Summary
Primäre Mikrogliakulturen werden häufig verwendet, um neue entzündungshemmende Moleküle zu bewerten. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine reproduzierbare und relevante Methode zur magnetischen Isolierung von Mikroglia aus neugeborenen Welpen.
Abstract
Mikroglia, als hirnresidente Makrophagen, sind grundlegend für mehrere Funktionen, einschließlich der Reaktion auf Umweltstress und Gehirnhomöostase. Mikroglia können ein großes Spektrum von Aktivierungsphänotypen annehmen. Darüber hinaus sind Mikroglia, die den proinflammatorischen Phänotyp unterstützen, sowohl mit neurologischen Entwicklungsstörungen als auch mit neurodegenerativen Störungen assoziiert. In-vitro-Studien werden häufig in der Forschung eingesetzt, um mögliche therapeutische Strategien in bestimmten Zelltypen zu bewerten. In diesem Zusammenhang ist die Untersuchung der Mikrogliaaktivierung und Neuroinflammation in vitro unter Verwendung primärer Mikrogliakulturen relevanter als Mikrogliazelllinien oder Stammzell-abgeleitete Mikroglia. Die Verwendung einiger Primärkulturen könnte jedoch unter mangelnder Reproduzierbarkeit leiden. Dieses Protokoll schlägt eine reproduzierbare und relevante Methode zur magnetischen Isolierung von Mikroglia aus neugeborenen Welpen vor. Mikroglia-Aktivierung mit mehreren Stimuli nach 4 h und 24 h durch mRNA-Expressionsquantifizierung und einen Cy3-Bead Phagozyten-Assay wird hier demonstriert. Die aktuellen Arbeiten sollen eine leicht reproduzierbare Technik zur Isolierung physiologisch relevanter Mikroglia aus juvenilen Entwicklungsstadien liefern.
Introduction
Mikroglia sind die im zentralen Nervensystem ansässigen Makrophagen-ähnlichen Zellen, die von erythropoetischen Vorläufern des Dottersacks abstammen, die während der frühen Embryonalentwicklung in das Neuroepithel wandern1. Neben ihren Immunitätsfunktionen spielen sie auch eine wichtige Rolle während der Neuroentwicklung, insbesondere bei der Synaptogenese, neuronalen Homöostase und Myelinisierung2. Im Erwachsenenalter entwickeln Mikroglia lange zelluläre Prozesse, um die Umgebung kontinuierlich zu scannen. Im Falle von Homöostaserupturen wie Hirnverletzungen oder Gehirnerkrankungen können Mikroglia ihr morphologisches Aussehen verändern, um eine amöboide Form anzunehmen, in den verletzten Bereich zu wandern, viele zytoprotektive oder zytotoxische Faktoren zu erhöhen und freizusetzen. Mikroglia haben heterogene Aktivierungszustände, abhängig von ihrem Entwicklungsstadium und der Art der erlittenen Verletzung 3,4,5. In dieser Studie werden diese Aktivierungszustände grob in drei verschiedene Phänotypen eingeteilt: entzündungsfördernd/phagozytisch, entzündungshemmend und immunregulatorisch, wobei zu berücksichtigen ist, dass die Situation in Wirklichkeit wahrscheinlich komplexer ist6.
Die Untersuchung der In-vivo-Mikrogliaaktivierung und das Screening auf neuroprotektive Strategien in frühen Stadien der Gehirnentwicklung kann aufgrund (1) der Zerbrechlichkeit der Tiere vor dem Absetzen und (2) der geringen Anzahl von Mikrogliazellen eine Herausforderung darstellen. Daher werden In-vitro-Studien an Mikroglia häufig für Toxizität 7,8,9, neuroprotektive Strategien5,10,11,12,13,14 und Kokulturen 15,16,17,18,19,20,21 verwendet. . In-vitro-Studien können entweder Mikroglia-Zelllinien, Stammzell-abgeleitete Mikroglia oder primäre Mikroglia-Kultur verwenden. Alle diese Ansätze haben Vor- und Nachteile, und die Wahl hängt von der anfänglichen biologischen Frage ab. Die Vorteile der Verwendung primärer Mikrogliakulturen sind der homogene genetische Hintergrund, die pathogenfreie Geschichte und die Kontrolle des Zeitpunkts, zu dem die Mikroglia nach dem Tiertod stimuliert werden22.
