Konfokal Mikroskop Görüntüleme Analizi ile Hücre Dışı Veziklin Alımı Analizi
Summary
Hücre dışı veziklinler (EV’ ler) hücresel biyolojiye ve hücreler arası iletişime katkıda bulunur. Hücrelerin ALDıĞı EV’leri görselleştirmek ve ölçmek için pratik tahlillere ihtiyaç vardır. Mevcut protokol, nano filtrasyon tabanlı bir mikroakışkan cihaz tarafından EV izolasyonunu takiben konfokal mikroskopi yoluyla üç boyutlu floresan görüntüleme kullanarak EV alma testini önermektedir.
Abstract
Hücrelerin hücre dışı veziklin (EV) alımını görselleştirmek ve ölçmek için pratik tahlillere ihtiyaç vardır. EV alımı, çeşitli araştırma alanlarında hücreler arası iletişimde rol oynar; kanser biyolojisi, sinirbilim ve ilaç dağıtımı. Literatürde birçok EV alım tahlilleri bildirilmiştir; ancak pratik, detaylı deneysel metodoloji eksikliği vardır. EV alımı, hücrelerdeki konumlarını tespit etmek için EV’leri floresan olarak etiketlenerek değerlendirilebilir. Hücrelerdeki içselleştirilmiş EV’ler ile hücrelerdeki yüzeysel EV’ler arasında ayrım yapmak, EV alımını doğru bir şekilde belirlemek zor, ancak kritiktir. Bu nedenle, bu çalışmada üç boyutlu (3D) floresan konfokal mikroskopi ile EV alımını verimli bir şekilde ölçen bir test önermektedir. Floresan etiketli EV’ler nano filtrasyon tabanlı bir mikroakışkan cihaz kullanılarak hazırlandı, 3D konfokal mikroskopi ile görselleştirildi ve daha sonra gelişmiş görüntü işleme yazılımı ile analiz edildi. Protokol, EV’leri hücresel düzeyde analiz etmek için sağlam bir metodoloji ve verimli analiz için pratik bir yaklaşım sağlar.
Introduction
Hücre dışı veziklinler (EV’ler), boyutlarına göre kategorize edilen nano boyutlu, lipid zara bağlı parçacıklardır: ektozomlar (100-500 nm) ve ekzozomlar (50-150 nm)1. EV’ler proteinler, nükleik asitler ve lipitler gibi çeşitli biyomoleküller içerir. Bu biyomoleküller, kargo olarak kapsüllenmeden önce hücrelerden kaynaklanır ve EV’ler aracılığıyla hücre dışı alana salınır1,2,3.
Kargolarının çeşitliliği nedeniyle, EV’lerin hücreler arası iletişimde aktif bir rol oynadığına inanılmaktadır. EV’lerin hücreler tarafından salınması ve alınması, hücreler arasında biyomoleküllerin aktarılmasına izin verir4,5. EV kargosunun bir hücreye girişi alıcı hücrenin işlevlerini ve homeostatik durumunu değiştirebilir4,5,6. EV’ler birden fazla yoldan içselleştirilir; ancak, kesin mekanizmalar doğru bir şekilde gösterilmemiştir.
Ev alma testlerinin çoğunluğu, genetik etiketleme gibi, floresan olarak bireysel EV’leri etiketler7. Elde edilen sinyal mikro plaka fotometresi, akış sitometrisi veya mikroskopi ile ölçülebilir ve her teknolojinin önemli sınırlamaları vardır. Mikro plaka fotometreleri, akış sitometrisi veya standart iki boyutlu (2B) mikroskopi, içselleştirilmiş ve yüzeysel olarak bağlı EV’leri ayırt edemez8,9. Ayrıca, bu tekniklerin her biri için gerekli örnek hazırlama, EV alım değerlendirmesine ek sorunlar getirebilir. Örneğin, EV alım analizinden önce yapışık hücreleri tripsin ile kaldırmak, hücrenin yüzeyinde yüzeysel olarak bağlı bazı EV’leri ayırabilir10,11. Tripsin hücre yüzeyi ile de etkileşime girerek hücre ve EV fenotipini etkileyebilir. Ek olarak, tripsin yüzeysel EV’leri tamamen ayıramayabilir, yalıtılmış popülasyonları eğriltebilir.
