共焦点顕微鏡イメージング解析による細胞外小胞取り込みアッセイ
Summary
細胞外小胞(EV)は細胞生物学と細胞間コミュニケーションに貢献します。細胞の取り込みEVを可視化・定量化するための実用的なアッセイが必要です。現在のプロトコルは、ナノ濾過ベースのマイクロ流体デバイスによるEV単離に続く共焦点顕微鏡 による 3次元蛍光イメージングを利用してEV取り込みアッセイを提案している。
Abstract
細胞の細胞外小胞(EV)の取り込み量を可視化し、定量化するための実用的なアッセイが必要です。EV取り込みは、様々な研究分野における細胞間コミュニケーションの役割を果たしています。がん生物学、神経科学、および薬物送達。多くのEV取り込みアッセイが文献で報告されている。しかし、実用的で詳細な実験方法論が欠けている。EVの取り込み値は、蛍光標識EVにより、細胞内での位置を検出することで評価できます。細胞内の内在化したEVと細胞の表面的なEVを区別することは困難でありながら、EVの取り込み値を正確に決定することは極めて重要です。そこで、3次元(3D)蛍光共焦点顕微鏡を通じてEV取り込みを効率よく定量化するアッセイが提案されている。蛍光標識されたEVは、ナノ濾過ベースの微小流体装置を用いて作製し、3D共焦点顕微鏡で可視化し、高度な画像処理ソフトウェアを用いて解析した。このプロトコルは、細胞レベルでEVを分析するための堅牢な方法論と、効率的な分析のための実用的なアプローチを提供します。
Introduction
細胞外小胞(EV)は、ナノサイズの脂質膜結合粒子で、そのサイズによって分類されます: エクトソーム (100-500 nm) およびエキソソーム (50-150 nm)1.EVには、タンパク質、核酸、脂質など、さまざまな生体分子が含まれています。これらの生体分子は、貨物としてカプセル化される前に細胞から発生し、EV1,2,3を介して細胞外空間に放出されます。
その貨物の多様性により、EVは細胞間通信において積極的な役割を果たすと考えられています。細胞によるEVの放出および取り込みにより、細胞間の生体分子の移動が可能となる4,5.EV貨物をセルに導入すると、受信者細胞の機能やホメオスタティック状態が変われ得る4,5,6.EV は複数の経路を通じて内部化されます。しかし、正確なメカニズムは正確には実証されていません。
遺伝子タグ付けなどのEV取り込みアッセイの大部分は、個々のEV7に蛍光標識を付ける。得られた信号は、マイクロプレート光度計、フローサイトメトリー、または顕微鏡検査によって測定することができ、各技術は大きな制限を有する。マイクロプレートフォトメーター、フローサイトメトリー、または標準的な2次元(2D)顕微鏡では、内部化されたEVsと表面的に取り付けられたEVsを区別できません。さらに、これらの各技術に必要なサンプル調製は、EV取り込み評価に追加の問題を導入する可能性があります。例えば、EV取り込み分析の前にトリプシンで付着した細胞を持ち上げると、表面的に取り付けられたEVが細胞表面10,11に切断されることがあります。トリプシンはまた、細胞表面と相互作用し、細胞およびEV表現型に影響を与える。さらに、トリプシンは表面的なEVを完全に切り離すものではなく、孤立した集団を歪める可能性があります。
蛍光色素でEVに正確にラベルを付けるには、残留色素7を除去するために追加の洗浄工程が必要です。受け入れられた分離技術は、EVの分離中に起こる凝固による偽陽性シグナルにも寄与する可能性がある。例えば、シリアル超遠心分離(UC)は、EVを分離し、固定染め染料を除去するために広く使用されています。しかし、UCはEVを共沈殿させ、残存色素は偽陽性シグナル12,13を引き起こす可能性がある。カラムベースのろ過などの他のナノ濾過方法も、非固定化色素除去にも広く使用されています。カラムマトリックス内で相互作用するEVと色素の複雑な性質により、複雑な入力14,15,16によってカラムの分子カットオフが変化するため、残存染料が不完全に除去される可能性があります。
現在のプロトコルは、蛍光標識された単離されたEVを単離して洗浄するためのナノ濾過ベースのマイクロ流体装置を提案している。ナノ濾過ベースのマイクロ流体デバイスは、流体支援分離技術(FAST)17,18を介して効率的なろ過を提供することができます。FAST はフィルター全体の圧力降下を低減し、EV と色素の間の潜在的な凝集を減らします。残留色素を効率よく除去することで、蛍光標識されたEVの品質とアッセイの特異性を高めることができる。
共焦点顕微鏡は、細胞表面に内部化されたEVと表面的に結合したEVを区別し、時空間的な解像度におけるEV取り込みの細胞機構を包括的に調べることができます19,21,22,23,24,25。例えば、Sungらは、開発された生細胞レポーターを用いてエキソソームライフサイクルの可視化を説明した。3次元(3D)およびポスト画像処理ツール20の共焦点顕微鏡を用いて、内部化されたEVの位置を検出し、解析した。小さなEV(40〜200nm)のサイズは光学顕微鏡の解像度限界を下回っていますが、光検出器は蛍光放射の増強を検出できるため、蛍光標識されたEVは共焦点顕微鏡で検出できます。したがって、細胞内の蛍光標識されたEVの細胞内局在化は、EVおよび周囲の細胞小器官の複数のZ積層画像を取得することによって正確に決定することができる。
さらに、3D再構成とポストデータ処理により、内部化、表面化、自由浮遊型のEVの位置に関するさらなる洞察を得ることができます。これらのプロセスを共焦点顕微鏡で提供するタイムラプスライブセルイメージングと組み合わせることで、EV取り込みのレベルを正確に評価でき、リアルタイムでのEV取り込みの追跡も可能です。また、EVの入稿解析は、細胞内機能に対するインターナライズされたEVの共同局在化を評価することによって、共焦点顕微鏡を用いて行うことができる。本プロトコルは、ナノ濾過ベースのマイクロ流体デバイス17,26、共焦点顕微鏡法、およびポスト画像解析を用いてEV取込アッセイを行う方法論を記述する。