Im Laufe der Jahre wurden verschiedene Methoden (Durchflusszytometrie, Schütteln oder magnetische Markierung) entwickelt, um primäre Mikroglia von Nagetieren zu kultivieren, sowohl Neugeborenen als auch Erwachsenen 23,24,25,26,27,28,29. In der vorliegenden Arbeit wird die Mikroglia-Isolierung von Maus-Neugeborenen-Welpen unter Verwendung der zuvor beschriebenen magnetisch aktivierten Zellsortiertechnologie unter Verwendung von mikroperlenbeschichtetem Anti-Maus-CD11b25,27,29 durchgeführt. CD11b ist ein Integrinrezeptor, der an der Oberfläche myeloischer Zellen, einschließlich Mikroglia, exprimiert wird. Wenn es keine entzündliche Herausforderung im Gehirn gibt, sind fast alle CD11b + -Zellen Mikroglia30. Im Vergleich zu anderen zuvor veröffentlichten Methoden 23,24,25,26,27,28,29 gleicht das vorliegende Protokoll sofortige Ex-vivo-Mikroglia-Aktivierungsanalysen und gängige primäre In-vitro-Mikrogliakulturen aus. So werden Mikroglia (1) am postnatalen Tag (P)8 ohne Myelinentfernung isoliert, (2) ohne Serum kultiviert und (3) erst 48 h nach der Gehirnisolierung entweder siRNA, miRNA, pharmakologischen Verbindungen und/oder entzündlichen Reizen ausgesetzt. Jeder dieser drei Aspekte macht das aktuelle Protokoll relevant und schnell. Erstens ermöglicht die Verwendung von pädiatrischen Mikroglia die Gewinnung dynamischer und reaktiver lebensfähiger Zellen in Kultur, ohne dass ein zusätzlicher Demyelinisierungsschritt erforderlich ist, der möglicherweise die Mikroglia-Reaktivität in vitro verändern könnte. Das vorliegende Protokoll zielt darauf ab, der physiologischen Umgebung von Mikroglia so nahe wie möglich zu kommen. Tatsächlich treffen Mikroglia nie auf Serum, und dieses Protokoll erfordert auch nicht die Verwendung von Serum. Darüber hinaus verhindert die Freilegung von Mikroglia bereits 48 Stunden nach der Kultur, dass sie ihre physiologischen Fähigkeiten verlieren.
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Protocol
Das Protokoll wurde genehmigt und alle Tiere wurden gemäß den institutionellen Richtlinien des Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, Frankreich) behandelt. Die magnetische Isolierung von Mikroglia aus den Gehirnen von 24 OF1-Mauswelpen (sowohl männlich als auch weiblich) bei P8, unterteilt in 6-Well-, 12-Well- oder 96-Well-Platten, wird vorgestellt. Die experimentelle Arbeit wurde unter einer Haube durchgeführt, um sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten.
1. Herstellung steriler Lösungen für Isolierung und Zellkultur
- Bereiten Sie 50 ml 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Ca 2+ und Mg2+ (HBSS-/-) aus der handelsüblichen 10x-Lösung her (siehe Materialtabelle).
- Dissoziationsgemisch gemäß der in Tabelle 1 angegebenen Zusammensetzung unter Verwendung eines handelsüblichen Gewebedissoziationskits herzustellen (siehe Materialtabelle).
- 200 ml 1x HBSS mit Ca 2+ und Mg2+ (HBSS+/+) aus der handelsüblichen 10x Lösung herstellen.
- Bereiten Sie 200 ml 1x PBS + 0,5% BSA (als Zellsortierpuffer bezeichnet) vor.
- CD11b-Mikroperlen gemäß Tabelle 2 herstellen.
- Bereiten Sie 500 ml Makrophagen-serumfreies Kulturmedium (SFM) + 1% Penicillin-Streptomycin (P / S) vor. Machen Sie Aliquots von 50-ml-Röhrchen und lagern Sie sie bei 4 °C. Dies wird später im Text als Mikroglia-Medium bezeichnet.
HINWEIS: Alle Isolierlösungen müssen am Versuchstag unter sterilen Bedingungen frisch zubereitet und auf Eis gehalten werden. Mikroglia-Zellkulturmedium kann hergestellt, in 50-ml-Röhrchen aliquotiert und für die zukünftige Verwendung bei 4 °C aufbewahrt werden. Eine Filtration ist nicht erforderlich.
