30 minuten.
- Dehydratie
- Was de tissues 5 min op kamertemperatuur met ddH2O. Herhaal dit driemaal.
- Maak verse oplossingen van 20%, 50%, 70%, 90% en 100% ethanol in ddH2O. Houd op ijs tot gebruik.
- Om het hartklepweefsel uit te drogen. Voer daaropvolgende behandelingen uit van 20%, 50%, 70% en 90% ethanol op ijs gedurende elk 5 minuten. Voer vervolgens twee daaropvolgende behandelingen van 100% ethanol op ijs gedurende 5 minuten uit.
- Verplaats het weefsel gedurende 10 minuten naar ijskoud aceton. Plaats vervolgens 10 minuten verse aceton op kamertemperatuur.
- Insluiten
- Maak het harsmengsel (zie tabel met materialen)volgens de specificaties van de fabrikant: 11,4 g component A, 10 g component B, 0,3 g component C en 0,05-0,1 g component D. Meng in eerste instantie de componenten A en B door elk van de componenten te verwarmen tot 60 °C voordat u de componenten C en D toevoegt. Het mengsel verandert in een amberkleur bij het toevoegen van componenten C en D. Het zal uniform zijn wanneer het goed wordt gemengd.
- Maak mengsels met volumeverhoudingen van 25:75, 50:50 en 75:25 hars:aceton. Meng.
- Plaats weefsels in volgende behandelingen van het 25:75, 50:50 en 75:25 hars:acetonmengsel gedurende elk 2 uur bij kamertemperatuur.
- Plaats weefsels 's nachts in 100% hars bij kamertemperatuur.
- Plaats de volgende dag weefsels in verse 100% hars gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
- Breng de hartklepweefsels over naar een inbeddingscapsule, vervang ze door verse 100% hars en plaats ze 48 uur in een oven van 60 °C om uit te harden.
- Voer correlatieve beeldvorming uit zoals hieronder wordt weergegeven.
4. Micro-computertomografie beeldvorming
- Monteer het harsmonsterblok met een lijm (lijm of dubbelzijdige tape werkt goed) op een μCT-monsterhouder.
- Plaats de houder in een μCT-kamer en bevestig deze op het podium door de spantang zodanig te schroeven dat er geen beweging van de houder is. Voorbeeldbeweging tijdens de scan vermindert de beeldkwaliteit.
- Open de μCT-gebruikersinterface door op het pictogram te dubbelklikken. Voeg een project toe door het + -teken naast Projecten te selecteren en de benodigde velden in te vullen.
- Zodra dit is gemaakt, zoekt u het gemaakte project en selecteert u het door erop te klikken. Hiermee wordt een tweede kolom Acquisitiesgeopend . Selecteer de + naast Aanwinsten en vul de benodigde velden in.
- Sluit de kamerdeuren en bewapen het systeem door op de bewapeningsknop op het voorpaneel of de μCT te drukken. Maak röntgenfoto's van de gebruikersinterface door de knop te selecteren die opWarmingaangeeft .
OPMERKING: Het systeem schakelt de röntgenfoto's automatisch uit na een succesvolle opwarmprocedure. Schakel röntgenfoto's in door de knop te selecteren. - Pas de podiumrotatie zo aan dat het middelpunt van de rotatie van het monster niet afwijkt van het midden van de monitor (d.w.z. het monster bevindt zich binnen het gezichtsveld voor de hele scan). Voor het systeem dat voor dit experiment wordt gebruikt, houdt dit in dat de fase van de regio van belang (ROI) wordt aangepast onder het vervolgkeuzetabblad zoals hieronder beschreven.
- Stel de instelling van de ROI-fase in door de rotatiehoek op 0° in te stellen en de rand van het monster te markeren. Het monster wordt vervolgens 180° gedraaid en de rand van het monster wordt opnieuw gemarkeerd.
