Mesoskopisk optisk avbildning av hela mushjärtat
Summary
Vi rapporterar en metod för mesoskopisk rekonstruktion av hela mushjärtat genom att kombinera nya framsteg inom vävnadstransformation och färgning med utvecklingen av ett axiellt skannat ljusarkmikroskop.
Abstract
Både genetiska och icke-genetiska hjärtsjukdomar kan orsaka allvarliga ombyggnadsprocesser i hjärtat. Strukturell ombyggnad, såsom kollagenavsättning (fibros) och cellulär felinriktning, kan påverka elektrisk ledning, införa elektromekaniska dysfunktioner och så småningom leda till arytmi. Nuvarande prediktiva modeller av dessa funktionella förändringar är baserade på icke-integrerad och lågupplöst strukturell information. Att placera detta ramverk i en annan storleksordning är utmanande på grund av ineffektiviteten hos standardavbildningsmetoder för att utföra högupplöst avbildning i massiv vävnad. I detta arbete beskriver vi ett metodiskt ramverk som möjliggör avbildning av hela mushjärtan med mikrometrisk upplösning. För att uppnå detta mål har det krävts en teknisk insats där framsteg inom vävnadsomvandling och avbildningsmetoder har kombinerats. Först beskriver vi ett optimerat CLARITY-protokoll som kan omvandla ett intakt hjärta till en nanoporös, hydrogelhybridiserad, lipidfri form som möjliggör hög transparens och djup färgning. Därefter beskrivs ett fluorescensljusarkmikroskop som snabbt kan förvärva bilder av ett mesoskopiskt synfält (mm-skala) med mikronskalans upplösning. Efter mesoSPIM-projektet möjliggör det tänkta mikroskopet rekonstruktion av hela mushjärtat med mikrometrisk upplösning i en enda tomografisk skanning. Vi tror att denna metodologiska ram kommer att göra det möjligt att klargöra involveringen av cytoarkitekturens oordning i de elektriska dysfunktionerna och bana väg för en omfattande modell som tar hänsyn till både funktionella och strukturella data, vilket möjliggör en enhetlig undersökning av de strukturella orsakerna som leder till elektriska och mekaniska förändringar efter vävnadsombyggnad.
Introduction
Strukturell ombyggnad i samband med hjärtsjukdomar kan påverka elektrisk ledning och införa elektromekaniska dysfunktioner i organet 1,2. Nuvarande metoder som används för att förutsäga funktionella förändringar använder vanligtvis MR och DT-MRI för att erhålla en övergripande rekonstruktion av fibrosavsättning, vaskulärt träd och fiberfördelning av hjärtat, och de används för att modellera APP-vägar (Preferential Action Potential Propagation) över organet 3,4. Dessa strategier kan ge en vacker översikt över hjärtorganisationen. Deras rumsliga upplösning är dock otillräcklig för att undersöka effekterna av strukturell ombyggnad på hjärtfunktionen på cellnivå.
Att placera detta ramverk i en annan storleksordning, där enskilda celler kan spela individuella roller på handlingspotentialutbredning, är utmanande. Huvudbegränsningen är ineffektiviteten hos standardavbildningsmetoder för att utföra högupplöst avbildning (mikrometrisk upplösning) i massiva (centimeterstora) vävnader. Faktum är att avbildning av biologiska vävnader i 3D vid hög upplösning är mycket komplicerat på grund av vävnadsogenomskinlighet. Det vanligaste sättet att utföra 3D-rekonstruktioner i hela organ är att förbereda tunna sektioner. Exakt sektionering, montering och avbildning kräver dock betydande ansträngning och tid. Ett alternativt tillvägagångssätt som inte kräver att provet skärs är att generera en transparent vävnad. Under de senaste åren har flera metoder för att klargöra vävnader föreslagits 5,6,7,8. Utmaningen att producera massiva, transparenta och fluorescerande märkta vävnader har nyligen uppnåtts genom att utveckla sanna vävnadstransformationsmetoder (CLARITY9, SHIELD10). I synnerhet är CLARITY-metoden baserad på omvandlingen av en intakt vävnad till en nanoporös, hydrogelhybridiserad, lipidfri form som gör det möjligt att ge hög transparens genom selektivt avlägsnande av membranlipid-dubbelskikt. I synnerhet har denna metod visat sig framgångsrik även i hjärtpreparat11,12,13,14. Men eftersom hjärtat är för bräckligt för att vara lämpligt för en aktiv röjning, måste det rensas med det passiva tillvägagångssättet, vilket kräver lång tid för att ge fullständig transparens.
I kombination med avancerade bildtekniker som ljusarkmikroskopi har CLARITY potential att avbilda massiva 3D-hjärtvävnader med mikrometrisk upplösning. I ljusarkmikroskopi utförs belysningen av provet med ett tunt ljusark begränsat i detektionsmålets fokalplan. Fluorescensemissionen samlas upp längs en axel vinkelrätt mot belysningsplanet15. Detektionsarkitekturen liknar widefieldmikroskopi, vilket gör förvärvet mycket snabbare än laserskanningsmikroskop. Genom att flytta provet genom ljusarket kan man få en fullständig tomografi av stora prover, upp till centimeterstora prover. På grund av de inneboende egenskaperna hos den gaussiska strålen är det emellertid möjligt att erhålla ett mycket tunt (i storleksordningen några mikron) ljusark endast för en begränsad rumslig förlängning, vilket drastiskt begränsar synfältet (FoV). Nyligen har ett nytt excitationsschema introducerats för att övervinna denna begränsning och tillämpas för hjärnavbildning, vilket möjliggör 3d-rekonstruktioner med isotrop upplösning16.
I detta dokument presenteras en passiv clearingmetod som möjliggör en betydande minskning av den clearingtid som krävs enligt CLARITY-protokollet. Den metodologiska ramen som beskrivs här möjliggör rekonstruktion av ett helt mushjärta med mikrometrisk upplösning i en enda tomografisk skanning med en förvärvstid i storleksordningen minuter.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta arbete introducerades ett framgångsrikt tillvägagångssätt för att rensa, fläcka och avbilda ett helt mushjärta med hög upplösning. Först optimerades och utfördes ett vävnadstransformationsprotokoll (CLARITY), något modifierat för dess applicering på hjärtvävnaden. För att få en effektiv rekonstruktion i 3D av ett helt hjärta är det faktiskt viktigt att förhindra fenomenet ljusspridning. CLARITY-metoden gör det möjligt för oss att få ett mycket transparent intakt hjärta, men det kräver …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta projekt har fått finansiering från Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 enligt bidragsavtal nr 952166 (REPAIR), MUR under FISR-programmet, projekt FISR2019_00320 och Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, PERCARE-projektet.
Materials
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
Referências
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling. Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).
- Finocchiaro, G., et al. Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death. EP Europace. 2, 1-11 (2021).
- Bishop, M. J., et al. Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).
- Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation. IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106, 369-387 (2020).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist’s perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Park, Y. G., et al. Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).
- Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).
- Pianca, N., et al. Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery. The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).
- Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).
- Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative – open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5, 9808 (2015).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).
- Yi, F., et al. Microvessel prediction in H&E stained pathology images using fully convolutional neural networks. BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).