2. Dissektion des Gehirns
- Enthaupten Sie den Kopf des Welpen mit einer großen Schere ohne vorherige Vollnarkose.
- Schneiden Sie die Haut vom Hals bis zur Nase nach der sagittalen Naht (15-20 mm) mit einer kleinen Schere ab (Abbildung 1A-C).
- Führen Sie eine kleine Scherenspitze in das Foramen magnum parallel zum Schädel ein. Von jeder Seite vorsichtig zu den Augen schneiden (Abbildung 1D,E).
- Mit einer kleinen Schere zwischen die Augen schneiden, um den Schädel und das Gehirn vom Kopf zu lösen (Abbildung 1F).
- Fassen Sie den Schädel mit zwei Pinzetten in die Nähe der Riechkolben und reißen Sie den Schädel vorsichtig auf, wobei Sie darauf achten, das darunter liegende Gehirn nicht zu beschädigen (Abbildung 1G-I).
- Entfernen Sie Kleinhirn und Geruchskolben mit einer Rasierklinge und schneiden Sie das Gehirn in zwei Stücke (Abbildung 1J).
- Legen Sie die Gehirnstücke in eine Petrischale mit 30-40 ml HBSS-/- (Abbildung 1K).
3. Hirndissoziation und magnetische Mikrogliaisolation
HINWEIS: Alle Zellmanipulationen und Resuspensionen müssen mit einer 1.000 μL Pipette mit großer Vorsicht durchgeführt werden. Die Anwendung einer hohen mechanischen Wirkung kann Mikrogliazellen aktivieren oder abtöten.
- Transfer 12 Hirnstücke (~1,2 g) pro Dissoziationsröhrchen mit Dissoziationsgemisch gemäß Tabelle 1. Für 24 Welpen wurden vier C-Tubes benötigt (Abbildung 2A-B).
- Platzieren Sie C-Tubes auf dem Dissoziator (mit dem Heizmodus). Starten Sie das optimierte NTDK-Programm im Gerät gemäß den Anweisungen des Herstellers (Abbildung 2D).
- Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 20 s (bei 4 °C), um alle Zellen zu sammeln. Schließen Sie die mechanische Dissoziation ab, indem Sie mit einer 1.000-μl-Pipette dreimal nach oben und unten pipettieren (Abbildung 2E).
- Übertragen Sie die Zellen in vier 15-ml-Röhrchen + Siebe. Spülen Sie die Siebe mit 10 ml HBSS+/+ (Abbildung 2F).
- Bei 300 x g 10 min (bei 4 °C) zentrifugieren und den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 10 ml HBSS+/+ (Abbildung 2G).
- Bei 300 x g 10 min (bei 4 °C) zentrifugieren und den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 6 ml Sortierpuffer (Schritt 1.4) (Abbildung 2H).
- Bei 300 x g 10 min (bei 4 °C) zentrifugieren und den Überstand entfernen. 200 μL CD11b-Mikroperlenlösung (Schritt 1.5) pro Röhrchen zugeben und vorsichtig resuspendieren (Abbildung 2I).
- Die Röhrchen 15-20 min bei 4 °C inkubieren. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 6 ml Sortierpuffer (Abbildung 2I-J).
- Bei 300 x g 10 min (bei 4 °C) zentrifugieren und den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 8 ml Sortierpuffer (Abbildung 2K).
- Folgen Sie dem POSSEL-Programm auf dem Separator (siehe Materialtabelle), um acht Spalten vorzubereiten. Transferzellen 1 ml x 1 ml auf der Säule. Warten Sie, bis alle Zellen durchgegangen sind, bevor Sie eine weitere ml hinzufügen. Elue CD11b+ Zellen auf steriler Elutionsplatte mit 1 mL Sortierpuffer (Abbildung 2L).
- Pool CD11b+-Zellen in einem neuen 50-ml-Röhrchen (Abbildung 2M).
- Bei 300 x g 10 min (bei 4 °C) zentrifugieren und den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 10 ml kaltem Mikrogliamedium (Schritt 1.6) (Abbildung 2N).
- Zählen Sie die CD11b+-Zellen. Bei P8 sollte man ~650.000 Zellen pro Gehirn erhalten.
