Summary
Bioluminescens-ljus som emitteras av ett luciferasenzym som oxiderar ett småmolekylärt substrat, ett luciferin-kan utnyttjas för att aktivera fotosensoriska proteiner, vilket ger ytterligare en dimension till ljusstimulering och möjliggör manipulation av en mängd ljusmedierade funktioner i celler över temporala och rumsliga skalor.
Abstract
Bioluminescens - ljus som emitteras av ett luciferasenzym som oxiderar ett litet molekylsubstrat, ett luciferin - har använts in vitro och in vivo för att aktivera ljusgrindade jonkanaler och pumpar i neuroner. Medan denna bioluminescerande optogenetik (BL-OG) tillvägagångssätt ger en kemogenetisk komponent till optogenetiska verktyg, är det inte begränsat till användning inom neurovetenskap. Snarare kan bioluminescens utnyttjas för att aktivera vilket fotosensoriskt protein som helst, vilket möjliggör manipulation av en mängd ljusmedierade funktioner i celler. En mängd olika luciferas-luciferinpar kan matchas med fotosensoriska proteiner som kräver olika våglängder av ljus och ljusintensiteter.
Beroende på den specifika applikationen kan effektiv ljusleverans uppnås genom att använda luciferas-fotoreceptorfusionsproteiner eller genom enkel samtransfektion. Fotosensoriska proteiner baserade på ljusberoende dimerisering eller konformationsförändringar kan drivas av bioluminescens för att påverka cellulära processer från proteinlokalisering, reglering av intracellulära signalvägar till transkription. Protokollet nedan beskriver det experimentella utförandet av bioluminescensaktivering i celler och organismer och beskriver resultaten med användning av bioluminescensdrivna rekombinaser och transkriptionsfaktorer. Protokollet ger prövare de grundläggande förfarandena för att utföra bioluminescerande optogenetik in vitro och in vivo. De beskrivna tillvägagångssätten kan utvidgas ytterligare och individualiseras till en mängd olika experimentella paradigmer.
Introduction
Fotosensoriska proteiner kan aktiveras av ljus från antingen en fysisk ljuskälla eller från ett luciferasenzym i närvaro av dess substrat, luciferin, för att generera bioluminescens. För applikationer som kräver milli- eller till och med femtosekunds tidsskalor och / eller encellig rumslig upplösning är fysiska ljuskällor (lasrar och ljusdioder (LED)) de enda som inte kan dessa skalor. Exempel är den rumsliga begränsningen av ljus som används för att stimulera motsatta poler vid utveckling av Drosophila larver med millisekunds temporal kontroll1 eller den exakta stimuleringen av enskilda subcellulära strukturer såsom mitokondriella tubuler2. Många andra tillämpningar för optiska omkopplare har dock olika prioriteringar, inklusive utökad rumslig kontroll och upprepad applicering icke-invasivt och utan ljusskador men med definierad tidsmässig kontroll i minuttidsskalor och avstämbara intensiteter. Här har det flera fördelar att använda luciferaser som en alternativ ljuskälla för att aktivera ljusavkännande domäner. I motsats till optisk fiberljusaktivering når bioluminescens varje ljusavkännande domän uttryckt i målcellpopulationen eftersom ljuskällan är genetiskt kodad. Användning av bioluminescens lindrar oro över vävnads- och cellskador av fiberoptik och utökad fysisk ljusexponering. Ljuset tänds med appliceringen av luciferassubstratet. Debuten är omedelbar in vitro och in vivo beroende på administreringsväg och varar i ~ 15-30 min; utökad närvaro eller fasisk stimulering av ljus kan uppnås med olika luciferiner och med ytterligare eller upprepade tillämpningar av substrat3. Slutligen kan bioluminescensutsläpp ställas in genom att variera koncentrationen av luciferin.
Användningen av bioluminescens för att aktivera jonrörliga fotoreceptorer, dvs optogenetiska element, såsom kanalrhodopsiner eller pumpar, har i stor utsträckning demonstrerats4,5,6,7,8. Denna BioLuminescent OptoGenetics (BL-OG) -metod har använts i in vivo-experiment på möss och råttor5,6,7,9,10,11,12. BL-OG-aktivering av opsiner visade sig kräva en mängd bioluminescens på minst ~ 33 μW / mm2, med aktiveringseffektiviteten som ökade med högre ljusutsläpp6,9. Jonrörliga sensoriska fotoreceptorer är en undergrupp av den stora kontingenten av sensoriska fotoreceptorer som finns i naturen som inte rör sig13,14. Utvidgningen av bioluminescens till att aktivera icke-jonrörliga fotoreceptorer, såsom fotosenserande domäner från växter eller bakterier, uppmuntras av rapporter15,16 att icke-jonrörliga fotosensorer är betydligt mer ljuskänsliga än kanalrhodopsiner, vilket säkerställer en ännu bättre drivning av ljussensorer med bioluminescens än vad som redan erhållits med jonrörliga optogenetiska element. Nyligen rapporterade flera publikationer användningen av bioluminescens som en ljuskälla för aktivering av en mängd olika fotoreceptorer, inklusive ljus-syre-spänningsavkänning (LOV) domäner, blåljusanvändande flavindomäner (BLUF) och kryptokromer (CRY) 3,17,18,19,20,21,22 (tabell 1 ). Tillämpningar för bioluminescensdriven aktivering av optiska omkopplare riktade intracellulära processer som sträcker sig från reaktiv syreartinducerad celldöd, cAMP-syntes, proteinrekrytering och dissociation till genomisk rekombination och induktion av transkription.
