Mesoscopische optische beeldvorming van het hele muizenhart
Summary
We rapporteren een methode voor mesoscopische reconstructie van het hele muizenhart door nieuwe ontwikkelingen in weefseltransformatie en kleuring te combineren met de ontwikkeling van een axiaal gescande lichtplaatmicroscoop.
Abstract
Zowel genetische als niet-genetische hartaandoeningen kunnen ernstige remodelleringsprocessen in het hart veroorzaken. Structurele remodellering, zoals collageenafzetting (fibrose) en cellulaire uitlijning, kan de elektrische geleiding beïnvloeden, elektromechanische disfuncties introduceren en uiteindelijk leiden tot aritmie. De huidige voorspellende modellen van deze functionele veranderingen zijn gebaseerd op niet-geïntegreerde structurele informatie met een lage resolutie. Het plaatsen van dit raamwerk op een andere orde van grootte is een uitdaging vanwege de inefficiëntie van standaard beeldvormingsmethoden bij het uitvoeren van beeldvorming met hoge resolutie in massief weefsel. In dit werk beschrijven we een methodologisch raamwerk dat beeldvorming van hele muizenharten met micrometrische resolutie mogelijk maakt. Het bereiken van dit doel heeft een technologische inspanning vereist waarbij vooruitgang in weefseltransformatie en beeldvormingsmethoden zijn gecombineerd. Ten eerste beschrijven we een geoptimaliseerd CLARITY-protocol dat in staat is om een intact hart te transformeren in een nanoporeuze, hydrogel-gehybridiseerde, lipidenvrije vorm die een hoge transparantie en diepe kleuring mogelijk maakt. Vervolgens wordt een fluorescentie lichtplaatmicroscoop beschreven die in staat is om snel beelden te verkrijgen van een mesoscopisch gezichtsveld (mm-schaal) met de resolutie op micronschaal. In navolging van het mesoSPIM-project maakt de bedachte microscoop de reconstructie van het hele muizenhart met micrometrische resolutie in een enkele tomografische scan mogelijk. Wij geloven dat dit methodologische kader het mogelijk zal maken om de betrokkenheid van de cytoarchitectuur-wanorde in de elektrische disfuncties te verduidelijken en de weg vrij te maken voor een uitgebreid model dat zowel de functionele als structurele gegevens beschouwt, waardoor een uniform onderzoek mogelijk wordt naar de structurele oorzaken die leiden tot elektrische en mechanische veranderingen na de weefselremodellering.
Introduction
Structurele remodellering geassocieerd met hartaandoeningen kan de elektrische geleiding beïnvloeden en elektromechanische disfuncties van het orgaan introduceren 1,2. Huidige benaderingen die worden gebruikt om functionele veranderingen te voorspellen, maken vaak gebruik van MRI en DT-MRI om een algehele reconstructie van fibroseafzetting, vasculaire boom en vezelverdeling van het hart te verkrijgen, en ze worden gebruikt om preferentiële actiepotentiaalvoortplanting (APP) -paden over het orgaan te modelleren 3,4. Deze strategieën kunnen een mooi overzicht geven van de hartorganisatie. Hun ruimtelijke resolutie is echter onvoldoende om de impact van structurele remodellering op de hartfunctie op cellulair niveau te onderzoeken.