EV’leri floresan boyalarla doğru bir şekilde etiketlemek için, artık boyayı çıkarmak için ek yıkama adımları gereklidir7. Kabul edilen izolasyon teknikleri, EV izolasyonu sırasında ortaya çıkan pıhtılaşma nedeniyle yanlış-pozitif sinyallere de katkıda bulunabilir. Örneğin, seri ultrasantrifüjleme (UC), EV’leri izole etmek ve hareketsiz boyayı çıkarmak için yaygın olarak kullanılır. Bununla birlikte, UC EV’leri birlikte çökeltebilir ve artık boya yanlış-pozitif sinyale yol açabilir12,13. Sütun bazlı filtrasyon gibi diğer nano filtrasyon yöntemleri de hareketsiz boya giderme için yaygın olarak kullanılmaktadır. Sütun matrisi içinde etkileşime giren EV’lerin ve boyanın karmaşık doğası, karmaşık giriş14,15,16 tarafından değiştirilen sütunun moleküler kesilmesi nedeniyle artık boyanın eksik çıkarılmasına neden olabilir.
Mevcut protokol, floresan etiketli izole EV’leri izole etmek ve yıkamak için nano filtrasyon tabanlı bir mikroakışkan cihaz önermektedir. Nano filtrasyon tabanlı mikroakışkan cihaz, sıvı destekli ayırma teknolojisi (FAST)17,18 ile verimli filtrasyon sağlayabilir. FAST, filtredeki basınç düşüşünü azaltarak EV’ler ve boyalar arasındaki olası toplamayı azaltır. Artık boyayı verimli bir şekilde kaldırarak, floresan etiketli EV’lerin kalitesini ve testlerin özgüllüğünü artırmak mümkündür.
Konfokal mikroskopi, hücre yüzeyindeki içselleştirilmiş ve yüzeysel olarak bağlı EV’leri ayırt edebilir ve mekansal çözünürlükte EV alımının hücresel mekanizmalarını kapsamlı bir şekilde araştırabilir19,20,21,22,23,24,25. Örneğin, Sung ve arkadaşları, gelişmiş canlı hücre muhabirlerini kullanarak eksozom yaşam döngüsünün görselleştirilmesini tanımladı. İçselleştirilmiş EV’lerin konumu, üç boyutlu (3D) ve görüntü sonrası işleme araçlarında bir konfokal mikroskop kullanılarak tespit edildi ve analiz edildi20. Küçük EV’lerin boyutu (40-200 nm) optik mikroskobun çözünürlük sınırının altında olmasına rağmen, fotodetektör gelişmiş floresan emisyonu tespit edebildiğinden, floresan etiketli EV’ler konfokal mikroskopi ile tespit edilebilir. Bu nedenle, bir hücre içindeki floresan etiketli EV’lerin hücre altı lokalizasyonu, EV’lerin ve çevresindeki hücresel organellerin birden fazla z yığılmış görüntüsü alınarak tam olarak belirlenebilir.