Detta protokoll beskriver den allmänna utformningen av bioluminescensdrivna optogenetiska verktyg och beskriver förfarandena för experimentellt utförande av bioluminescensaktivering i celler och organismer. Den innehåller beskrivningar om hur man ställer in ett rum, en vävnadsodlingskåpa och inkubator och ett mikroskop för arbete med bioluminescens, liksom stegen från att förbereda luciferin till att applicera det. Detta protokoll ger utredarna de grundläggande förfarandena för att utföra BioLuminescent OptoGenetics (BL-OG) in vitro och in vivo. De beskrivna tillvägagångssätten kan utvidgas ytterligare och individualiseras till olika experimentella paradigmer. Vi förväntar oss att detta protokoll ska underlätta antagandet av användningen av bioluminescens i optogenetiska biologiska studier.
Protocol
Alla procedurer i den aktuella studien utfördes med hjälp av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) godkända protokoll för djurhantering vid Central Michigan University, MI.
1. Bioluminescensaktivering av fotosensoriska proteiner in vitro
- Konstruktioner
- Välj en luciferassekvens eller luciferas-fluorescerande proteinfusionssekvens som kommer att resultera i uttrycket av en ljussändare som producerar ljus med en våglängd som matchar fotoreceptorn som ska aktiveras.
OBS: Till exempel kan blå ljusemitterande luciferaser, såsom Gaussia luciferasvarianter eller NanoLuc, paras ihop med blå ljusavkännande fotoreceptorer som CRY / Ca2 + - och integrinbindande protein (CIB), LOV eller Vivid (VVD). - Om det inte redan finns tillgängligt från andra utredare eller plasmidavlagringar, använd standard molekylärbiologiska tekniker för att klona DNA till en däggdjursuttrycksplasmid.
OBS: Valet av promotorer dikteras av behovet av att tillhandahålla ett starkt och konstitutivt uttryck för den ljusemitterande modulen, såsom den som tillhandahålls av CAG- och CMV-promotorerna. - För inledande studier, använd separata plasmider för samtransfektion av ljussändaren och ljussensorn. Generera fusionsproteiner av de två moietiesna efter behov och för efterföljande studier.
- Skaffa högkvalitativa plasmid-DNA med mini-, midi- eller maxiprep-kit enligt tillverkarens protokoll.
- Välj en luciferassekvens eller luciferas-fluorescerande proteinfusionssekvens som kommer att resultera i uttrycket av en ljussändare som producerar ljus med en våglängd som matchar fotoreceptorn som ska aktiveras.
- Cellodling och transfektion
OBS: HeLa-celler och HEK293-celler används som exempel i detta protokoll.- Plattceller i format och siffror enligt önskad slutanvändning.
ANMÄRKNING: Särskilda exempel ges i tabell 2. Celldensitet vid tidpunkten för plätering kommer att avgöra hur snart celler kan transfekteras.- För bedömning av bioluminescensaktiverad transkription med fluorescensmikroskopi, platta HEK293-celler på poly-D-lysin (PDL)-belagda 12 mm täckglas placerade i 24-brunnsskålar.
- För bedömning av bioluminescensaktiverad transkription genom att mäta ljusemission från en ortogonal reporter luciferas i en luminometer, platta HeLa-celler initialt i 6- eller 12-brunnsskålar för transfektion men platta om dem efter transfektion (se steg 4).
- Om upprepad bioluminescensstimulering kommer att utföras i levande cellavbildningskammare, välj täckglas av lämplig storlek och placera dem i flerbrunnsplattor av lämplig storlek (24-brunnsplattor för 12 mm täckglas, 12-brunnsplattor för 15 mm och 18 mm täckglas). Seeda cellerna ovanpå täckglasen med hjälp av de cellnummer som anges i tabell 2. Om den valda celltypen inte fäster väl vid odlingsytan, platta cellerna på PDL-belagda rätter.
- Utför transfektion genom lipofection enligt tillverkarens rekommendation eller använd någon transfektionsmetod som är lämplig för den valda celltypen.
OBS: Tabell 3 beskriver transfektionsexperiment för två olika fotoreceptorer, EL222 och CRY2 / CIB, och deras respektive reporterplasmider, förutom olika ljusemitterande proteiner. Förhållandena mellan de olika plasmiderna fungerar bra för de valda exemplen men måste optimeras för varje ljussändare/ljussensorpar. - Efter transfektion, placera cellerna i en inkubator som är helt ljusförseglad (Figur 1).
- Beroende på önskad slutanvändning, använd cellerna för bioluminescensstimulering nästa dag i sina ursprungliga brunnar / rätter, eller platta om dem 3-4 timmar efter lipofection. För att läsa transkription av en firefly luciferase reporter gen i en luminometer, platta om cellerna i vita 96-brunnsplattor.
OBS: Utför alla manipuleringar i ett ljustätt rum i en laminär flödeshuva upplyst av rött ljus (figur 2).- Tvätta de transfekterade cellerna en gång med Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) eller fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Tillsätt den minsta volymen av ett trypsiniserande reagens till brunnarna (24-brunn: 100 μL; 12-brunn: 150 μL; 6-brunn: 300 μL) och inkubera cellerna i 3 min vid 37 ° C.
- Tillsätt odlingsmedium för att uppnå en cellkoncentration som ger lämplig celldensitet för nästa pläteringssteg (till exempel resuspendceller i en 24-brunn i en slutlig volym på 1,2 ml för plätering i 10 brunnar i en 96-brunnsplatta; återsuspendera celler i en 12-brunn i en slutlig volym på 2,4 ml för plätering i 20 brunnar på en 96-brunnsplatta). Poola de transfekterade cellerna från flera brunnar beroende på antalet brunnar som behövs i slutändan.
- Platta de transfekterade cellerna i sitt slutliga format och sätt tillbaka plattorna till den ljusskyddade inkubatorn.