HINWEIS: Im vorliegenden Protokoll wurden die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler gezählt (siehe Materialtabelle). - Resuspendieren Sie die Zellen in kaltem Mikrogliamedium auf eine Endkonzentration von 650.000-700.000 Zellen/ml und dosieren Sie sie in Zellkulturplatten.
HINWEIS: Die 6-Well-Platten sind für Western Blot (2 ml pro Well); die 12-Well-Platten sind für die RT-qPCR-Analyse (1 ml pro Well) und die 96-Well-Platten für den phagozytischen Assay (250 μL pro Well); Alle drei wurden für diese Arbeit verwendet. In diesem Manuskript sind die Ergebnisse der Western-Blot-Analyse jedoch nicht dargestellt, aber es ist möglich, mit diesem Protokoll durchzuführen. - Stellen Sie die Platten über Nacht bei 37 °C mit 5% CO2. Wechseln Sie das Medium vorsichtig mit einer 1.000 μL Pipette mit vorgewärmtem Mikrogliamedium.
- Stellen Sie die Platten vor der Stimulation über Nacht bei 37 °C mit 5% CO2 auf.
HINWEIS: Die Isolierung von Mikroglia von mehr als 36 Welpen und nach P9 wird nicht empfohlen. Dies erhöht das Risiko einer Kontamination und Ansammlung von Zelltrümmern, um Mikroglia zu aktivieren.
4. Zellstimulationen
- Herstellung von Stimulationsreagenzien gemäß Tabelle 3 unter Verwendung der handelsüblichen Reagenzien (siehe Materialtabelle).
- Fügen Sie das entsprechende Volumen in jedem stimulierten Brunnen hinzu.
HINWEIS: Das geeignete Volumen hängt von der Konzentration des Stimulus und der Größe des Brunnens ab. - Die Platten werden bei 37 °C mit 5%CO2bis zum Ende der Stimulation um 6 h, 24 h oder 48 h platziert.
- Für die Western-Blot-Analyse aspirieren Sie den Überstand und fügen 50 μL Proteinlysepuffer (siehe Materialtabelle) mit einer Pipette hinzu. Kratzen Sie mit Spitzen den Boden der Platte, um die lysierten Zellen zu lösen, und übertragen Sie sie in 1,5-ml-Röhrchen. Bei -80 °C lagern.
HINWEIS: Die Kulturplatten können jahrelang bei -80 °C gelagert werden, wenn der Überstand korrekt angesaugt ist. - Für die RT-qPCR-Analyse 6,31 aspirieren Sie den Überstand und lagern die Kulturplatten direkt bei -80 °C bis zur mRNA-Extraktion (Schritt 5).
- Für den phagozytischen Assay siehe Schritt 6.
5. mRNA-Extraktion und RT-qPCR-Analyse
- Führen Sie RNA-Extraktion, RT-PCR und RT-qPCR gemäß dem Protokoll des Herstellers durch (siehe Materialtabelle). Die Primersequenzen 5,6,31 finden Sie in Tabelle 4.
- Führen Sie eine RT-qPCR-Analyse durch, indem Sie dem zuvor veröffentlichten Bericht5 folgen.
6. Phagozytärer Assay
- Stimulieren Sie die Zellen und führen Sie während der letzten 3 Stunden der Stimulation einen phagozytischen Test durch. Zum Beispiel, für Stimulation von 6 h, starten Sie den phagozytischen Assay nach 3 h Stimulation; und für eine Stimulation von 12 h beginnen Sie den phagozytischen Assay 9 h nach Beginn der Stimulation.
- Berechnen Sie die Anzahl der Perlen, die für die Vorbereitung benötigt werden, unter Berücksichtigung des Verhältnisses (1 Zelle: 50 Perlen). Für eine Vertiefung der 96-Well-Platte werden 8,1 x 106 Perlen benötigt. Bereiten Sie die Perlenmischung gemäß Tabelle 5 vor.
HINWEIS: Wirbeln Sie die Durchstechflasche mit den Perlen vorsichtig durch, bevor Sie sie der PBS / FBS-Mischung hinzufügen. - 1 h in einem Wasserbad bei 37 °C inkubieren. Wirbel alle 10 min.