Ayrıca, 3D rekonstrüksiyon ve veri sonrası işleme, içselleştirilmiş, yüzeysel ve serbest yüzen EV’lerin konumlandırılması hakkında daha fazla bilgi sağlayabilir. Bu süreçler konfokal mikroskopinin sunduğu hızlandırılmış canlı hücre görüntülemesi ile birlikte kullanılarak, EV alımı seviyesi tam olarak değerlendirilebilir ve EV alımının gerçek zamanlı takibi de mümkündür. Ayrıca, EV kaçakçılık analizi, EV’lerin hücre içi işlevde nasıl içselleştirildiğini belirlemek için ilk adım olan organellerle birlikte lokalizasyonu değerlendirilerek konfokal mikroskopi kullanılarak yapılabilir. Bu protokol, nano filtrasyon tabanlı mikroakışkan cihaz17,26, konfokal mikroskopi ve görüntü sonrası analiz kullanarak ev alma tahlili yapmak için metodolojiyi açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Konfokal mikroskopi ile 3D floresan görüntülemeye dayalı bir EV alma analizi, etkili bir metodoloji ve hassas analiz sağlar. Bu floresan EV etiketlemesi, EV’lerin görselleştirilmesini kolaylaştırır ve hassas bir EV alma testini başarıyla gerçekleştirir. EV’leri etiketlemek ve artık boyayı çıkarmak için önceki yöntemler, ultracentrifugation (UC) kullanarak yağışı kaldırarak bildirilmiştir; bununla birlikte, UC EV’leri birlikte çökeltebilir ve hareketsiz boya yanlış-pozitif sinyale y…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NCI grant nos tarafından desteklendi. U54CA143803, CA163124, CA093900 ve CA143055 için K. J. P. Bu araştırma, Kore Sağlık Ve Refah Bakanlığı, Kore Cumhuriyeti (hibe numarası: HI19C1122) tarafından finanse edilen Kore Sağlık Endüstrisi Geliştirme Enstitüsü (KHIDI) aracılığıyla Kore Sağlık Teknolojisi Ar-Ge Projesi’nin hibesi ile desteklenmiştir. J. Kim ve Y.-K. tarafından çalışılarak. Cho, Kore Hükümeti tarafından finanse edilen Temel Bilimler Enstitüsü (IBS-R020-D1) tarafından desteklendi. Yazarlar, brady üroloji enstitüsünün mevcut ve geçmiş üyelerine, özellikle Pienta-Amend laboratuvarı üyelerine, makalenin eleştirel okumaları için teşekkür eder.
Materials
| Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353038 | Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | Objective for confocal imaging, NA=1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | Objective for confocal imaging, NA=0.75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | Operation device for Exodisc |
| Exosome-depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection |
| Fetal bovine serum (FBS) | VWR | 1500-500 | Nutrient for cell cultivation |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed | abcam | ab7063 | Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling |
| Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm | Ibidi | 81156 | Culture dish for confocal imaging |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | Post-image processing software |
| Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer | Live Cell Instrument | TU-O-20 | Incubator system for live cell imaging |
| Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera | Nikon | NA | Camera for confocal imaging |
| Nikon Eclipse Ti microscope | Nikon | NA | Inverted microscope for confocal imaging |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Image processing software for Nikon microscope |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | Measurement device for EV concentration |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | Graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotics for cell cultivation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | Cell culture media for PC3 cell line cultivation |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain – 5 mM Solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | RNA staining fluorescent dye for the EV labeling |
References
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Sunkara, V., Woo, H. -. K., Cho, Y. -. K. Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics. The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).
- Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Bonsergent, E., et al. Quantitative characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within mammalian cells. Nature Communications. 12, 1864 (2021).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R. Fluorescent labeling of extracellular vesicles. Methods Enzymology. 645, 15-42 (2020).
- Ragni, E., et al. Innovative Visualization and Quantification of Extracellular Vesicles Interaction with and Incorporation in Target Cells in 3D Microenvironments. Cells. 9 (5), 1180 (2020).
- Saari, H., et al. FLIM reveals alternative EV-mediated cellular up-take pathways of paclitaxel. Journal of Controlled Release. 284, 133-143 (2018).
- Franzen, C. A., et al. Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells. BioMed Research International. 2014, 619829 (2014).
- Feng, D., et al. Cellular Internalization of Exosomes Occurs Through Phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
- Hoen, E. N. M. N. -. T., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Van Der Vlist, E. J., Nolte-‘T Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Singh, K., et al. Separation of distinct exosome subpopulations: isolation and characterization approaches and their associated challenges. The Analyst. 146 (12), 3731-3749 (2021).
- Woo, H. -. K., et al. Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples. ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).
- Kim, T. -. H., et al. FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface. Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).
- Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of Extracellular Vesicles and Release of Their Cargo from Endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
- Sung, B. H., et al. A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells. Nature Communications. 11, 2092 (2020).
- Heusermann, W., et al. Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER. Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).
- Reclusa, P., et al. Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion. Scientific Reports. 10, 6494 (2020).
- Verweij, F. J., et al. Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo. Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029 (2015).
- Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., Stępień, E. 3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells. Cellular & Molecular Biology Letters. 23, 57 (2018).
- Sunkara, V., et al. Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring. Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).
- Li, H., et al. Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261 (2020).
- Dong, L., et al. Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium. Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044 (2020).