- Plattceller i format och siffror enligt önskad slutanvändning.
- Bioluminescens aktivering in vitro
- Förbered luciferassubstratet (luciferin).
- Förbered 50 mM-bestånd genom att lösa upp 5 mg lyofiliserat coelenterazin (CTZ) i 250 μL av dess specifika lösningsmedel. Se till att all CTZ längs flaskans väggar löses genom pipettering eller virvel. Skydda injektionsflaskan från direkt ljus.
- Förbered 50 μL alikvoter i 0,5 ml svarta mikrocentrifugrör och förvara vid -80 °C för framtida bruk.
OBS: CTZ upplöst i lösningsmedel fryser inte vid -80 °C. Alikvoter kan tas bort från och återföras till frysen flera gånger för att göra arbetslösningar så länge exponeringen för ljus och rumstemperatur hålls till ett minimum.
- Enkel bioluminescens ljusstimulering
OBS: Alla manipuleringar utförs i ett ljustätt rum i en laminär flödeshuva upplyst av rött ljus (figur 2).- Förbered en arbetslösning av luciferin i cellodlingsmedium (DMEM eller NeuroBasal). Justera koncentrationen av luciferin så att den slutliga koncentrationen är 100 μM. Förbered alla utspädningar av CTZ i medium strax innan du lägger till cellerna, eftersom CTZ oxiderar över tiden.
OBS: Om hela medievolymen kommer att bytas ut kommer arbetslösningen att vara 100 μM. Om luciferininnehållande medium tillsätts till cellerna kommer koncentrationen att vara högre genom utspädningsfaktorn (till exempel tillsats av 50 μL medium innehållande 300 μM luciferin till 100 μL medium i brunnen kommer att resultera i en 1: 3-utspädning och därmed i en 100 μM slutlig koncentration av luciferin). - Tillsätt luciferininnehållande medium till cellerna och inkubera under önskad varaktighet av ljusstimulering.
OBS: Detta kan vara så kort som 1 min eller så länge som 15 min och kan vara ännu kortare eller längre. Hur lång tid det är att lämna det luciferininnehållande mediet på cellerna beror på halveringstiden och kinetiken hos den valda luciferas-luciferinkombinationen. - Övervaka ljusutsläpp vid 100 μM slutlig luciferinkoncentration med ögat efter att ha stängt av det röda ljuset. vänta några sekunder tills ögonen har anpassat sig till fullständigt mörker. Dokumentera ljusemissionen genom att ta ett fotografi (även med en mobiltelefon).
- Avsluta ljusstimuleringen genom att ta bort det luciferinhaltiga mediet och ersätta det med odlingsmedium. Beroende på experimentens känslighet, tvätta cellerna med odlingsmedium en eller två gånger efter avlägsnande av det luciferinhaltiga mediet för att eliminera allt luciferin. Om cellerna inte fäster väl vid odlingsytan, platta dem på PDL-belagda diskar för att undvika att förlora cellerna under tvätt.
- Sätt tillbaka cellerna till den ljusskyddade inkubatorn i 16-24 timmar.
- Förbered en arbetslösning av luciferin i cellodlingsmedium (DMEM eller NeuroBasal). Justera koncentrationen av luciferin så att den slutliga koncentrationen är 100 μM. Förbered alla utspädningar av CTZ i medium strax innan du lägger till cellerna, eftersom CTZ oxiderar över tiden.
- Upprepad bioluminescens ljusstimulering
OBS: Alla manipuleringar utförs i ett rum som kan göras ljustätt och belysas av rött ljus.- Ställ in bildkammaren för levande celler. Skapa ett ljustätt fack runt det levande cellavbildningsmikroskopet med hjälp av en låda och svarta plastark eller svarta draperier (figur 3). Täck över alla ljuskällor som finns i det ljustäta facket och rummet (t.ex. LED-indikatorer på mikroskopet eller instrumenten).
- Ställ in perfusionssystemet med önskad lösning för intag och kammarens utport som leder till en avfallsbehållare.
OBS: Till exempel kan bildlösningen vara Tyrodens lösning (natriumklorid (124 mM), kaliumklorid (3 mM), HEPES (10 mM), kalciumkloriddihydrat (2 mM), magnesiumkloridhexahydrat (1 mM), D-glukos (20 mM)). - Förbered en arbetslösning av luciferin i bildlösningen. Alikvot i lika många mikrocentrifugrör som antalet upprepade stimuleringar. Justera koncentrationen av luciferin så att den slutliga koncentrationen i bildkammaren är 100 μM.
- Placera en täckglas med transfekterade celler i kammaren.
- Medan du håller pumpen igång, ta bort pumpens inloppsrör från insugningsbägaren och sänk snabbt ner den i luciferinlösningen, så kort som möjligt för att undvika luftrum i slangen.
- Så snart luciferinlösningen har tagits upp, placera inloppsröret tillbaka i inloppsbägaren. Upprepa denna process så många gånger som behövs och med intervaller på flera minuter till timmar, beroende på det fysiologiska mönster som cellerna ska utsättas för.
- Återför cellerna till den ljusskyddade inkubatorn i 16-24 timmar för transkription, eller under den tid som effekten av ljusstimulering ska bedömas.
- Förbered luciferassubstratet (luciferin).
2. Bioluminescensaktivering av fotosensoriska proteiner in vivo
- Konstruktioner
- Välj en luciferassekvens eller luciferas-fluorescerande proteinfusionssekvens som kommer att resultera i uttrycket av en ljussändare som producerar ljus med en våglängd som matchar fotoreceptorn som ska aktiveras.
- Använd vanliga molekylärbiologiska tekniker för att klona DNA till en pAAV-plasmid, om den inte redan är tillgänglig från andra utredare eller plasmidavlagringar.