- Pas de x-aspositie van de ROI-fase zo aan dat de rand van het monster zich tussen deze twee uitersten bevindt. Herhaal dit proces voor rotatiehoeken van 90° en 270° voor de y-stand.
- In het geval dat de rotatie van het monster ervoor zorgt dat de randen uit het gezichtsveld bewegen, vermindert u de vergroting van de μCT-behoeften totdat de randen van het monster zichtbaar zijn onder de hierboven ingestelde hoeken en een grove ROI-faseaanpassing kan worden uitgevoerd.
- Eenmaal aangepast bij de onderste vergroting, verplaatst u het monster of de detector om de vergroting te verhogen en kunnen de ROI-posities nauwkeurig worden aangepast.
OPMERKING: Dit proces moet mogelijk worden herhaald om de uitlijning te garanderen. Een juiste uitlijning resulteert in een monster dat weinig tot geen horizontale beweging door alle rotatiehoeken van het monster laat zien.
- Pas de μCT aan op de gewenste scanparameters met behulp van de software van de fabrikant. Deze parameters omvatten buispotentiaal, buisstroom, detectorafstand, monsterafstand, belichtingstijd, traject en het aantal projecties (zie tabel S1 voor de μCT-acquisitieparameters die in dit onderzoek worden gebruikt).
OPMERKING: Kalibratieparameters, zoals duidelijke veld- en donkere veldscans, moeten volgens de specificaties van de fabrikant worden bewaard, tenzij anders vermeld. Als een monster bijvoorbeeld te groot is en het systeem het monster niet uit de veldweergave kan verplaatsen, moet het monster worden verwijderd om duidelijke veldkalibratiescans uit te voeren. - Zodra de parameters zijn ingesteld, kan een benadering van de duur van de scan worden gezien door op de knop Tijdschatting te drukken. Selecteer de startknop om de scan te starten.
- Zorg er na afloop van de scan voor dat de röntgenfoto's zijn uitgeschakeld, schroef de spantang los en verwijder het monster voorzichtig uit de μCT-kamer.
5. Monsterverwerking en beeldcorrelatie
- Reconstrueer μCT-projecties met behulp van een gefilterd projectiealgoritme met de software van de fabrikant (zie tabel met materialen).
- Selecteer het tabblad Recon boven aan het scherm. Selecteer het tabblad Project en acquisitie.
- Selecteer de recon-sjabloon die is gekoppeld aan de teruggefilterde projectie. Druk op de knop Recon starten.
- Identificeer en segmenteer de longklep met behulp van beeldverwerkingssoftware. Dit vereist voorkennis van de anatomie van de longklep17. Bij verhoogde arteriële druk coapt en blokkeert de blaadjes het lumen van de longklep.
- Identificeer de snijrichting ten opzichte van de scanrichting en het monster. Heroriënteer het monster zodanig dat de snijrichting is uitgelijnd met de gewenste as.
- Identificeer regio's die van belang zijn voor beeldvorming met hoge resolutie. In dit experiment werd gekozen voor de buik (midden) van de folder en de arterio-valvulaire kruising.
- Verwijder de overtollige hars en het monster door scheermesje of schuren voor grote stukken materiaal, of door microtome voor fijnere stukken.
- Eenmaal op een locatie van belang, vergelijkt u het fysieke monster met virtuele μCT-segmenten om de locatie te bevestigen. Dit werd gedaan door anatomische kenmerken aan de doorsnede te vergelijken.
6. Seriële blok gezicht scannen elektronenmicroscopie18
- Verklein de doorsnede van het monster voor SBF-SEM, ongeveer 2,0 x 1,5 x 1,8 mm.
- Monteer het bijgesneden monster met epoxy op de SBF-SEM aluminium stomp.
- Bedek het monsterblok met 35 nm goud. Draai het monster op het platform om een gelijkmatige laag coating aan te brengen.
- Ontlucht de SBF-SEM-kamer en stel de hoogte van het mes in op de eucentrische hoogte van de microscoop.
