Mesoskopisk optisk avbildning av hele musehjertet
Summary
Vi rapporterer en metode for mesoskopisk rekonstruksjon av hele musehjertet ved å kombinere nye fremskritt i vevstransformasjon og farging med utvikling av et aksialt skannet lysarkmikroskop.
Abstract
Både genetiske og ikke-genetiske hjertesykdommer kan forårsake alvorlige remodeling prosesser i hjertet. Strukturell ombygging, som kollagenavsetning (fibrose) og cellulær feiljustering, kan påvirke elektrisk ledning, introdusere elektromekaniske dysfunksjoner og til slutt føre til arytmi. Nåværende prediktive modeller av disse funksjonelle endringene er basert på ikke-integrert og lavoppløselig strukturell informasjon. Å plassere dette rammeverket på en annen størrelsesorden er utfordrende på grunn av ineffektiviteten til standard bildebehandlingsmetoder ved å utføre høyoppløselig avbildning i massivt vev. I dette arbeidet beskriver vi et metodologisk rammeverk som tillater avbildning av hele musehjerter med mikrometrisk oppløsning. Oppnåelsen av dette målet har krevd en teknologisk innsats der fremskritt innen vevstransformasjon og avbildningsmetoder har blitt kombinert. Først beskriver vi en optimalisert CLARITY-protokoll som er i stand til å transformere et intakt hjerte til en nanoporøs, hydrogelhybridisert, lipidfri form som gir høy gjennomsiktighet og dyp farging. Deretter beskrives et fluorescenslysmikroskop som raskt kan skaffe bilder av et mesoskopisk synsfelt (mm-skala) med mikronskalaoppløsningen. Etter mesoSPIM-prosjektet tillater det unnfangede mikroskopet rekonstruksjon av hele musehjertet med mikrometrisk oppløsning i en enkelt tomografisk skanning. Vi tror at dette metodologiske rammeverket vil gjøre det mulig å avklare involveringen av cytoarkitektur-uorden i de elektriske dysfunksjonene og bane vei for en omfattende modell som vurderer både funksjonelle og strukturelle data, og dermed muliggjøre en enhetlig undersøkelse av de strukturelle årsakene som fører til elektriske og mekaniske endringer etter vevsremodelleringen.
Introduction
Strukturell ombygging forbundet med hjertesykdommer kan påvirke elektrisk ledning og introdusere elektromekaniske dysfunksjoner av orgelet 1,2. Nåværende tilnærminger som brukes til å forutsi funksjonelle endringer, bruker ofte MR og DT-MR for å oppnå en generell rekonstruksjon av fibroseavsetning, vaskulær tre og fiberfordeling av hjertet, og de brukes til å modellere fortrinnsrett til handlingspotensial forplantning (APP) -baner over orgelet 3,4. Disse strategiene kan gi en vakker oversikt over hjerteorganisasjonen. Imidlertid er deres romlige oppløsning utilstrekkelig til å undersøke virkningen av strukturell ombygging på hjertefunksjonen på mobilnivå.
Å plassere dette rammeverket i en annen størrelsesorden, hvor enkeltceller kan spille individuelle roller på handlingspotensialutbredelse, er utfordrende. Hovedbegrensningen er ineffektiviteten til standard bildebehandlingsmetoder for å utføre høyoppløselig bildebehandling (mikrometrisk oppløsning) i massive (centimeterstore) vev. Faktisk er avbildning av biologisk vev i 3D ved høy oppløsning svært komplisert på grunn av vevs ugjennomsiktighet. Den vanligste tilnærmingen til å utføre 3D-rekonstruksjoner i hele organer er å forberede tynne seksjoner. Presis seksjonering, montering og bildebehandling krever imidlertid betydelig innsats og tid. En alternativ tilnærming som ikke krever kutting av prøven, er å generere et gjennomsiktig vev. I løpet av de siste årene har flere metoder for å avklare vev blitt foreslått 5,6,7,8. Utfordringen med å produsere massivt, gjennomsiktig og fluorescerende merket vev har nylig blitt oppnådd ved å utvikle sanne vevstransformasjonsmetoder (CLARITY9, SHIELD10). Spesielt er CLARITY-metoden basert på transformasjon av et intakt vev til en nanoporøs, hydrogelhybridisert, lipidfri form som gjør det mulig å gi høy gjennomsiktighet ved selektiv fjerning av membranlipid-dobbeltlag. Spesielt har denne metoden blitt funnet vellykket også i hjertepreparasjon11,12,13,14. Men siden hjertet er for skjørt til å være egnet for en aktiv rydding, må det ryddes ved hjelp av passiv tilnærming, noe som krever lang tid å gi fullstendig gjennomsiktighet.
I kombinasjon med avanserte bildebehandlingsteknikker som lysarkmikroskopi, har CLARITY potensialet til å avbilde 3D massive hjertevev ved mikrometrisk oppløsning. Ved lysarkmikroskopi utføres belysningen av prøven med et tynt lysark begrenset i fokusplanet til deteksjonsmålet. Fluorescensutslippet samles langs en akse vinkelrett på belysningsplanet15. Deteksjonsarkitekturen ligner bredfeltsmikroskopi, noe som gjør oppkjøpet mye raskere enn laserskanningsmikroskoper. Ved å flytte prøven gjennom lysarket kan du oppnå en fullstendig tomografi av store prøver, opp til centimeterstore prøver. På grunn av de iboende egenskapene til Gaussian-strålen er det imidlertid mulig å oppnå et veldig tynt (i størrelsesorden noen få mikron) lysark bare for en begrenset romlig utvidelse, og dermed drastisk begrense synsfeltet (FoV). Nylig har en ny eksitasjonsordning blitt introdusert for å overvinne denne begrensningen og søkt om hjerneavbildning, noe som tillater 3d-rekonstruksjoner med isotropisk oppløsning16.
I denne artikkelen presenteres en passiv clearing-tilnærming, noe som muliggjør en betydelig reduksjon av clearingtidspunktet som CLARITY-protokollen trenger. Det metodologiske rammeverket som er beskrevet her, gjør det mulig å rekonstruere et helt musehjerte med mikrometrisk oppløsning i en enkelt tomografisk skanning med en oppkjøpstid i størrelsesorden minutter.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette arbeidet ble en vellykket tilnærming til å fjerne, flekke og avbilde et helt musehjerte i høy oppløsning introdusert. Først ble en vevstransformasjonsprotokoll (CLARITY) optimalisert og utført, litt modifisert for anvendelse på hjertevevet. Faktisk, for å oppnå en effektiv rekonstruksjon i 3D av et helt hjerte, er det viktig å forhindre fenomenet lysspredning. CLARITY-metoden lar oss oppnå et svært gjennomsiktig intakt hjerte, men det krever lange inkubasjonstider når det utføres passivt (ca. 5 mån…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette prosjektet har mottatt finansiering fra EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram under tilskuddsavtale No 952166 (REPAIR), MUR under FISR-programmet, prosjekt FISR2019_00320 og Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, PERCARE-prosjektet.
Materials
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
Referências
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling. Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).
- Finocchiaro, G., et al. Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death. EP Europace. 2, 1-11 (2021).
- Bishop, M. J., et al. Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).
- Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation. IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106, 369-387 (2020).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist’s perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Park, Y. G., et al. Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).
- Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).
- Pianca, N., et al. Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery. The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).
- Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).
- Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative – open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5, 9808 (2015).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).
- Yi, F., et al. Microvessel prediction in H&E stained pathology images using fully convolutional neural networks. BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).