Het plaatsen van dit raamwerk in een andere orde van grootte, waar afzonderlijke cellen individuele rollen kunnen spelen bij de verspreiding van actiepotentialen, is een uitdaging. De belangrijkste beperking is de inefficiëntie van standaard beeldvormingsmethoden om beeldvorming met hoge resolutie (micrometrische resolutie) uit te voeren in massieve (centimetergrote) weefsels. In feite is het afbeelden van biologische weefsels in 3D met hoge resolutie erg ingewikkeld vanwege weefselondoorzichtigheid. De meest gebruikelijke aanpak om 3D-reconstructies in hele organen uit te voeren, is het voorbereiden van dunne secties. Nauwkeurige secties, assemblage en beeldvorming vereisen echter aanzienlijke inspanning en tijd. Een alternatieve aanpak die niet vereist dat het monster wordt gesneden, is het genereren van een transparant weefsel. In de afgelopen jaren zijn verschillende methoden voor het ophelderen van weefsels voorgesteld 5,6,7,8. De uitdaging om massieve, transparante en fluorescerend gelabelde weefsels te produceren, is onlangs bereikt door echte weefseltransformatiebenaderingen te ontwikkelen (CLARITY9, SHIELD10). In het bijzonder is de CLARITY-methode gebaseerd op de transformatie van een intact weefsel in een nanoporeuze, hydrogel-gehybridiseerde, lipidevrije vorm die het mogelijk maakt om hoge transparantie te verlenen door de selectieve verwijdering van membraanlipide-bilayers. Opmerkelijk is dat deze methode ook succesvol is gebleken bij hartvoorbereiding 11,12,13,14. Omdat het hart echter te kwetsbaar is om geschikt te zijn voor een actieve opruiming, moet het worden geklaard met behulp van de passieve benadering, die veel tijd nodig heeft om volledige transparantie te verlenen.
In combinatie met geavanceerde beeldvormingstechnieken zoals light-sheet microscopie, heeft CLARITY het potentieel om 3D massieve hartweefsels met micrometrische resolutie in beeld te brengen. Bij lichtplaatmicroscopie wordt de verlichting van het monster uitgevoerd met een dunne vellen licht die zijn opgesloten in het brandpuntsvlak van het detectieobjectief. De fluorescentie-emissie wordt verzameld langs een as loodrecht op het verlichtingsvlak15. De detectiearchitectuur is vergelijkbaar met widefield-microscopie, waardoor de acquisitie veel sneller is dan laserscanmicroscopen. Door het monster door het lichtblad te verplaatsen, kan een volledige tomografie van grote monsters worden verkregen, tot centimeters groot. Vanwege de intrinsieke eigenschappen van de Gaussische bundel is het echter mogelijk om een zeer dunne (in de orde van enkele micron) lichtplaat alleen voor een beperkte ruimtelijke uitbreiding te verkrijgen, waardoor het gezichtsveld (FoV) drastisch wordt beperkt. Onlangs is een nieuw excitatieschema geïntroduceerd om deze beperking te overwinnen en toegepast voor beeldvorming van de hersenen, waardoor 3D-reconstructies met isotrope resolutie16 mogelijk zijn.
In dit document wordt een passieve clearingbenadering gepresenteerd, waardoor de clearingtiming die nodig is voor het CLARITY-protocol aanzienlijk kan worden verminderd. Het hier beschreven methodologische raamwerk maakt het mogelijk om een heel muizenhart met micrometrische resolutie te reconstrueren in een enkele tomografische scan met een acquisitietijd in de orde van minuten.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit werk werd een succesvolle aanpak geïntroduceerd om een heel muizenhart op hoge resolutie te zuiveren, te beitsen en in beeld te brengen. Eerst werd een weefseltransformatieprotocol (CLARITY) geoptimaliseerd en uitgevoerd, enigszins aangepast voor de toepassing ervan op het hartweefsel. Inderdaad, om een efficiënte reconstructie in 3D van een heel hart te verkrijgen, is het essentieel om het fenomeen van lichtverstrooiing te voorkomen. De CLARITY-methodologie stelt ons in staat om een zeer transparant intact hart…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project heeft financiering ontvangen van het Horizon 2020-onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie onder subsidieovereenkomst nr. 952166 (REPAIR), MUR in het kader van het FISR-programma, project FISR2019_00320 en Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, PERCARE-project.
Materials
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
Referências
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling. Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).
- Finocchiaro, G., et al. Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death. EP Europace. 2, 1-11 (2021).
- Bishop, M. J., et al. Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).
- Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation. IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106, 369-387 (2020).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist’s perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Park, Y. G., et al. Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).
- Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).
- Pianca, N., et al. Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery. The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).
- Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).
- Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative – open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5, 9808 (2015).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).
- Yi, F., et al. Microvessel prediction in H&E stained pathology images using fully convolutional neural networks. BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).