- Plaats het monster en breng de monsterstub waterpas.
- Afbeelding onder lage vacuümomstandigheden om opladen te voorkomen en met backscatterdetector (zie tabel S2 voor SBF-SEM acquisitieparameters).
- Afbeelding en steek meerdere gebieden van belang bij verschillende vergrotingen met behulp van geautomatiseerde software (zie tabel met materialen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anastomose van de longslagader naar de drukslang is weergegeven in figuur 1A. Na het toepassen van hydrostatische druk distent de longstam radiaal (figuur 1B) wat aangeeft dat de longklepbijsluiters zich in een gesloten configuratie bevinden. Longklepconformatie werd bevestigd door μCT. In dit geval waren de bijsluiters coapt (gesloten) en was de annulus circulair (figuur 2A). Figuur 2B,C toont verschillende gradaties van ontoereikende druk op de longklep door fixatie (Figuur 2B) of arteriële instorting ( Figuur2C).
Het bijsnijden van het monsterblok werd geleid door de μCT-volumeweergave. In dit geval werd het vlak parallel aan de sino-tubulaire verbinding gekozen als snijrichting. Met behulp van anatomische oriëntatiepunten werd het μCT-volume dat virtuele doorsneden weer geeft gecorreleerd met optische afbeeldingen (figuur 3) om de snijrichting en locatie te bevestigen.
Zodra het specimenblok op de gewenste locatie en oriëntatie was, werden SBF-SEM-afbeeldingen met hoge resolutie gemaakt in een lokale regio in een folder. Er werd een beeldcorrelatie uitgevoerd tussen het virtuele segment μCT-volumeweergave(figuur 4A),SBF-SEM-afbeeldingen met lage resolutie(figuur 4B)en SBF-SEM-afbeeldingen met hoge resolutie (figuur 4C). Vanwege de handmatige monstermontage waren de vereiste segmenten van het monsterblok nodig om een vlak oppervlak te creëren voordat afbeeldingen in de SBF-SEM werden verkregen; vandaar de verschillende locaties tussen figuur 3 en figuur 4.
Een volledige beeldcorrelatie tussen μCT- en SBF-SEM-datasets is te zien in Video 1. Het longklepmonster in de μCT-volumeweergave is gemakkelijk te onderscheiden van de omringende inbeddingshars vanwege de kleuring van zware metaalatomen. Lengtes en hoeken worden gemeten in de afbeelding om het snijden te begeleiden. In dit voorbeeld werd het vlak parallel aan de sino-tubulaire verbinding gebruikt. Een virtueel segment door emuleert de verwijdering van het materiaal totdat de diepte van interesse is bereikt. Hoge resolutie foto's gemaakt door SBF-SEM werden genomen op deze doorsnede en geregistreerd op de μCT dataset.
Eenmaal verworven, kunnen beelden met hoge resolutie die door SBF-SEM zijn gemaakt, in een beeldprocessor worden geïmporteerd en worden gecompileerd in een 3D-weergave (figuur 5) waar extracellulaire componenten kunnen worden geïdentificeerd.
