Mesoskopische optische Bildgebung des ganzen Mausherzens
Summary
Wir berichten über eine Methode zur mesoskopischen Rekonstruktion des gesamten Mausherzens durch die Kombination neuer Fortschritte in der Gewebetransformation und Färbung mit der Entwicklung eines axial gescannten Lichtblattmikroskops.
Abstract
Sowohl genetische als auch nicht-genetische Herzerkrankungen können schwere Umbauprozesse im Herzen verursachen. Strukturelle Umbauten, wie Kollagenablagerung (Fibrose) und zelluläre Fehlausrichtung, können die elektrische Leitung beeinträchtigen, elektromechanische Funktionsstörungen verursachen und schließlich zu Arrhythmien führen. Aktuelle Vorhersagemodelle dieser funktionellen Veränderungen basieren auf nicht integrierten und niedrig aufgelösten Strukturinformationen. Diesen Rahmen auf eine andere Größenordnung zu legen, ist aufgrund der Unwirksamkeit von Standard-Bildgebungsmethoden bei der Durchführung hochauflösender Bildgebung in massivem Gewebe eine Herausforderung. In dieser Arbeit beschreiben wir einen methodischen Rahmen, der die Abbildung ganzer Mausherzen mit mikrometrischer Auflösung ermöglicht. Die Erreichung dieses Ziels erforderte eine technologische Anstrengung, bei der Fortschritte bei der Gewebetransformation und bildgebenden Verfahren kombiniert wurden. Zunächst beschreiben wir ein optimiertes CLARITY-Protokoll, das in der Lage ist, ein intaktes Herz in eine nanoporöse, hydrogelhybridisierte, lipidfreie Form umzuwandeln, die eine hohe Transparenz und tiefe Färbung ermöglicht. Dann wird ein Fluoreszenz-Lichtblattmikroskop beschrieben, das in der Lage ist, schnell Bilder eines mesoskopischen Sichtfeldes (mm-Skala) mit der Auflösung im Mikrometerbereich aufzunehmen. Im Anschluss an das mesoSPIM-Projekt ermöglicht das konzipierte Mikroskop die Rekonstruktion des gesamten Mausherzens mit mikrometrischer Auflösung in einem einzigen tomographischen Scan. Wir glauben, dass dieser methodische Rahmen es ermöglichen wird, die Beteiligung der Zytoarchitektur an den elektrischen Dysfunktionen zu klären und den Weg für ein umfassendes Modell zu ebnen, das sowohl die funktionellen als auch die strukturellen Daten berücksichtigt und so eine einheitliche Untersuchung der strukturellen Ursachen ermöglicht, die zu elektrischen und mechanischen Veränderungen nach dem Gewebeumbau führen.
Introduction
Strukturumbau im Zusammenhang mit Herzerkrankungen kann die elektrische Leitung beeinträchtigen und elektromechanische Funktionsstörungen des Organs 1,2 verursachen. Aktuelle Ansätze zur Vorhersage funktioneller Veränderungen verwenden häufig MRT und DT-MRT, um eine Gesamtrekonstruktion der Fibroseablagerung, des Gefäßbaums und der Faserverteilung des Herzens zu erhalten, und sie werden verwendet, um APP-Pfade (Preferential Action Potential Propagation) über das Organ 3,4 zu modellieren. Diese Strategien können einen schönen Überblick über die Herzorganisation geben. Ihre räumliche Auflösung reicht jedoch nicht aus, um die Auswirkungen des strukturellen Umbaus auf die Herzfunktion auf zellulärer Ebene zu untersuchen.