- Välj starka promotorer för uttryck av de ljusemitterande modulerna, till exempel CAG eller CMV.
- Använd standardmetoder för beredning av virusbestånd med hög titer6 eller låt virala vektorer framställas kommersiellt.
- För inledande studier, använd separata virala vektorer för samtransduktion av ljussändaren och ljussensorn för att möjliggöra justering av förhållandena mellan de olika komponenterna om det behövs.
- AAV-transduktion
- Injicera försöksdjurets målorgan med virala vektorer hos ljussändaren, ljussensorn och reportern som är analoga med de koncentrationsförhållanden som används för in vitro-transfektionerna (tabell 3).
- Återför djuren till sina hemburar i minst 2 veckor för att möjliggöra maximalt uttryck av alla komponenter.
OBS: Om målorganet är inne i kroppen och skyddat från omgivande ljus kan djuren hysas under normala ljusförhållanden.
- Bioluminescensaktivering in vivo
- Förbered luciferassubstratet (luciferin).
- Ta ut en injektionsflaska med vattenlöslig CTZ från frysen -80 °C och låt den värmas till rumstemperatur. Håll den skyddad från ljus.
- Per 500 μg injektionsflaska, tillsätt 250 μL sterilt vatten, använd antingen en spruta eller genom att öppna injektionsflaskan och tillsätt vatten med en pipett och sätt sedan tillbaka gummiproppen på glasflaskan.
- Inkubera den rekonstituerade glasflaskan i ett 55 ° C vattenbad i några minuter för att helt lösa upp pulvret.
- Överför lösningen till ett svart mikrocentrifugrör. Skölj väggarna i glasflaskan för att hämta all CTZ.
- Ta bort mängden lösning som behövs för dagen. Förvara den återstående lösningen vid 4 °C för användning nästa dag. Frys inte!
- Utför samma steg (2.3.1.1–2.3.1.5) för en flaska med fordon.
- Bioluminescens ljusstimulering
- Ta bort den volym luciferin/fordon som behövs för djurets storlek och den valda appliceringsvägen (tabell 4).
- Injicera djuren med luciferin eller fordon. Upprepa bioluminescensljusstimuleringen enligt den experimentella designen. Till exempel, om aktivering av ett rekombinas önskas under ett specifikt beteendeparadigm, injicera djuren strax före beteendetestningen. Om fasisk transkription av en molekyl är målet, injicera djuren upprepade gånger under dagar.
- Samla in data från de bioluminescensstimulerade djuren som de är utformade.
- Förbered luciferassubstratet (luciferin).
Representative Results
Det finns många intracellulära händelser som kan manipuleras med ställdon som svarar på ljus, och som är mottagliga för bimodal aktivering med fysiska och biologiska ljuskällor. Nedan följer exempel som använder en ljuskänslig kalciumintegratör (Ca2+), ljusinducerad proteintranslokation, en ljusavkännande transkriptionsfaktor och ett ljuskänsligt rekombinas. Exemplen illustrerar möjligheten att använda bioluminescens för att aktivera olika typer av fotoreceptorer. De presenterade experimenten var inte specifikt optimerade med avseende på applicering av ljusdiod (LED), det valda luciferaset eller med avseende på koncentrationer och timing av luciferinapplikation.
Snabbt ljus- och aktivitetsreglerat uttryck (FLARE) är ett optogenetiskt system som möjliggör transkription av en reportergen med samtidig förekomst av ökad intracellulär Ca2+ och ljus23 (Figur 4A). Närvaron av Ca2+ krävs för att föra proteasen i närheten av proteasklyvningsstället som endast är tillgängligt med ljusstimulering, vilket resulterar i frisättning av transkriptionsfaktorn. HEK293-celler samtransfekterades med de ursprungliga FLARE-komponenterna, en dubbel Firefly (FLuc)-dTomato reporter-konstruktion och en membranförankrade Gaussia luciferas-variant sbGLuc6. I närvaro av ökad intracellulär Ca2+ genom exponering av celler för 2 μM jonomycin och 5 mM kalciumklorid (CaCl2) ledde appliceringen av blå LED till robust uttryck av fluorescensreportern jämfört med celler kvar i mörkret, liksom till uttrycket av FLuc bestämt genom mätning av luminescens vid tillsats av FLuc-substratet, D-luciferin. Liknande nivåer av FLuc-uttryck uppnåddes med bioluminescens som emitterades av sbGLuc vid applicering av sbGLuc-substratet (CTZ) tillsammans med jonomycin och CaCl2. Observera att luciferaserna som används för ljusaktivering (sbGLuc) och för att rapportera effekten av ljusaktivering (transkription av FLuc) endast producerar ljus med sina respektive luciferiner (CTZ vs. D-luciferin) och inte korsreagerar.
Olika komponenter kombinerades för att generera ett ljusinducerat transkriptionssystem baserat på heterodimerisationen av kryptokromer23,24 (Figur 4B). CRY2 smältes samman till ett proteas medan den membranbundna CIB smältes samman till proteasklyvningsstället och transkriptionsfaktorn. Ljusinducerad proteintranslokation frigjorde transkriptionsfaktorn, vilket ledde till uttrycket av FLuc och dTomato, som visas i figur 4A. Medan närvaron av transkriptionsfaktorkomponenten ensam resulterade i betydande bakgrundssignal möjligen på grund av spontan proteolys, ökade både fysiskt ljus (LED) och bioluminescens (CTZ) robust uttrycket av FLuc mätt i ett in vivo-bildsystem (IVIS).
