Imagerie optique mésoscopique du cœur entier de souris
Summary
Nous rapportons une méthode de reconstruction mésoscopique de l’ensemble du cœur de souris en combinant de nouvelles avancées dans la transformation tissulaire et la coloration avec le développement d’un microscope à feuille de lumière à balayage axial.
Abstract
Les maladies cardiaques génétiques et non génétiques peuvent provoquer de graves processus de remodelage dans le cœur. Le remodelage structurel, tel que le dépôt de collagène (fibrose) et le désalignement cellulaire, peut affecter la conduction électrique, introduire des dysfonctionnements électromécaniques et, éventuellement, conduire à une arythmie. Les modèles prédictifs actuels de ces altérations fonctionnelles sont basés sur des informations structurelles non intégrées et à faible résolution. Il est difficile de placer ce cadre dans un ordre de grandeur différent en raison de l’inefficacité des méthodes d’imagerie standard pour effectuer une imagerie à haute résolution dans des tissus massifs. Dans ce travail, nous décrivons un cadre méthodologique qui permet l’imagerie de cœurs de souris entiers avec une résolution micrométrique. La réalisation de cet objectif a nécessité un effort technologique où les progrès de la transformation tissulaire et des méthodes d’imagerie ont été combinés. Tout d’abord, nous décrivons un protocole CLARITY optimisé capable de transformer un cœur intact en une forme nanoporeuse, hybride d’hydrogel, sans lipides qui permet une transparence élevée et une coloration profonde. Ensuite, un microscope à feuille de lumière à fluorescence capable d’acquérir rapidement des images d’un champ de vision mésoscopique (échelle mm) avec une résolution à l’échelle du micron est décrit. Suite au projet mesoSPIM, le microscope conçu permet la reconstruction de l’ensemble du cœur de souris avec une résolution micrométrique en un seul balayage tomographique. Nous pensons que ce cadre méthodologique permettra de clarifier l’implication du désarroi de la cytoarchitecture dans les dysfonctionnements électriques et d’ouvrir la voie à un modèle complet qui prend en compte à la fois les données fonctionnelles et structurelles, permettant ainsi une étude unifiée des causes structurelles qui conduisent à des altérations électriques et mécaniques après le remodelage tissulaire.
Introduction
Le remodelage structurel associé aux maladies cardiaques peut affecter la conduction électrique et introduire des dysfonctionnements électromécaniques de l’organe 1,2. Les approches actuelles utilisées pour prédire les altérations fonctionnelles utilisent couramment l’IRM et l’IRM-DT pour obtenir une reconstruction globale du dépôt de fibrose, de l’arbre vasculaire et de la distribution des fibres du cœur, et elles sont utilisées pour modéliser les voies de propagation du potentiel d’action préférentielle (APP) à travers l’organe 3,4. Ces stratégies peuvent fournir un bel aperçu de l’organisation du cœur. Cependant, leur résolution spatiale est insuffisante pour étudier l’impact du remodelage structurel sur la fonction cardiaque au niveau cellulaire.
Il est difficile de placer ce cadre à un ordre de grandeur différent, où des cellules individuelles peuvent jouer des rôles individuels dans la propagation du potentiel d’action. La principale limitation est l’inefficacité des méthodes d’imagerie standard pour effectuer une imagerie à haute résolution (résolution micrométrique) dans des tissus massifs (de la taille d’un centimètre). En fait, l’imagerie de tissus biologiques en 3D à haute résolution est très compliquée en raison de l’opacité des tissus. L’approche la plus courante pour effectuer des reconstructions 3D dans des organes entiers consiste à préparer des sections minces. Cependant, un sectionnement, un assemblage et une imagerie précis nécessitent beaucoup d’efforts et de temps. Une approche alternative qui ne nécessite pas de couper l’échantillon consiste à générer un tissu transparent. Au cours des dernières années, plusieurs méthodologies de clarification des tissus ont été proposées 5,6,7,8. Le défi de produire des tissus massifs, transparents et marqués par fluorescence a récemment été relevé en développant de véritables approches de transformation tissulaire (CLARITY9, SHIELD10). En particulier, la méthode CLARITY est basée sur la transformation d’un tissu intact en une forme nanoporeuse, hybride hydrogel, sans lipides qui permet de conférer une grande transparence par l’élimination sélective des bicouches lipidiques membranaires. Notamment, cette méthode s’est avérée efficace également dans la préparation cardiaque11,12,13,14. Cependant, comme le cœur est trop fragile pour convenir à une clairière active, il doit être dégagé en utilisant l’approche passive, qui nécessite beaucoup de temps pour conférer une transparence complète.
En combinaison avec des techniques d’imagerie avancées telles que la microscopie à feuille de lumière, CLARITY a le potentiel d’imager en 3D des tissus cardiaques massifs à une résolution micrométrique. En microscopie à feuille de lumière, l’éclairage de l’échantillon est réalisé avec une fine feuille de lumière confinée dans le plan focal de l’objectif de détection. L’émission de fluorescence est recueillie le long d’un axe perpendiculaire au plan d’éclairage15. L’architecture de détection est similaire à la microscopie à grand champ, ce qui rend l’acquisition beaucoup plus rapide que les microscopes à balayage laser. Le déplacement de l’échantillon à travers la feuille lumineuse permet d’obtenir une tomographie complète de grands spécimens, jusqu’à des échantillons de la taille d’un centimètre. Cependant, en raison des propriétés intrinsèques du faisceau gaussien, il est possible d’obtenir une feuille de lumière très mince (de l’ordre de quelques microns) uniquement pour une extension spatiale limitée, limitant ainsi drastiquement le champ de vision (FoV). Récemment, un nouveau schéma d’excitation a été introduit pour surmonter cette limitation et appliqué à l’imagerie cérébrale, permettant des reconstructions 3D avec une résolution isotrope16.
Dans ce document, une approche de compensation passive est présentée, permettant une réduction significative du délai de compensation requis par le protocole Clarity. Le cadre méthodologique décrit ici permet de reconstruire un cœur entier de souris avec une résolution micrométrique en un seul balayage tomographique avec un temps d’acquisition de l’ordre de quelques minutes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce travail, une approche réussie pour nettoyer, colorer et imager un cœur de souris entier à haute résolution a été introduite. Tout d’abord, un protocole de transformation tissulaire (CLARITY) a été optimisé et réalisé, légèrement modifié pour son application sur le tissu cardiaque. En effet, pour obtenir une reconstruction efficace en 3D de tout un cœur, il est indispensable de prévenir le phénomène de diffusion de la lumière. La méthodologie CLARITY nous permet d’obtenir un cœur intact tr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet a reçu des financements du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention n ° 952166 (REPAIR), MUR dans le cadre du programme FISR, projet FISR2019_00320 et Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, projet PERCARE.
Materials
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
Referências
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