التصوير البصري بالمنظار لقلب الفأر بالكامل
Summary
نبلغ عن طريقة لإعادة البناء الميزوسكوبي لقلب الفأر بالكامل من خلال الجمع بين التطورات الجديدة في تحويل الأنسجة وتلطيخها مع تطوير مجهر ورقة ضوئية ممسوحة محوريا.
Abstract
يمكن أن تسبب كل من أمراض القلب الوراثية وغير الوراثية عمليات إعادة تشكيل شديدة في القلب. يمكن أن تؤثر إعادة البناء الهيكلي ، مثل ترسب الكولاجين (التليف) والاختلال الخلوي ، على التوصيل الكهربائي ، وإدخال اختلالات كهروميكانيكية ، وفي النهاية تؤدي إلى عدم انتظام ضربات القلب. تستند النماذج التنبؤية الحالية لهذه التعديلات الوظيفية إلى معلومات هيكلية غير متكاملة ومنخفضة الدقة. يعد وضع هذا الإطار على ترتيب مختلف من حيث الحجم أمرا صعبا بسبب عدم فعالية طرق التصوير القياسية في إجراء تصوير عالي الدقة في الأنسجة الضخمة. في هذا العمل ، نصف إطارا منهجيا يسمح بتصوير قلوب الفئران بأكملها بدقة ميكرومترية. وقد تطلب تحقيق هذا الهدف جهدا تقنيا حيث تم الجمع بين التقدم في تحويل الأنسجة وطرق التصوير. أولا ، نصف بروتوكول CLARITY المحسن القادر على تحويل القلب السليم إلى شكل نانوي مسامي ، مهجن هيدروجيل ، خالي من الدهون يسمح بشفافية عالية وتلطيخ عميق. بعد ذلك ، يتم وصف مجهر ورقة ضوئية مضان قادر على الحصول بسرعة على صور لمجال رؤية ميزوسكوبي (مقياس مم) بدقة مقياس ميكرون. بعد مشروع mesoSPIM ، يسمح المجهر المصمم بإعادة بناء قلب الفأر بالكامل بدقة ميكرومترية في مسح مقطعي واحد. نعتقد أن هذا الإطار المنهجي سيسمح بتوضيح تورط فوضى العمارة الخلوية في الاختلالات الكهربائية ويمهد الطريق لنموذج شامل يأخذ في الاعتبار كل من البيانات الوظيفية والهيكلية ، مما يتيح تحقيقا موحدا للأسباب الهيكلية التي تؤدي إلى تغييرات كهربائية وميكانيكية بعد إعادة تشكيل الأنسجة.
Introduction
يمكن أن تؤثر إعادة البناء الهيكلي المرتبطة بأمراض القلب على التوصيل الكهربائي وإدخال اختلالات كهروميكانيكية للجهاز 1,2. عادة ما تستخدم الأساليب الحالية المستخدمة للتنبؤ بالتغيرات الوظيفية التصوير بالرنين المغناطيسي و DT-MRI للحصول على إعادة بناء شاملة لترسب التليف وشجرة الأوعية الدموية وتوزيع الألياف للقلب ، ويتم استخدامها لنمذجة مسارات انتشار إمكانات العمل التفضيلي (APP) عبر العضو 3,4. يمكن أن توفر هذه الاستراتيجيات نظرة عامة جميلة على تنظيم القلب. ومع ذلك ، فإن دقتها المكانية غير كافية للتحقيق في تأثير إعادة البناء الهيكلي على وظيفة القلب على المستوى الخلوي.