Es ist eine Herausforderung, dieses Framework in einer anderen Größenordnung zu platzieren, in der einzelne Zellen individuelle Rollen bei der Ausbreitung des Aktionspotentials spielen können. Die Haupteinschränkung ist die Ineffizienz von Standard-Bildgebungsmethoden zur Durchführung hochauflösender Bildgebung (mikrometrische Auflösung) in massiven (zentimetergroßen) Geweben. Tatsächlich ist die Abbildung biologischer Gewebe in 3D mit hoher Auflösung aufgrund der Undurchsichtigkeit des Gewebes sehr kompliziert. Der gebräuchlichste Ansatz zur Durchführung von 3D-Rekonstruktionen in ganzen Organen ist die Vorbereitung von Dünnschnitten. Präzises Schneiden, Zusammensetzen und Abbilden erfordern jedoch erheblichen Aufwand und Zeit. Ein alternativer Ansatz, bei dem die Probe nicht geschnitten werden muss, besteht darin, ein transparentes Gewebe zu erzeugen. In den letzten Jahren wurden mehrere Methoden zur Klärung von Geweben vorgeschlagen 5,6,7,8. Die Herausforderung, massive, transparente und fluoreszenzmarkierte Gewebe herzustellen, wurde kürzlich durch die Entwicklung echter Gewebetransformationsansätze (CLARITY9, SHIELD10) erreicht. Insbesondere basiert die CLARITY-Methode auf der Umwandlung eines intakten Gewebes in eine nanoporöse, hydrogel-hybridisierte, lipidfreie Form, die es ermöglicht, durch die selektive Entfernung von Membranlipiddoppelschichten eine hohe Transparenz zu verleihen. Bemerkenswerterweise hat sich diese Methode auch in der Herzvorbereitung als erfolgreich erwiesen 11,12,13,14. Da das Herz jedoch zu zerbrechlich ist, um für eine aktive Klärung geeignet zu sein, muss es mit dem passiven Ansatz gereinigt werden, der lange Zeit benötigt, um vollständige Transparenz zu verleihen.
In Kombination mit fortschrittlichen bildgebenden Verfahren wie der Lichtblattmikroskopie hat CLARITY das Potenzial, massives 3D-Herzgewebe mit mikrometrischer Auflösung abzubilden. In der Lichtblattmikroskopie wird die Beleuchtung der Probe mit einer dünnen Lichtschicht durchgeführt, die in der Brennebene des Detektionsobjektivs eingeschlossen ist. Die Fluoreszenzemission wird entlang einer Achse senkrecht zur Beleuchtungsebene15 gesammelt. Die Detektionsarchitektur ähnelt der Weitfeldmikroskopie, wodurch die Erfassung viel schneller ist als bei Laserscanning-Mikroskopen. Das Bewegen der Probe durch die Lichtschicht ermöglicht eine vollständige Tomographie von großen Proben, bis zu zentimetergroßen Proben. Aufgrund der intrinsischen Eigenschaften des Gaußstrahls ist es jedoch möglich, ein sehr dünnes (in der Größenordnung von wenigen Mikrometern) Lichtblatt nur für eine begrenzte räumliche Ausdehnung zu erhalten, wodurch das Sichtfeld (FoV) drastisch eingeschränkt wird. Vor kurzem wurde ein neuartiges Anregungsschema eingeführt, um diese Einschränkung zu überwinden, und für die Bildgebung des Gehirns angewendet, was 3D-Rekonstruktionen mit isotroper Auflösung ermöglicht16.
In diesem Beitrag wird ein passiver Clearingansatz vorgestellt, der eine signifikante Reduzierung des vom CLARITY-Protokoll benötigten Clearing-Timings ermöglicht. Der hier beschriebene methodische Rahmen erlaubt es, ein ganzes Mausherz mit mikrometrischer Auflösung in einem einzigen tomographischen Scan mit einer Erfassungszeit in der Größenordnung von Minuten zu rekonstruieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Arbeit wurde ein erfolgreicher Ansatz vorgestellt, um ein ganzes Mausherz in hoher Auflösung zu klären, zu färben und abzubilden. Zunächst wurde ein Gewebetransformationsprotokoll (CLARITY) optimiert und durchgeführt, leicht modifiziert für seine Anwendung auf das Herzgewebe. Um eine effiziente Rekonstruktion eines ganzen Herzens in 3D zu erhalten, ist es wichtig, das Phänomen der Lichtstreuung zu verhindern. Die CLARITY-Methodik ermöglicht es uns, ein hochtransparentes intaktes Herz zu erhalten, erford…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt erhielt Mittel aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 952166 (REPAIR), MUR im Rahmen des FISR-Programms, Projekt FISR2019_00320 und Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, PERCARE-Projekt.
Materials
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
Referências
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