I en annan uppsättning experiment användes NanoLuc (luciferin: furimazin eller hCTZ) för den optogenetiska regleringen av transkription genom dimerisering av CRY / CIB och den ljuskänsliga transkriptionsfaktorn, EL22225,26,27. Figur 5A,B visar scheman för de olika komponenterna i mörker- och ljustillstånden och luciferasen samtransfekteras eller smälts samman med ljussensorn. Olika jämförelser visas i figur 5C. Bioluminescens, inducerad genom att tillsätta hCTZ till HEK293-celler som uttrycker konstruktionerna och ta bort den efter 15 minuter, var effektivare vid körning av reportertranskription än 20 minuters LED-ljusexponering för både CRY / CIB och EL222. För CRY/CIB var en timmes LED-exponering tillräcklig för att nå en transkriptionsnivå jämförbar med 15 minuters bioluminescens. Däremot för EL222, även 60 min LED var knappt hälften så effektiv som en kort exponering för bioluminescens. Det fanns inga signifikanta skillnader i transkriptionseffekten mellan de två systemen vid samtidig transfekt, även om fusionsproteinerna i CRY/CIB var effektivare än för EL222. För båda systemen ledde fusionsproteinerna till signifikant högre transkriptionsnivåer än de samtransfekterade komponenterna. CRY/CIB visade genomgående högre bakgrundsnivåer med fordonsapplikation jämfört med EL222, som hade försumbar bakgrundstranskription. Ökande koncentrationer av enbart hCTZ hade ingen effekt på transkriptionen av reportergenen.
Fotoaktiverbara rekombinaser ger ett mångsidigt verktyg för optogenomiska manipuleringar. Vi testade bioluminescensaktivering av ett ljuskänsligt split Cre-rekombinas baserat på Vivid LOV-proteinet, iCreV28. Figur 6A visar ett schema över de olika komponenterna, sbGLuc, iCreV och en lox-stop-lox fluorescensreporter (tdTomato) före och efter applicering av CTZ. Resultaten från CTZ-tillämpning i förhållande till kontroller (ingen CTZ eller LED) visas i figur 6B. Det finns något bakgrundsuttryck även i mörkret (ingen CTZ); emellertid, i närvaro av CTZ, uttryck ökas robust över bakgrunden och liknar det som induceras med LED-applikation.
Figur 1: Ljusförseglad inkubator. Kartongflik som täcker ljuset från den upplysta kontrollpanelen (topppil). Ljusogenomträngligt lock över inkubatorns glasdörr (bottenpil) för att skydda cellerna från ljusexponering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Laminär flödeshuva upplyst av rött ljus. Inställning som visar en vanlig laminär flödesvävnadsodlingshuva som belyses av rött ljus. Pilen indikerar en vanlig skrivbordslampa med en röd glödlampa. Alla manipuleringar under rött ljus utförs i ett annars mörkt ljustätt rum. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Ljustäta fack runt levande cellavbildningsmikroskop. Två exempel på mikroskopinställningar för levande cellavbildning som visar användningen av antingen en solid låda med plastdraperier endast på framsidan (vänster paneler: topp och botten) eller svarta draperier runt bildinställningen (höger paneler: topp och botten). Framsidorna i båda exemplen förblir öppna och upprullade när de inte används (övre paneler: vänster och höger). De främre svarta draperierna rullas ner för att förhindra att något ljus i rummet (t.ex. datorskärmar) kommer in i bildområdet när du utför bioluminescensstimulering och / eller avbildning med levande celler (nedre paneler: vänster och höger). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Bioluminescens för integrering av intracellulära signalhändelser. (A) Scheman över flarekomponenterna som samtransfekteras med sbGLuc. I närvaro av Ca2+ och den resulterande närheten av proteasen till proteasklyvningsstället kommer antingen bioluminescens eller LED att leda till utveckling av LOV, exponering av klyvningsstället och frisättning av transkriptionsfaktorn. Cellerna utsattes för LED (arbetscykel 33%, 2 s på / 4 s av i 40 min; 3,5 mW ljuseffekt, 4,72 mW / cm2 bestrålning) eller för bioluminescens (100 μM CTZ slutlig koncentration i 15 min) eller lämnades i mörkret. Mikroskopiska bilder av HEK293-celler som uttrycker ovanstående komponenter efter behandling för att öka Ca2+ nivåer och exponering för LED (vänster). FLuc luminescens mätt i en luminometer som jämför exponering för LED, bioluminescens (CTZ) eller vänster i mörkret (höger). (B) Scheman för ett icke-Ca2+-beroende transkriptionssystem som är samtransfekterat med sbGLuc. HEK293-celler i 4-brunnsplattor transfekterades med fyra olika arrangemang av komponenter som avbildas i schemat. Plattorna utsattes för antingen LED (arbetscykel 33%, 2 s på / 4 s av i 40 min; 3,5 mW ljuseffekt, 4,72 mW / cm2 bestrålning) eller bioluminescens (100 μM CTZ slutlig koncentration) genom att tillsätta CTZ och låta den vara på i 15 min; kontrollplattor lämnades i mörkret. Transkription av FLuc-reportern mättes i en IVIS. IVIS-bilder av representativa rätter visas till vänster; strålningsmätningar från flera replikat som är baslinjerade till de mörka kontrollerna visas till höger. Skalstång = 100 μm. Förkortningar: FLARE = Snabbt ljus- och aktivitetsreglerat uttryck; LOV = ljus-syre-spänningsavkänning; LED = ljusdiod; CTZ = coelenterazin; FLuc = firefly luciferase; dTom = dTomato; CRY2 = kryptokrom 2; CRY2PHR = CRY2 fotolyas homologi region; CIB1 = Ca2+- och integrinbindande protein 1; CIBN = N-ändstation för CIB1; IVIS = in vivo bildsystem. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Bioluminescens för att driva transkription. (A) Scheman för två fotoaktiverbara transkriptionssystem i deras mörka och ljusa tillstånd. (B) NanoLuc var antingen samtransfekterad eller smält samman med de ljusavkännande delen som avbildas (N-NanoLuc-CRY-GalDD-C; N-NanoLuc-VP16-EL222-C). (C) Jämförelser med båda systemen avseende ljuskällor, konstruktionsdesign och signal till brus. Cellerna utsattes för LED (arbetscykel 33%, 2 s på/ 4 s av i 40 min; 3,5 mW ljuseffekt, 4,72 mW / cm2 bestrålning) eller för bioluminescens i 15 min (100 μM hCTZ slutlig koncentration; utom där olika koncentrationer noteras). Mörka plattor lämnades orörda i inkubatorn mellan den initiala omvandlingen av plasmider och FLuc-mätning; VEH, plattor hanterades på samma sätt som de som fick hCTZ, men fick fordon istället. Skillnader i transkriptionsnivåer: hCTZ, samtransfekt cry kontra EL222 - inte signifikant; hCTZ, luciferas - fotoproteinfusion CRY vs. EL222 - p < 0,005; hCTZ, CRY co-transfektion kontra fusion - p < 0,005; hCTZ, EL222 samtransfektion kontra fusion - p < 0,01; fordon, CRY vs. EL222 - p < 0,05. Förkortningar: UAS = uppströms aktiverande sekvens; LED = ljusdiod; CTZ = coelenterazin; FLuc = firefly luciferase; CRY = kryptokrom; CIB = Ca2+- och integrinbindande protein; VEH = fordon. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Bioluminescens för optogenomisk manipulation. (A) Scheman för bioluminescensdriven optogenomisk manipulation med sbGLuc, de delade iCreV-komponenterna och en LSL-reporterkassett, före och efter applicering av ljus. (B) HEK293-celler lipofected med plasmider och hölls sedan i mörkret. Tjugofyra timmar senare behandlades cellerna i 30 minuter med bara medium (ingen CTZ) eller med CTZ (100 μM slutlig koncentration) eller med LED (arbetscykel 25%, 5 s på / 15 s av i 5 min; 14,81 mW ljuseffekt, 20 mW / cm2 bestrålning) som en positiv kontroll. Mikroskopiska bilder av tdTomatfluorescens med användning av angivna förhållanden. Skalstång = 100 μm. Förkortningar: LSL = lox-stop-lox; CTZ = coelenterazin; LED = ljusdiod; VVD = Levande. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Bioluminescensaktivering av fotoreceptorer. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Riktlinjer för plätering och transfektering av celler i olika format. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 3: Förhållanden mellan olika plasmider för transfektion. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 4: Injektionsvägar, volymer och koncentrationer av luciferin för in vivo-applikationer (25 g mus). Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Discussion
Det finns en rad luciferaser och luciferiner med ljusemissionsvåglängder som matchar aktiveringsspektra för fotosensoriska proteiner från blått till rött ljus14,29. Förutom att anpassa emissions- och excitationsvåglängder finns det inget tillförlitligt sätt att bestämma a priori vilken parning som fungerar bäst. Således behovet av att experimentellt bestämma hur luciferin-luciferaspar fungerar i celler och organismer för att driva fotosensoriska system.
Protokollen som beskrivs i denna presentation beskriver hur man förbereder luciferin och hur man applicerar det in vitro och in vivo, tillsammans med riktlinjer för att inrätta rum, vävnadsodlingskåpor, inkubatorer och mikroskop för experiment som använder bioluminescens. I de representativa experimenten användes olika luciferaser ( NanoLuc, Gaussia luciferas) med flera fotosensoriska proteiner (CRY / CIB, EL222, VVD, LOV), vilket visade effekterna av bioluminescens kontra fysiskt ljus, samtransfektion kontra fusionsproteiner, signal-till-brus-jämförelser och olika avläsningsanalyser. Fler tillämpningar av bioluminescensaktiverande fotosensoriska proteiner beskrivs i publikationer från flera grupper, riktade mot induktion av celldöd, cAMP-syntes och proteinrörelse utöver transkription (tabell 1).
Att helt enkelt samöverföra ljusemitterande och ljusavkännande komponenter är en bra start. Variabler är molära förhållanden för emitter och sensor; okända är bakgrundsnivåer av sensoraktivitet i mörkret, sensoraktivitet i förhållande till ljusintensitet och varaktighet och effektiviteten av sensoraktivering som jämför fysiskt och biologiskt ljus. Medan fusionskonstruktioner har fördelen att hålla molförhållandet mellan sändare och sensor vid 1: 1 och föra ljussändaren nära ljusavkänningsdomänen, spelar andra överväganden in, till exempel var man ska binda (N- eller C-terminal) och hur man länkar (länklängd och komposition) utan att påverka det fotosensoriska ställdonets prestanda.
För experiment både in vitro och in vivo finns det flera alternativ för att ställa in bioluminescerande ljusemission, antingen genom att variera luciferinkoncentrationen och / eller genom att variera den tid luciferin görs tillgänglig för respektive sensor. Minsta mängd och tid bestäms av närvaron eller frånvaron av den effekt som förväntas med ljusaktivering. Däremot bestäms respektive maxima huvudsakligen av cellernas tolerans mot höga koncentrationer av luciferin under längre tider. Koncentrationen av CTZ som valts i ovanstående exempel, 100 μM, ligger nära den övre gränsen för olika celltyper, från HEK293-celler till neuroner. Målet är att använda så låg koncentration som möjligt under kortast möjliga tid för att uppnå aktivering av den riktade fotosenseringsdomänen. Detta kommer att uppnås lättare med luciferaser med hög ljusemission och fotoreceptorer med hög ljuskänslighet.