إن وضع هذا الإطار في ترتيب مختلف من حيث الحجم ، حيث يمكن للخلايا المفردة أن تلعب أدوارا فردية في انتشار جهد الفعل ، يمثل تحديا. القيد الرئيسي هو عدم كفاءة طرق التصوير القياسية لأداء تصوير عالي الدقة (دقة ميكرومترية) في الأنسجة الضخمة (بحجم السنتيمتر). في الواقع ، تصوير الأنسجة البيولوجية في 3D بدقة عالية أمر معقد للغاية بسبب عتامة الأنسجة. الطريقة الأكثر شيوعا لإجراء إعادة بناء 3D في الأعضاء بأكملها هي إعداد أقسام رقيقة. ومع ذلك ، فإن التقسيم الدقيق والتجميع والتصوير يتطلب جهدا ووقتا كبيرين. النهج البديل الذي لا يتطلب قطع العينة هو توليد نسيج شفاف. خلال السنوات الأخيرة ، تم اقتراح عدة منهجيات لتوضيح الأنسجة5،6،7،8. تم تحقيق التحدي المتمثل في إنتاج أنسجة ضخمة وشفافة وموسومة بالفلورسنت مؤخرا من خلال تطوير مناهج تحويل الأنسجة الحقيقية (CLARITY9 ، SHIELD10). على وجه الخصوص ، تعتمد طريقة CLARITY على تحويل الأنسجة السليمة إلى شكل نانوي مسامي ، مهجن هيدروجيل ، خال من الدهون يمكن من منح شفافية عالية عن طريق الإزالة الانتقائية لطبقات الدهون الغشائية المزدوجة. والجدير بالذكر أن هذه الطريقة قد وجدت ناجحة أيضا في إعداد القلب11،12،13،14. ومع ذلك ، نظرا لأن القلب هش للغاية بحيث لا يكون مناسبا للمقاصة النشطة ، فيجب تطهيره باستخدام النهج السلبي ، والذي يتطلب وقتا طويلا لمنح الشفافية الكاملة.
بالاقتران مع تقنيات التصوير المتقدمة مثل الفحص المجهري للصفائح الضوئية ، فإن CLARITY لديه القدرة على تصوير أنسجة القلب الضخمة 3D بدقة ميكرومترية. في الفحص المجهري للورقة الضوئية ، يتم إجراء إضاءة العينة باستخدام ورقة رقيقة من الضوء محصورة في المستوى البؤري لهدف الكشف. يتم جمع انبعاث التألق على طول محور عمودي على مستوى الإضاءة15. تشبه بنية الكشف الفحص المجهري واسع المجال ، مما يجعل الاستحواذ أسرع بكثير من مجاهر المسح بالليزر. يسمح نقل العينة عبر ورقة الضوء بالحصول على تصوير مقطعي كامل للعينات الكبيرة ، حتى عينات بحجم سنتيمتر. ومع ذلك ، نظرا للخصائص الجوهرية لحزمة Gaussian ، من الممكن الحصول على ورقة ضوئية رقيقة جدا (بترتيب بضعة ميكرونات) فقط لامتداد مكاني محدود ، مما يحد بشكل كبير من مجال الرؤية (FoV). في الآونة الأخيرة ، تم تقديم مخطط إثارة جديد للتغلب على هذا القيد وتطبيقه على تصوير الدماغ ، مما يسمح بإعادة البناء ثلاثي الأبعاد بدقة16.
في هذه الورقة ، يتم تقديم نهج المقاصة السلبية ، مما يتيح تقليل كبير في توقيت المقاصة الذي يحتاجه بروتوكول CLARITY. يسمح الإطار المنهجي الموصوف هنا بإعادة بناء قلب فأر كامل بدقة ميكرومترية في مسح مقطعي واحد مع وقت اكتساب في حدود الدقائق.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا العمل ، تم تقديم نهج ناجح لمسح وصبغ وصورة قلب فأر كامل بدقة عالية. أولا ، تم تحسين بروتوكول تحويل الأنسجة (CLARITY) وتنفيذه ، وتم تعديله قليلا لتطبيقه على أنسجة القلب. في الواقع ، للحصول على إعادة بناء فعالة في 3D من القلب كله ، من الضروري منع ظاهرة تشتت الضوء. تسمح لنا منهجية CLARITY بالحصول ع?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تلقى هذا المشروع تمويلا من برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية المنحة رقم 952166 (REPAIR) ، MUR في إطار برنامج FISR ، مشروع FISR2019_00320 ومنطقة توسكانا ، باندو ريسركا تحية 2018 ، مشروع PERCARE.
Materials
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
Referências
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling. Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).
- Finocchiaro, G., et al. Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death. EP Europace. 2, 1-11 (2021).
- Bishop, M. J., et al. Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).
- Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation. IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106, 369-387 (2020).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist’s perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Park, Y. G., et al. Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).
- Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).
- Pianca, N., et al. Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery. The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).
- Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).
- Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative – open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5, 9808 (2015).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).
- Yi, F., et al. Microvessel prediction in H&E stained pathology images using fully convolutional neural networks. BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).
