Test d’absorption des vésicules extracellulaires par analyse d’imagerie au microscope confocal
Summary
Les vésicules extracellulaires (VE) contribuent à la biologie cellulaire et aux communications intercellulaires. Il est nécessaire de réaliser des tests pratiques pour visualiser et quantifier l’absorption des VE par les cellules. Le protocole actuel propose le test d’absorption ev en utilisant l’imagerie de fluorescence tridimensionnelle par microscopie confocale, après l’isolement EV par un dispositif microfluidique basé sur la nanofiltration.
Abstract
Il est nécessaire de réaliser des tests pratiques pour visualiser et quantifier l’absorption des vésicules extracellulaires (VE) des cellules. L’adoption des VE joue un rôle dans la communication intercellulaire dans divers domaines de recherche; biologie du cancer, neurosciences et administration de médicaments. De nombreux tests d’absorption des VE ont été rapportés dans la littérature; cependant, il y a un manque de méthodologie expérimentale pratique et détaillée. L’absorption des VE peut être évaluée en marquant les VE par fluorescence pour détecter leur emplacement dans les cellules. Il est difficile, mais essentiel, de faire la distinction entre les VE internalisés dans les cellules et les VE superficiels sur les cellules pour déterminer avec précision l’absorption des VE. Par conséquent, un test qui quantifie efficacement l’absorption des VE par microscopie confocale à fluorescence tridimensionnelle (3D) est proposé dans ce travail. Les véhicules électriques marqués par fluorescence ont été préparés à l’aide d’un dispositif microfluidique à base de nanofiltration, visualisés par microscopie confocale 3D, puis analysés à l’aide d’un logiciel de traitement d’image avancé. Le protocole fournit une méthodologie robuste pour l’analyse des véhicules électriques au niveau cellulaire et une approche pratique pour une analyse efficace.
Introduction
Les vésicules extracellulaires (VE) sont des particules de taille nanométrique liées à la membrane lipidique qui sont classées en fonction de leur taille : ectosomes (100-500 nm) et exosomes (50-150 nm)1. Les VE contiennent diverses biomolécules, telles que des protéines, des acides nucléiques et des lipides. Ces biomolécules proviennent des cellules avant d’être encapsulées sous forme de cargaison et libérées dans l’espace extracellulaire via les VE1,2,3.
En raison de la variété de leur cargaison, on pense que les véhicules électriques jouent un rôle actif dans la communication intercellulaire. La libération et l’absorption des VE par les cellules permettent le transfert de biomolécules entre les cellules4,5. L’introduction de cargaison de VE dans une cellule peut modifier les fonctions et l’état homéostatique de la cellule réceptrice4,5,6. Les véhicules électriques sont internalisés par de multiples voies; cependant, les mécanismes exacts n’ont pas été démontrés avec précision.
La majorité des tests d’absorption des VE, tels que le marquage génétique, marquent fluorescent les VE individuels7. Le signal résultant peut être mesuré par photomètre à microplaques, cytométrie en flux ou microscopie, chaque technologie ayant des limites substantielles. Les photomètres à microplaques, la cytométrie en flux ou la microscopie bidimensionnelle (2D) standard ne peuvent pas faire la distinction entre les VE internalisés et les VE fixés superficiellement8,9. De plus, la préparation d’échantillons nécessaire pour chacune de ces techniques peut introduire des problèmes supplémentaires dans l’évaluation de l’absorption des VE. Par exemple, soulever des cellules adhérentes avec de la trypsine avant l’analyse de l’absorption des VE peut cliver certains VE fixés superficiellement à la surface de la cellule10,11. La trypsine peut également interagir avec la surface de la cellule, affectant le phénotype cellulaire et EV. De plus, la trypsine peut ne pas détacher complètement les VE superficiels, ce qui fausse les populations isolées.
Pour étiqueter avec précision les véhicules électriques avec des colorants fluorescents, des étapes de lavage supplémentaires sont nécessaires pour éliminer le colorant résiduel7. Les techniques d’isolement acceptées peuvent également contribuer à des signaux faussement positifs dus à la coagulation qui se produit pendant l’isolement EV. Par exemple, l’ultracentrifugation en série (CU) est largement utilisée pour isoler les véhicules électriques et éliminer le colorant immobilisé. Cependant, la CO peut co-précipiter les VE, et le colorant résiduel peut conduire à un signal faussement positif12,13. D’autres méthodes de nanofiltration, telles que la filtration sur colonne, sont également largement utilisées pour l’élimination des colorants non immobilisés. La nature complexe des VE et des colorants interagissant dans la matrice de la colonne peut entraîner l’élimination incomplète du colorant résiduel en raison de la coupure moléculaire de la colonne modifiée par l’entrée complexe14,15,16.