Bioluminescens för att driva fotoreceptorer har använts hos gnagare (möss, råttor) med fotosenserande proteiner uttryckta i levern, muskeln, ryggmärgen och hjärnan samt via fotoreceptoruttryckande celler transplanterade subkutant eller intraperitonealt. I princip finns det inga gränser som hindrar tillvägagångssättet från att tillämpas på olika arter, från icke-mänskliga primater till fisk eller flugor. Beroende på organismens permeabilitet för luciferin kan appliceringen vara lika enkel som att applicera luciferin på det omgivande vattnet (t.ex. i fisklarver30). Innan BL-OG används i någon ny organism måste pilotexperiment utföras för att säkerställa att luciferin når sina mål via den valda appliceringsvägen.
Kritiska aspekter av den experimentella designen är de olika kontroller som är viktiga för tolkningen av resultat. Celler som uttrycker en reporter som drivs av ett luciferas som verkar på ett fotosensoriskt protein bör jämföras med celler som saknar luciferas eller saknar det fotosensoriska proteinet. Vidare bör jämförelser göras mellan celler som utsätts för luciferin, fordon eller hålls i mörkret. Det är också viktigt att inse begränsningarna i olika analyser för att bedöma effekterna av bioluminescensdriven fotoreceptoraktivering. Till exempel kan effekten av bioluminescensaktiverad transkription testas på olika sätt, beroende på om reportergenen är ett ortogonalt luciferas (luminometer, IVIS) eller ett fluorescerande protein (fluorescensaktiverad cellsortering, mikroskopibildanalys). De grundläggande effekterna bör vara reproducerbara på alla testplattformar, men de kvantitativa aspekterna av effekterna kan variera avsevärt.
Bioluminescensaktiveringen av fotoreceptorer har hittills visats för ett begränsat antal luciferaser respektive fotosensoriska proteiner, både in vitro och in vivo. Det kan utvidgas till den stora klassen av fotoreceptorer för att aktivera många fler biologiska processer. En sådan utvidgning av tillvägagångssättet främjas ytterligare av den kontinuerliga utvecklingen av nya luciferaser och luciferas-fluorescensproteinpar med mycket högre ljusutsläpp än naturligt förekommande luciferaser och med kinetiska egenskaper som inte kan användas för olika tillämpningar. Dessa framsteg är parallella med genereringen av nya luciferiner, vilket ytterligare bidrar till ökad ljusstyrka och färgpaletter29. Denna verktygsplattform erbjuder applikationer för att manipulera och undersöka intracellulär dynamik och cellinteraktioner i levande celler, vävnader och organismer.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar våra kollegor för konstruktioner, särskilt A. Ting för Ca-FLARE-proteasen, transkriptionsfaktorn och reportern (Addgene # 92214, 92213, 92202), H. Kwon för TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16 och NES-CRY2PHR-TevC (Addgene # 89878, 89877), C. Tucker för CRY-GalΔDD (B1013) och CIB-VP64 (B1016) (Addgene # 92035, 92037), M. Walsh för pGL2-GAL4-UAS-Luc (Addgene #33020), K. Gardner för VP-EL222 och C120-Fluc, och A. Cetin och H. Zeng för att ha gjort iCreV tillgängligt före publicering. Detta arbete stöddes av anslag från NSF (NeuroNex 1707352), NIH (U01NS099709), W.M. Keck Foundation och Vetenskapsrådet till A.B. (2016-06760).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABI 25W Deep Red 660 nm LED Light Bulb | Amazon | to be used with any lamp stand | |
| Black Microcentrifuge Tubes, 0.5 mL, Argos Technologies | Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Black Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL, Argos Technologies | Fisher Scientific | 03-391-161 | |
| Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric (1.5 m x 2.7 m) x 0.12 mm (thick) | THOR LABS | BK-5 | |
| C120-Fluc | K. Gardner | ||
| CaCl2 | Sigma | C8106; CAS: 10035-04-8 | |
| Ca-FLARE protease, transcription factor and reporter | Addgene # 92214, 92213, 92202 | A. Ting | |
| CIB-VP64 (B1016) | Addgene # 92037 | C. Tucker | |
| CRY-GalΔDD (B1013) | Addgene # 92035 | C. Tucker | |
| CTZ | Prolume Inc. (NanoLight) | 303 | formulation for in vitro applications with Gaussia luciferases |
| CTZ (Water soluble native coelenterazine) | Prolume Inc. (NanoLight) | 3031 | formulation for in vivo applications with Gaussia luciferases |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270; CAS: 50-99-7 | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechnology | LUCK | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11960044 | |
| D-PBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher | 14190144 | |
| hCTZ | Prolume Inc. (NanoLight) | 301 | formulation for in vitro applications with Oplophorus luciferases |
| HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HEPES | Sigma | H3375; CAS: 7365-45-9 | |
| iCreV | A. Cetin and H. Zeng | ||
| In Vivo Imaging System (IVIS) | Perkin-Elmer | Lumina LT | |
| KCl | Sigma | P5405; CAS: 7447-40-7 | |
| LED Array Driver | Amuza | LAD-1 | |
| LED Array for Multiwell Plates | Amuza | LEDA-x | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent |
| Luminometer | Molecular Devices | SpectraMax L | |
| MgCl2 Hexahydrate | Sigma | M2670; CAS: 7791-18-6 | |
| NaCl | Sigma | S7653; CAS: 7647-14-5 | |
| NanoFuel Solvent | Prolume Inc. (NanoLight) | 399 | for dissolving CTZ preparations for in vitro use |
| NaOH | Sigma | 221465; CAS: 1310-73-2 | |
| NES-CRY2PHR-TevC | Addgene # 89877 | H. Kwon | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 11058021 | transfection medium |
| PDL coated coverslips (12 mm, 15 mm, 18 mm) | Neuvitro Corporation | GG-12-PDL, GG-15-PDL , GG-18-PDL | |
| pGL2-GAL4-UAS-Luc | Addgene #33020 | M. Walsh | |
| Prizmatix USB Pulser TTL Generator for Optogenetics | Goldstone Scientific | ||
| TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16 | Addgene # 89878 | H. Kwon | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Vehicle (Water-soluble carrier without CTZ) | Prolume Inc. (NanoLight) | 3031C | control for in vivo applications with CTZ |
| VP-EL222 | K. Gardner |
References
- Johnson, H. E., et al. The spatiotemporal limits of developmental Erk signaling. Developmental Cell. 40 (2), 185-192 (2017).