- Berechnen Sie das Lösungsvolumen, das jeder Vertiefung hinzugefügt werden soll. Fügen Sie die Lösung hinzu und inkubieren Sie für 3 h.
- Spülen Sie die Vertiefungen dreimal mit 1x PBS aus. Lesen Sie die Fluoreszenzemission bei 550 nm (Cy3-Emissionswellenlänge).
7. Qualitätskontrolle der Reinheit
- Bewerten Sie die Reinheit der magnetischen CD11b-Isolierung durch Durchflusszytometrie (FACS) (vor und nach der Zellsortierung) und führen Sie dann die RT-qPCR durch.
- Die Zellen werden gezählt und im FACS-Puffer (PBS + 2 mM EDTA + 0,5 % Rinderserumalbumin) resuspendiert, um nach Schritt 3.5 und Schritt 3.14 eine Verdünnung von 10 x 106 Zellen/ml zu erhalten.
- Nach 15 min der konventionellen Fc-Blockierung 32,33 werden die Zellen für 15 min mit einer Lebensfähigkeitssonde (FVS780) und fluorophorkonjugierten Antikörpern gegen Maus-CD45, CD11b, CX3CR1, ACSA-2, O4 oder die entsprechenden Kontrollisotypen 32,33 in der vom Hersteller empfohlenen Konzentration inkubiert (siehe Materialtabelle).
- Waschen Sie die Zellen mit FACS-Puffer, fixieren und permeabilisieren Sie sie mit einem handelsüblichen Permeabilisierungskit (siehe Materialtabelle).
- Führen Sie eine erneute Fc-Blockierung an den permeabilisierten Zellen durch und inkubieren Sie dann 15 min lang mit fluorophorkonjugierten Antikörpern gegen NeuN (siehe Materialtabelle) oder dessen Kontrollisotyp.
- Führen Sie die FACS-Analyse nach dem Waschen mit dem FACS-Puffer durch.
- Nach dem Ausschluss der Dubletten und der toten Zellen basierend auf morphologischen Parametern bzw. FVS780-Färbung wählen Sie die Gating-Strategie für die Oberflächenexpression von CX3CR1 (Mikroglia), ACSA-2 (Astrozyten), O4 (Oligodendrozyten) und intrazelluläres Vorhandensein von NeuN (Neuronen) für die Analyse des Prozentsatzes positiver Zellen.
- Nach Schritt 5 extrahieren Sie mRNA und führen RT-qPCR durch, um Itgam (CD11b), Cx3cr1, Olig2, Synaptophysin und Gfap mRNA zu quantifizieren. Normalisieren Sie Cq mit Rpl13a mRNA als Reporter und führen Sie eine relative Expression zu Itgam mRNA durch.
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Representative Results
Mikroglia ist der ZNS-residente Makrophag, der aktiviert wird, wenn er Umweltproblemen (Trauma, toxische Moleküle, Entzündungen) ausgesetzt ist4,5,6,34 (Abbildung 3A). In-vitro-Studien an Mikroglia werden häufig verwendet, um zellautonome Mechanismen im Zusammenhang mit diesen Umweltherausforderungen zu bewerten und den Aktivierungszustand nach pharmakologischer oder genetischer Manipulation zu charakterisieren. Hier wird ein Ansatz vorgestellt, um primäre Mikroglia im juvenilen Stadium mit magnetisch gekoppelten Beads zu isolieren.
Eine einfache Ablesbarkeit der Mikrogliaaktivierung in vitro ist die Quantifizierung der mRNA-Expression mehrerer Mikroglia-Reaktivitätsmarker, die mit einem proinflammatorischen Phänotyp (Cd86, Nos2, Ptgs2, Tnf) oder einem entzündungshemmenden Phänotyp (Cd206, Igf1, Arg1, Lgasl3) assoziiert sind5,6,31. Diese Phänotypen wurden in Abhängigkeit von der mRNA-Expression nach proinflammatorischem (IL-1β, LPS) oder entzündungshemmendem (IL-4 oder IL-10) Reiz beschrieben. Einige Marker werden als immunregulatorische Marker klassifiziert, da sie durch entzündungsfördernde und entzündungshemmende Stimulation hochreguliert werden (Abbildung 3A). Diese Klassifizierung wurde zuvor von unserem Team 5,6,31 beschrieben. Nach 48 h wurden isolierte Mikroglia mit pro- und entzündungshemmenden Reizen für 4 h oder 24 h stimuliert. mRNA wurde extrahiert und RT-qPCR quantifizierte Genexpression. Nach 4 h und 24 h werden proinflammatorische und immunregulatorische Marker durch IL-1β, IL-1β + IFN-γ und LPS 5,6,31 induziert. Nach 4 h induziert die IL-4-Stimulation auch den immunregulatorischen Marker Il-1rn6. Sie werden 4 h nach IL-4-Stimulation in Bezug auf entzündungshemmende Marker stark induziert. Interessanterweise ist Cd206 auch 24 h nach IL-1β-Stimulation signifikant hochreguliert6 (Abbildung 3B).
