전체 마우스 심장의 메조스코픽 광학 이미징
Summary
우리는 조직 변형 및 염색의 새로운 발전과 축 방향 스캔 라이트 시트 현미경의 개발을 결합하여 전체 마우스 심장의 메조스코픽 재구성 방법을 보고합니다.
Abstract
유전 적 및 비 유전 적 심장 질환 모두 심장에 심각한 리모델링 과정을 일으킬 수 있습니다. 콜라겐 침착 (섬유증) 및 세포 정렬 불량과 같은 구조적 리모델링은 전기 전도에 영향을 미치고 전기 기계적 기능 장애를 유발하며 결국 부정맥을 유발할 수 있습니다. 이러한 기능 변경에 대한 현재 예측 모델은 통합되지 않은 저해상도 구조 정보를 기반으로 합니다. 이 프레임워크를 다른 규모의 배열에 배치하는 것은 대규모 조직에서 고해상도 이미징을 수행하는 데 있어 표준 이미징 방법의 비효율성으로 인해 어렵습니다. 이 작업에서는 마이크로 메트릭 해상도로 전체 마우스 심장을 이미징 할 수있는 방법 론적 프레임 워크를 설명합니다. 이 목표를 달성하려면 조직 변형과 이미징 방법의 발전이 결합 된 기술적 노력이 필요했습니다. 먼저, 온전한 심장을 높은 투명성과 깊은 염색을 허용하는 나노다공성, 하이드로겔 하이브리드화, 지질이 없는 형태로 변환할 수 있는 최적화된 CLARITY 프로토콜을 설명합니다. 이어서, 미크론 스케일 해상도로 메조스코픽 시야(mm-scale)의 이미지를 신속하게 획득할 수 있는 형광 광시트 현미경이 설명된다. mesoSPIM 프로젝트에 따라 고안된 현미경을 사용하면 단일 단층 촬영 스캔에서 마이크로 메트릭 해상도로 전체 마우스 심장을 재구성 할 수 있습니다. 우리는이 방법 론적 프레임 워크가 전기 기능 장애에서 세포 구조 혼란의 개입을 명확히하고 기능적 및 구조적 데이터를 모두 고려한 포괄적 인 모델을위한 길을 열어 조직 리모델링 후 전기적 및 기계적 변화로 이어지는 구조적 원인에 대한 통합 조사를 가능하게한다고 믿습니다.
Introduction
심장 질환과 관련된 구조적 리모델링은 전기 전도에 영향을 미치고 장기 1,2의 전기 기계적 기능 장애를 유발할 수 있습니다. 기능적 변화를 예측하는 데 사용되는 현재의 접근법은 일반적으로 MRI 및 DT-MRI를 사용하여 섬유증 침착, 혈관 트리 및 심장의 섬유 분포의 전반적인 재구성을 얻으며 장기 3,4를 가로 지르는 우선 활동 전위 전파 (APP) 경로를 모델링하는 데 사용됩니다. 이러한 전략은 심장 조직에 대한 아름다운 개요를 제공 할 수 있습니다. 그러나 공간 해상도는 세포 수준에서 심장 기능에 대한 구조적 리모델링의 영향을 조사하기에 충분하지 않습니다.
이 프레임워크를 단일 세포가 활동 전위 전파에서 개별 역할을 할 수 있는 다른 크기의 순서로 배치하는 것은 어려운 일입니다. 주요 한계는 거대한(센티미터 크기) 조직에서 고해상도 이미징(마이크로메트릭 해상도)을 수행하는 표준 이미징 방법의 비효율성입니다. 사실, 고해상도로 3D로 생물학적 조직을 이미징하는 것은 조직 불투명으로 인해 매우 복잡합니다. 전체 장기에서 3D 재구성을 수행하는 가장 일반적인 방법은 얇은 섹션을 준비하는 것입니다. 그러나 정밀한 절편, 조립 및 이미징에는 상당한 노력과 시간이 필요합니다. 샘플 절단을 요구하지 않는 대안적인 접근법은 투명한 조직을 생성하는 것입니다. 지난 몇 년 동안 조직을 명확히하기위한 몇 가지 방법론이 제안되었습니다 5,6,7,8. 거대하고 투명하며 형광 표지된 조직을 생산하는 과제는 최근 진정한 조직 변형 접근법(CLARITY9, SHIELD10)을 개발함으로써 달성되었습니다. 특히, CLARITY 방법은 손상되지 않은 조직을 막 지질 이중층의 선택적 제거에 의해 높은 투명성을 부여 할 수있는 나노 다공성, 하이드로 겔 혼성화, 지질이없는 형태로 변형시키는 것을 기반으로합니다. 특히,이 방법은 심장 준비11,12,13,14에서도 성공적으로 발견되었습니다. 그러나 심장은 너무 약해서 능동적 인 청소에 적합하지 않기 때문에 완전한 투명성을 부여하는 데 오랜 시간이 필요한 수동적 접근 방식을 사용하여 제거해야합니다.
라이트 시트 현미경과 같은 고급 이미징 기술과 결합된 CLARITY는 3D의 거대한 심장 조직을 마이크로메트릭 해상도로 이미징할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 라이트 시트 현미경에서 샘플의 조명은 검출 대물렌즈의 초점면에 제한된 얇은 라이트 시트로 수행됩니다. 형광 방출은 조명면(15)에 수직인 축을 따라 수집된다. 검출 아키텍처는 광시야 현미경과 유사하여 레이저 스캐닝 현미경보다 훨씬 빠르게 획득할 수 있습니다. 라이트 시트를 통해 샘플을 이동하면 최대 센티미터 크기의 샘플에 대한 큰 표본의 완전한 단층 촬영을 얻을 수 있습니다. 그러나 가우스 빔의 고유 특성으로 인해 제한된 공간 확장에 대해서만 매우 얇은 (수 미크론 정도의) 라이트 시트를 얻을 수 있으므로 시야 (FoV)가 크게 제한됩니다. 최근에는 이러한 한계를 극복하기 위해 새로운 여기 방식이 도입되어 뇌 영상에 적용되어 등방성 분해능16으로 3D 재구성이 가능합니다.
이 백서에서는 CLARITY 프로토콜에 필요한 청산 시기를 크게 줄일 수 있는 수동 청산 접근 방식을 제시합니다. 여기에 설명된 방법론적 프레임워크를 사용하면 단일 단층 촬영 스캔에서 마이크로메트릭 해상도로 전체 마우스 심장을 재구성할 수 있으며 획득 시간은 몇 분 정도입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 작업에서는 고해상도로 전체 마우스 심장을 지우고, 염색하고, 이미지화하는 성공적인 접근 방식이 도입되었습니다. 먼저, 조직 변형 프로토콜 (CLARITY)을 최적화하고 수행했으며, 심장 조직에 적용하기 위해 약간 수정했습니다. 실제로, 전체 심장의 3D로 효율적인 재구성을 얻으려면 광산란 현상을 방지하는 것이 필수적입니다. CLARITY 방법론을 사용하면 매우 투명한 온전한 심장을 얻을 수 있지…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 보조금 계약 No 952166 (REPAIR), FISR 프로그램에 따른 MUR, 프로젝트 FISR2019_00320 및 Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, PERCARE 프로젝트에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램에서 자금을 지원 받았습니다.
Materials
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
Referências
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