Figuur 1: Representatieve afbeeldingen van anastomosed longstam. De verwijderde longstam (A) vóór en (B) na hydrostatische druk. De stippellijn geeft de ventriculo-arteriële verbinding aan waar de annulus van de longstam zich bevindt. Let op de uitzetting van de longstam bij druk. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Representatief μCT volumeweergave longklep. (A) De longklep bevindt zich in een gesloten positie met de blaadjes voldoende uitgerekt en coapt (cirkel). (B,C) Onvoldoende druk op de longklep. Merk op dat de bijsluiters niet goed coapt (B) zijn en dat de annulus niet circulair is (C). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Beeldcorrelatie van longklepmonsterblok. (A) μCT volume rendering virtuele slice en (B) fysieke specimen blok na trimmen genomen door optische microscopie. Delen van longklepfolders zijn rood omcirkeld en werden gebruikt als oriëntatiepunten om de twee verschillende beeldvormingsmethoden te correleren. Schaalbalk komt overeen met 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Beeldcorrelatie van afgebeelde longklepdoorsnede. (A) Virtuele doorsnede gegenereerd door μCT volume rendering. Rood vak geeft het gebied aan dat is afgebeeld met SBF-SEM in (B). (B) Overzichtsafbeeldingen met lage resolutie om te correleren met een μCT-doorsnede. Blauw vak vertegenwoordigt de locatie van (C) SBF-SEM-beeldvorming met hoge resolutie. Schaalbalken komen overeen met (B) 100 μm en (C) 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Gesegmenteerd gebied van de longklep genomen door SBF-SEM. Dwarsdoorsnedebeelden werden gestapeld en gecompileerd om een 3D-weergave van een lokaal longklepgebied te vormen. Labels werden toegewezen aan endotheelcellen (groen), valvulaire interstitiële cellen (blauw) en extracellulaire vezels (geel). De geschatte afmetingen van het afgebeelde gebied zijn 30 μm x 20 μm x 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Buispotentiaal | 70 kV |
| Buisstroom | 75 μA |
| Scherpstelmodus | M |
| Baan | Rondschrijven |
| Projecties/Revolutie | 2880 |
| Wijze | 3040 x 3040 px |
| Gemiddeld | 1 |
| Belichtingstijd | 1,0 s |
| Sample-to-gun afstand | 15 mm |
| Detector-to-gun afstand | 725 mm |
| Voxel maat | 2,9 μm |
| Gezichtsveld | 8,4 x 8,4 x 6,3 mm |
Tabel S1: Beeldparameters voor μCT.
| De energie van de landing | 2 - 2,5 kV |
| De stroom van de straal | 100 - 400 pA |
| Werkafstand | 6,5 - 7 mm |
| Detector | VS-DBS |
| Stilstaan bij de tijd | 1 - 2 μs |
Tabel S2: Beeldparameters voor SBF-SEM.
Video 1: Beeldcorrectie van μCT- en SBF-SEM-datasets. Klik hier om deze Video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verwijdering van de ventrikels dient twee doeleinden. Ten eerste, het blootstellen van de ventrikelzijde aan de atmosferische druk, waardoor alleen een transvalvulaire druk van de arteriële kant van de longklep hoeft te worden uitgeoefend om te sluiten, en ten tweede, het verstrekken van een stabiele basis om verdraaiing van de longstam te voorkomen. Tijdens drukopzetting disteneert de longstam radiaal en inferieur, waardoor deze gevoelig is voor verdraaiing, waardoor de longstam instort. Het voorladen van de longklep met een zoutoplossing biedt een extra kwaliteitscontrole om ervoor te zorgen dat de druk voldoende is en of er lekken in het systeem zijn. De werking van het primaire fixatieve is snel, in de orde van een paar seconden, en zonder hydrostatische voorbelasting met de zoutoplossing, wordt de longklep in een willekeurige conformatie bevestigd. Zonder voorbelasting lag het slagingspercentage voor een gesloten longklep rond de 10%-20%. Met de voorlaadstap lag het slagingspercentage boven de 90%.
De beeldvormingsomstandigheden μCT en SBF-SEM werden afgestemd op deze toepassing. De longklep kan, wanneer volledig uitgerekt, minder dan 10 μm dik zijn. Als vuistregel geldt dat een drempel van 3 voxels vereist is om een functie op te kunnen lossen; zo werden de μCT-volumeweergaven gescand met een voxelgrootte van 2,9 μm met een gezichtsveld van 8,4 x 8,4 x 6,3 mm. Kleinere voxelgroottes kunnen worden bereikt in μCT, maar dit vereist het bijsnijden van monsters en/of langere scantijden. Een kleiner monster zou een hogere resolutie mogelijk maken door het dichter bij de röntgenbron te plaatsen. Kleinere voxels kunnen ook worden bereikt door de röntgendetector verder terug van het monster te plaatsen; dit vermindert echter de totale flux op de detector en brengt de signaal-ruisverhouding in gevaar. Als referentie waren onze μCT-scans ongeveer 5-6 uur in duur. Specifieke beeldvormingsvoorwaarden die in deze studie worden gebruikt, zijn in aanvullende tabel S1 en aanvullende tabel S2).