Um die phagozytische Aktivität von Mikroglia in vitro zu bewerten, wurden fluoreszierende Cy3-PVC-Perlen verwendet. Sie wurden mit fetalem Rinderserum (FBS) vorbehandelt, um ihre Phagozytose durch Mikroglia zu erleichtern. Mikroglia wurden durch Stimulation mit IL-1β + IFN-γ oder LPS für 3 h oder 21 h in Richtung proinflammatorischen Phänotyp polarisiert. Drei Stunden vor Ende der Stimulation wurden Cy3-Perlen mit Mikrogliazellen inkubiert. Nach dem Spülen mit 1x PBS wurde die Fluoreszenzintensität in jeder Vertiefung quantifiziert. Es wurde eine Quantifizierung relativ zu Vertiefungen ohne Perlen ausgedrückt und repräsentative Bilder aufgenommen (Abbildung 4). Nach 6 h Stimulation beginnen Mikroglia erst unter IL-1β + IFN-γ Cy3-Perlen zu phagozyten. Nach einer 24-stündigen Stimulation kommt es bei beiden Arten der Stimulation zu einem Anstieg der Cy3-Fluoreszenz. Dieser Anstieg der Cy3-Fluoreszenz unterstreicht eine erhöhte phagozytische Aktivität (Abbildung 4C).
Durchflusszytometrie (FACS) und RT-qPCR wurden durchgeführt, um die Reinheit der Mikrogliakultur zu bewerten. Verschiedene Gehirnzellpopulationen können durch Durchflusszytometrie unterschieden werden: CX3CR1 35 für Mikroglia, O4 für Oligodendrozyten36, NeuN für Neuronen 37 und ACSA-2 für Astrozyten38. Nach der Dissoziation sind alle Gehirnzellen vorhanden; Nach der Zellsortierung mit CD11b-Antikörpern sind jedoch nur Mikroglia und geringe Mengen an O4-Zellen vorhanden (Abbildung 5A). 48 h nach der primären Zellkultur werden nur Mikroglia-Marker gefunden, die mittels RT-qPCR ausgewertet wurden (Abbildung 5B).
Abbildung 1: Schritt-für-Schritt-Darstellung, die die Entfernung des Gehirns aus dem Schädel zeigt. (A-C) Kleine Scheren wurden verwendet, um die Haut vom Hals bis zur Nase nach der sagittalen Naht zu schneiden. (D-E) Die Spitzen der kleinen Schere wurden innerhalb des Foramen magnum parallel zum Schädel eingeführt und von jeder Seite zu den Augen sorgfältig geschnitten. (F) Der Schädel und das Gehirn wurden vom Kopf gelöst, indem sie mit einer kleinen Schere zwischen den Augen geschnitten wurden. (G-I) Der Schädel wurde mit zwei Pinzetten in der Nähe der olfaktorischen Zwiebeln gegriffen und vorsichtig zerrissen, um das darunter liegende Gehirn nicht zu beschädigen. (J) Das Kleinhirn und die olfaktorische Zwiebel wurden mit einer Rasierklinge entfernt und das Gehirn in zwei Stücke geschnitten. (K) Die Hirnstücke wurden in eine Petrischale gegeben, die 30-40 ml HBSS-/- enthielt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Schematische Darstellung von Hirndissoziationen und Mikrogliazellenisolierung. (A-C) Nach der P8-Hirndissektion der Maus und der Entfernung von olfaktorischen Zwiebeln und Kleinhirn wurden die Gehirne zuerst in eine Petrischale mit HBSS+/+ und dann in Dissoziationsröhren mit der Dissoziationsmischung überführt. Die C-Rohre wurden auf den Dissoziator gelegt (mit dem Heizmodus), und das NTDK-Programm wurde gestartet (D). (E) Am Ende des Programms wurden die Röhrchen bei 300 x g für 20 s bei 4 °C zentrifugiert; Die Dissoziation wurde dann durch dreimaliges Auf- und Abpipettieren mit einer 1.000 μL Pipette abgeschlossen. (F) Die Zellen wurden dann in 15-ml-Röhrchen + Siebe von 70 μm überführt und mit 10 mL HBSS+/+ gespült. (G) Die Proben wurden dann bei 300 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt und das Pellet wurde mit 10 mL HBSS+/+ resuspendiert. (H) Röhrchen wurden erneut bei 300 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert; Der Überstand wurde entfernt, und dann wurde das Pellet in 6 mL Sortierpuffer resuspendiert. (I) Röhrchen wurden bei 300 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt und die CD11b-Mikroperlenlösung (200 μL) wurde zugegeben. Röhrchen wurden für 15-20 min bei 4 °C inkubiert und dann in 6 mL Sortierpuffer (J) resuspendiert und bei 300 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. (K) Der Überstand wurde entfernt und das Pellet wurde vorsichtig in 8 ml Sortierpuffer resuspendiert. (L) Starten Sie dann das POSSEL-Programm auf dem Trennzeichen, um Spalten vorzubereiten. Die Zellen wurden 1 ml mal 1 ml auf die Säule übertragen, und CD11b-Zellen wurden auf einer sterilen Elutionsplatte mit 1 ml Sortierpuffer eluiert. (M) CD11b-Zellen wurden in einem neuen 50-ml-Röhrchen zusammengefasst und bei 300 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt. (N) Das Pellet wurde im letzten Schritt vorsichtig in 10 ml kaltem Mikrogliamedium resuspendiert. Die Zellen wurden gezählt und im Mikrogliamedium auf eine Endkonzentration von 650.000-700.000 Zellen/ml verdünnt, die in Zellkulturplatten abgegeben wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Mikroglia-Aktivierung nach Exposition gegenüber Umweltherausforderungen. (A) Vereinfachte schematische Darstellung des Mikroglia-Aktivierungsspektrums. (B) Relative Quantifizierung von Mikroglia-Aktivierungsmarkern nach 4 h oder 24 h Stimulation. Zwei-Wege-ANOVA gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstest39 (n = 5-15); Fehlerbalken repräsentieren SEM; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Bewertung der phagozytischen Aktivität von Mikroglia in vitro. (A) Repräsentative Bilder von Mikroglia Cy3-Perlen (in rot) Phagozytose nach Stimulation von 6 h oder 24 h. Die Bilder wurden mit dem 20-fachen Objektiv des Fluoreszenzmikroskops aufgenommen. Maßstabsbalken = 100 μm. (B) Relative Quantifizierung der Fluoreszenzemissionen pro Well. Die Statistik wurde mit Zwei-Wege-ANOVA durchgeführt, gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstest (n = 4-7); Fehlerbalken repräsentieren SEM; *p < 0,05, ** p < 0,01, ***p < 0,001. (C) Repräsentatives Bild der Mikroglia (IBA-1 + Zellen in grün) Cy3-Perlen (in rot) Phagozytose nach 6 h Stimulation. Die Bilder werden mit einem 40-fachen Objektiv des konfokalen Mikroskops aufgenommen. Maßstabsbalken = 300 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Bewertung der Reinheit der magnetischen Isolation von CD11b durch Durchflusszytometrie vor und nach der Zellsortierung. (A) Berichte über Beispiele aus dem Zellzähler vor und nach der Zellsortierung unter Hervorhebung der Zellkonzentration und Lebensfähigkeit. (B) Die x-Achse stellt die Zellkonzentration (Zelle/ml) und Lebensfähigkeit (%) nach CD11b-Zellsortierung dar. Säulenbalkendiagramm; Fehlerbalken stellen SEM dar (n = 16). Phänotypische und Genexpressionsanalyse von Zellpopulationsmarkern vor und nach CD11b+ Zellsortierung. Nach der Dissoziation wurden CD11b+-Zellen aus P8-Mäusegehirnen magnetisch sortiert. Die Expression von Mikroglia (CX3CR1), Oligodendrozyten (O4 oder Olig2 mRNA), Neuronen (NeuN oder Synaptophysin mRNA)) und Astrozyten (ACSA-2 oder Gfap mRNA) Markern wurde vor und nach der Sortierung analysiert. (C) FACS-Analyse der CX3CR1-, O4-, NeuN- und ACSA-2-Expression. Die x-Achse stellt den Prozentsatz der lebenden Zellen und Zellzahlen dar. (D) Relative Quantifizierung der CD11b+-Zellen Expression von Cx3cr1, Olig2, Synaptophysin und Gfap mRNA (x-Achse stellt relative Ziel-mRNA-Expression zu Itgam mRNA dar). Säulenbalkendiagramm; Fehlerbalken stellen SEM dar (n = 7). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Lösung | Für ein C-Rohr (μL) | Für vier C-Röhrchen (μL) |
| Puffer X | 2850 | 11400 |
| Enzym P (Papain) | 75 | 300 |
| Enzym A (DNAse) | 15 | 60 |
| Puffer Y | 30 | 120 |
| Gesamt | 2970 | 11880 |
Tabelle 1: Herstellung des Dissoziationsgemisches.