- Wang, Y., et al. Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion. Journal of Biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).
- Li, T., et al. A synthetic BRET-based optogenetic device for pulsatile transgene expression enabling glucose homeostasis in mice. Nature Communications. 12 (1), 615 (2021).
- Berglund, K., Birkner, E., Augustine, G. J., Hochgeschwender, U. Light-emitting channelrhodopsins for combined optogenetic and chemical-genetic control of neurons. PLoS One. 8 (3), 59759 (2013).
- Tung, J. K., Gutekunst, C. -A., Gross, R. E. Inhibitory luminopsins: genetically-encoded bioluminescent opsins for versatile, scalable, and hardware-independent optogenetic inhibition. Scientific Reports. 5, 14366 (2015).
- Berglund, K., et al. Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (3), 358-367 (2016).
- Gomez-Ramirez, M., More, A. I., Friedman, N. G., Hochgeschwender, U., Moore, C. I. The BioLuminescent-OptoGenetic in vivo response to coelenterazine is proportional, sensitive and specific in neocortex. Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 471-480 (2020).
- Moore, C. I., Berglund, K.
- Park, S. Y., et al. Novel luciferase-opsin combinations for improved luminopsins. Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 410-421 (2020).
- Jaiswal, P. B., Tung, J. K., Gross, R. E., English, A. W. Motoneuron activity is required for enhancements in functional recovery after peripheral nerve injury in exercised female mice. Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 448-457 (2020).
- Zenchak, J. R., et al. Bioluminescence-driven optogenetic activation of transplanted neural precursor cells improves motor deficits in a Parkinson's disease mouse model. Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 458-468 (2020).
- Tung, J. K., Shiu, F. H., Ding, K., Gross, R. E. Chemically activated luminopsins allow optogenetic inhibition of distributed nodes in an epileptic network for non-invasive and multi-site suppression of seizure activity. Neurobiology of Disease. 109, Pt A 1-10 (2018).
- Hegemann, P.
- Losi, A., Gardner, K. H., Moglich, A.
- Proshkina, G. M., Shramova, E. I., Shilova, O. N., Ryabova, A. V., Deyev, S. M. Phototoxicity of flavoprotein miniSOG induced by bioluminescence resonance energy transfer in genetically encoded system NanoLuc-miniSOG is comparable with its LED-excited phototoxicity. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 188, 107-115 (2018).
- Kawano, F., Okazaki, R., Yazawa, M., Sato, M. A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering. Nature Chemical Biology. 12 (12), 1059-1064 (2016).
- Shramova, E. I., Proshkina, G. M., Chumakov, S. P., Khodarovich, Y. M., Deyev, S. M. Flavoprotein miniSOG cytotoxisity can be induced by bioluminescence resonance energy transfer. Acta Naturae. 8 (4), 118-123 (2016).
- Naim, N., et al. Luminescence-activated nucleotide cyclase regulates spatial and temporal cAMP synthesis. Journal of Biological Chemistry. 294 (4), 1095-1103 (2019).
- Kim, C. K., Cho, K. F., Kim, M. W., Ting, A. Y. Luciferase-LOV BRET enables versatile and specific transcriptional readout of cellular protein-protein interactions. Elife. 8, 43826 (2019).
- Parag-Sharma, K., et al. Engineered BRET-based biologic light sources enable spatiotemporal control over diverse optogenetic systems. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 1-9 (2020).
- Kim, E. H., et al. Self-luminescent photodynamic therapy using breast cancer targeted proteins. Science Advances. 6 (37), (2020).
- Kim, C. K., et al. A Molecular calcium integrator reveals a striatal cell type driving aversion. Cell. 183 (7), 2003-2019 (2020).
- Wang, W., et al. A light- and calcium-gated transcription factor for imaging and manipulating activated neurons. Nature Biotechnology. 35 (9), 864-871 (2017).
- Lee, D., Hyun, J. H., Jung, K., Hannan, P., Kwon, H. -B. A calcium- and light-gated switch to induce gene expression in activated neurons. Nature Biotechnology. 35 (9), 858-863 (2017).
- Pathak, G. P., et al. Bidirectional approaches for optogenetic regulation of gene expression in mammalian cells using Arabidopsis cryptochrome 2. Nucleic Acids Research. 45 (20), 167 (2017).
- Nishio, H., Walsh, M. J. CCAAT displacement protein/cut homolog recruits G9a histone lysine methyltransferase to repress transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11257-11262 (2004).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Yao, S., et al. RecV recombinase system for in vivo targeted optogenomic modifications of single cells or cell populations. Nature Methods. 17 (4), 422-429 (2020).
- Love, A. C., Prescher, J. A. Seeing (and using) the light: Recent developments in bioluminescence technology. Cell Chemical Biology. 27 (8), 904-920 (2020).
- Naumann, E. A., Kampff, A. R., Prober, D. A., Schier, A. F., Engert, F. Monitoring neural activity with bioluminescence during natural behavior. Nature Neuroscience. 13 (4), 513-520 (2010).