Er zijn beperkingen aan deze methode. Het chirurgische deel van deze procedure vereist expertise in het hanteren van dieren om de longklepstructuur tijdens de behandeling niet in gevaar te brengen. Bovendien is de beeldvorming tijdsintensief en vereist het meerdere beeldvormingsinstrumenten. Als referentie was de SBF-SEM-beeldvorming met hoge resolutie ongeveer 1 week continue beeldvorming voor een diepte van ongeveer 100 μm. Dit is een veeleisende taak voor het instrument om stabiel en consistent te blijven voor lange beeldvormingssessies. Een meer praktische aanpak zou zijn om een bemonsteringsstrategie te ontwikkelen om de heterogeniteit van de longklep nauwkeurig weer te geven zonder de tijdsinvestering. Dit moet nog worden vastgesteld. Tot op heden is de volledige correlatieve workflow op één muis uitgevoerd, maar heeft de haalbaarheid en het potentieel van de correlatieve workflow aangetoond bij het onderzoeken van de longklep over lengteschalen.
Toekomstige iteraties van deze correlatieve benadering kunnen in situ μCT-experimenten omvatten, zodat hetzelfde monster kan worden blootgesteld aan verschillende transvalvulaire druk om variatie tussen monsters te verwijderen. Dit wordt momenteel beperkt door de stabiliteit van het monster en het instrument voor langere scantijden, een drukapparaat dat is geïntegreerd in beeldvormingssystemen en contrast als gevolg van vergelijkbare dempingscoëfficiënten van water en weefsel. Bovendien, hoewel de transvalvulaire druk de fysiologische omstandigheden weerspiegelde, is het niet representatief voor de pulsatile stroom die kenmerkend is voor hartcontractie. Het is echter aangetoond dat de belastingsgraad weinig effect heeft op de bevleesdheid van de bijsluiter. In toekomstige iteraties kan het relevanter blijken om een apparaat te ontwerpen dat in staat is om pulsatile stroom te beheren9. Bovendien vereist veel van het werk handmatige ondervraging van het monster, omdat er momenteel geen geautomatiseerde workflow is. Het lokaliseren van de longklep, monsterverwerking naar het interessegebied, beeldcorrelatie en registratie werden handmatig gedaan, maar zouden in de toekomst nuttig blijken om de verwerking te stroomlijnen en subjectiviteit te verminderen.
Het gepresenteerde werk is een correlatieve workflow voor het fixeren van de conformatie van de longklep en het registreren van beeldvorming in μCT en SBF-SEM. De informatie die met deze methode wordt verkregen, zal uiteindelijk worden gebruikt om de onderliggende biomechanica van de longklep te bepalen in muriene diermodellen, die nog moeten worden opgehelderd. Valvulaire biomechanica kan volledig worden beschreven door zijn geometrie en extracellulaire matrix, maar deze zijn op twee verschillende lengteschalen. Om dit te doen, is nauwkeurige controle van de heterogeniteit van de klep en nauwkeurige mapping van hoge resolutie beelden van de extracellulaire matrix met betrekking tot de locatie in de longklep nodig. Deze correlatieve workflow wordt al geïmplementeerd in andere experimenten om vergelijkingen te maken tussen wilde en transgene osteogenesis imperfecta muizen om fibrillaire extracellulaire matrixverschillen te vergelijken en kan gemakkelijk worden geëxtrapoleerd naar andere aangeboren afwijkingen zoals bicuspide klepvorming19,20. Deze informatie in combinatie met mogelijke proteomics zal een volledig beeld geven van hoe de biomechanica zal verschillen tussen de twee muriene diermodellen.