Protocol
Representative Results
Discussion
共焦点顕微鏡による3D蛍光イメージングに基づくEV取込みアッセイは、効率的な方法論と高感度分析を提供します。この蛍光EV標識は、EVの可視化を促進し、正確なEV取り込みアッセイを成功に導きます。EVの標識と残留色素除去のための以前の方法は、超遠心(UC)を使用して沈殿を除去することによって報告されています。しかし、UCはEVを共沈殿させ、固定化された色素は偽陽性シグナ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業はNCI認可のnosによって支えられた。U54CA143803、CA163124、CA093900、およびCA143055からK.J.P.本研究は、韓国保健福祉省(助成番号:HI19C1122)が出資する韓国保健産業開発研究所(KHIDI)を通じた韓国保健技術研究開発プロジェクトの助成金によって支援されました。J.キムとY.-Kによる仕事。韓国政府が出資する基礎科学研究所(IBS-R020-D1)の支援を受けた。著者らは、ブレイディ泌尿器科学研究所の現在および過去のメンバー、特にピエンタ・アメンド研究所のメンバーが原稿の批判的な読書に感謝する。
Materials
| Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353038 | Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | Objective for confocal imaging, NA=1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | Objective for confocal imaging, NA=0.75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | Operation device for Exodisc |
| Exosome-depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection |
| Fetal bovine serum (FBS) | VWR | 1500-500 | Nutrient for cell cultivation |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed | abcam | ab7063 | Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling |
| Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm | Ibidi | 81156 | Culture dish for confocal imaging |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | Post-image processing software |
| Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer | Live Cell Instrument | TU-O-20 | Incubator system for live cell imaging |
| Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera | Nikon | NA | Camera for confocal imaging |
| Nikon Eclipse Ti microscope | Nikon | NA | Inverted microscope for confocal imaging |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Image processing software for Nikon microscope |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | Measurement device for EV concentration |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | Graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotics for cell cultivation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | Cell culture media for PC3 cell line cultivation |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain – 5 mM Solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | RNA staining fluorescent dye for the EV labeling |
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