Le protocole actuel propose un dispositif microfluidique à base de nanofiltration pour isoler et laver les véhicules électriques isolés marqués par fluorescence. Le dispositif microfluidique à base de nanofiltration peut fournir une filtration efficace grâce à la technologie de séparation assistée par fluide (FAST)17,18. FAST réduit la perte de charge à travers le filtre, réduisant ainsi l’agrégation potentielle entre les véhicules électriques et les colorants. En éliminant efficacement les colorants résiduels, il est possible d’améliorer la qualité des véhicules électriques marqués par fluorescence et la spécificité du test.
La microscopie confocale permet de distinguer les VE internalisés et superficiellement attachés à la surface de la cellule et d’étudier de manière exhaustive les mécanismes cellulaires de l’absorption des VE dans une résolution spatio-temporelle19,20,21,22,23,24,25. Par exemple, Sung et al. ont décrit la visualisation du cycle de vie des exosomes à l’aide de leur rapporteur de cellules vivantes développé. L’emplacement des VE internalisés a été détecté et analysé à l’aide d’un microscope confocal dans des outils de traitement tridimensionnels (3D) et post-image20. Bien que la taille des petits VE (40-200 nm) soit inférieure à la limite de résolution du microscope optique, les VE marqués par fluorescence peuvent être détectés par microscopie confocale puisque le photodétecteur peut détecter l’émission de fluorescence accrue. Par conséquent, la localisation subcellulaire des VE marqués par fluorescence dans une cellule peut être déterminée avec précision en acquérant plusieurs images empilées en Z des VE et des organites cellulaires environnants.
En outre, la reconstruction 3D et le traitement post-données peuvent fournir des informations supplémentaires sur le positionnement des véhicules électriques internalisés, superficiels et flottants. En utilisant ces processus en conjonction avec l’imagerie accélérée des cellules vivantes offerte par la microscopie confocale, le niveau d’absorption des VE peut être évalué avec précision, et le suivi en temps réel de l’absorption des VE est également possible. En outre, l’analyse du trafic de VE peut être effectuée à l’aide de la microscopie confocale en évaluant la colocalisation des VE avec des organites, une première étape pour déterminer comment les VE internalisés sont impliqués dans la fonction intracellulaire. Ce protocole décrit la méthodologie pour effectuer un test d’absorption ev à l’aide du dispositif microfluidique basé sur la nanofiltration17,26, la microscopie confocale et l’analyse post-image.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un test d’absorption EV basé sur l’imagerie par fluorescence 3D via la microscopie confocale fournit une méthodologie efficace et une analyse sensible. Cet étiquetage fluorescent des VE facilite la visualisation des VE et effectue avec succès un test d’absorption précis des VE. Des méthodes antérieures d’étiquetage des véhicules électriques et d’élimination du colorant résiduel ont été rapportées en éliminant les précipitations à l’aide de l’ultracentrifugation (CU); cependant, la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions du NIC. U54CA143803, CA163124, CA093900 et CA143055 à K. J. P. Cette recherche a été soutenue par une subvention du projet coréen de R&D sur les technologies de la santé par l’intermédiaire de l’Institut coréen de développement de l’industrie de la santé (KHIDI), financé par le ministère de la Santé et du Bien-être de la République de Corée (numéro de subvention : HI19C1122). Œuvre de J. Kim et Y.-K. Cho a été soutenu par l’Institut des sciences fondamentales (IBS-R020-D1), financé par le gouvernement coréen. Les auteurs remercient les membres actuels et passés de l’Institut urologique Brady, en particulier les membres du laboratoire Pienta-Amend, pour la lecture critique du manuscrit.
Materials
| Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353038 | Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | Objective for confocal imaging, NA=1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | Objective for confocal imaging, NA=0.75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | Operation device for Exodisc |
| Exosome-depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection |
| Fetal bovine serum (FBS) | VWR | 1500-500 | Nutrient for cell cultivation |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed | abcam | ab7063 | Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling |
| Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm | Ibidi | 81156 | Culture dish for confocal imaging |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | Post-image processing software |
| Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer | Live Cell Instrument | TU-O-20 | Incubator system for live cell imaging |
| Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera | Nikon | NA | Camera for confocal imaging |
| Nikon Eclipse Ti microscope | Nikon | NA | Inverted microscope for confocal imaging |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Image processing software for Nikon microscope |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | Measurement device for EV concentration |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | Graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotics for cell cultivation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | Cell culture media for PC3 cell line cultivation |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain – 5 mM Solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | RNA staining fluorescent dye for the EV labeling |
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