Ondanks dit werk dat alleen de longklep weergeeft, is deze workflow gemakkelijk te wijzigen in andere heterogene, hiërarchische biologische systemen. We gebruikten 3D-beeldvormingstechnieken om de architecturale organisatie van de ECM vast te leggen, maar technieken met een hogere resolutie, zoals transmissie-elektronenmicroscopie of scanningtransmissie-elektronenmicroscopie, kunnen worden toegevoegd afhankelijk van de gewenste informatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door R01HL139796 en R01HL128847 subsidies aan CKB en RO1DE028297 en CBET1608058 voor DWM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25% glutaraldehyde (aq) | EMS | 16210 | Primary fixative component |
| 0.9% sodium chloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 200 proof ethanol | EMS | 15055 | |
| 22G needle | BD | 305156 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. | MX5311L | |
| 4% osmium tetroxide | EMS | 19150 | Staining component |
| 4% paraformaldehyde (aq) | EMS | 157-4-100 | Primary fixative component |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| Acetone | EMS | 10012 | |
| Black polyamide monofilament suture, 10-0 | AROSurgical instruments Corporation | TI38402 | |
| Black polyamide monofilament suture, 6-0 | AROSurgical instruments Corporation | SN-1956 | |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | 664 | Approximately 1 yo |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Clamp applying forcep | FST | 00072-14 | |
| Cotton tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dumont #5 forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Dumont #7 fine forcep | FST | 11274-20 | |
| Durcupan ACM resin | EMS | 14040 | For embedding |
| Fine scissor | FST | 14028-10 | |
| Heliscan microCT | Thermo Fisher Scientific | Micro-CT | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| L-aspartic acid | Sigma-Aldrich | 56-84-8 | Staining component |
| Lead nitrate | EMS | 17900 | Staining component |
| low-vacuum backscatter detector | Thermo Fisher Scientific | VSDBS | SEM backscatter detector |
| Micro-adson forcep | FST | 11018-12 | |
| Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile | EMD Millipore | SLGP033NS | |
| Non-woven songes | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | Staining component |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| Pressure monitor line | Smiths Medical ASD, Inc. | MX562 | |
| Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| Size 3 BEEM capsule | EMS | 69910-01 | Embedding container |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-99-3 | Buffer |
| Solibri retractors | FST | 17000-04 | |
| Sputter, carbon and e-beam coater | Leica | EM ACE600 | Gold coater |
| Surgical microscope | Leica | M80 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | EMS | 21900 | Staining component |
| Tish needle holder/forcep | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Staining component |
| Volumescope scanning electron microscope | Thermo Fisher Scientific | VOLUMESCOPESEM | Serial Block Face Scanning Electron Microscope |
| Xylazine sterile solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 |
References
- Azari, S., et al. A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease. Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).
- Ng, C. M., et al. TGF-β-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome. Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).
- Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).
- Jiménez-Altayó, F., et al. Stenosis coexists with compromised α1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome. Scientific Reports. 10 (1), 889 (2020).
- Thacoor, A. Mitral valve prolapse and Marfan syndrome. Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).
- McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -C., Hastings, K., Dawson, H. A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes. The Minipig in Biomedical Research. , CRC Press. (2011).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Hinton, R. B., et al. Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).
- Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
- Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. Heart valve function: a biomechanical perspective. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).
- Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
- Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure. Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).
- Ayoub, S., et al. Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology. Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).
- Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet. Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).
- Korn, E. D., Weisman, R. A. I. loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Hinton, R. B., et al. Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).
- Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development. Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).
- Hamatani, Y., et al. Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation. PLoS One. 11 (8), (2016).