| Lösung | Für eine Röhre (μL) | Für vier Röhrchen (μL) |
| CD11b Mikroperlen | 20 | 80 |
| Sortierpuffer | 180 | 720 |
| Gesamt | 200 | 800 |
Tabelle 2: Herstellung der CD11b-Mikroperlenlösung.
| Anregung | Konzentration (ng/ml) |
| IL-1β | 50 |
| IFN-γ | 20 |
| LPS | 10 |
| IL-4 | 30 |
| IL-10 | 20 |
Tabelle 3: Die Stimulationsreagenzien.
| Gene | Protein | Vorwärts | Rückwärts |
| Arg1 | Arginase 1 | GTG AAG AAC CCA CGG TCT GT | GCC AGA GAT GCT TCC AAC TG |
| CD206 | Differenzierungscluster 206 | CTT CGG GCC TTT GGA ATA AT | TAG AAG AGC CCT TGG GTT GA |
| CD32 | Differenzierungscluster 32 | CTG GAA GAA GCT GCC AAA AC | CCA ATG CCA AGG GAG ACT AA |
| CD86 | Differenzierungscluster 86 | GAG CGG GAT AGT AAC GCT GA | GGC TCT CAC TGC CTT CAC TC |
| Gfap | Gliafibrilläres saures Protein | AAGCCAAGCACGAAGCTAAC | CTCCTGGTAACTGGCCGACT |
| Igf-1 | Insulinähnlicher Wachstumsfaktor 1 | TGG ATG CTC TTC AGT TCG TG | GCA ACA CTC ATC CAC AAT GC |
| Il1-rn | Interleukin-1-Rezeptor-Antagonist | TTG TGC CAA AGB TGG AGA TG | TTC TCA GAG CGG ATG AAG GT |
| Il4-ra | Interleukin-4-Rezeptor-Antagonist | GGA TAA GCA GAC CCG AAG C | ACT CTG GAG AGA CTT GGT TGG |
| Itgam | Integrin alpha M | CTGGTGCTCTTGGCTCAT | GGCAGCTTCATTCATCATGT |
| Lgals3 | Lektin Glactosid-bindend löslich 3 | GAT CAC AAT CAT GGG CAC AG | ATT GAA GCG GGG GTT AAA GT |
| Nr. 2 | Stickstoffmonoxid-Synthase 2 | CCC TTC AAT GGT TGG TAC ATG G | ACA TTG ATC TCC GTG ACA GCC |
| Olig2 | Oligodendrozyten-Transkriptionsfaktor 2 | CAGCGAGCACCTCAAATCTA | GATGGGCGACTAGACACCAG |
| Ptgs2 | Prostaglandin-Endoperoxid-Synthase 2 | TCA TTC ACC AGA CAG ATT GCT | AAG CGT TTG CGG TAC TCA TT |
| Rpl13 | Ribosomales Protein L13a | ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA | GAG TCC GTT GGT CTT GAG GA |
| Socs3 | Suppressor von Zytokin 3 | CGT TGA CAG TCT TCC GAC AA | TAT TCT GGG GGC GAG AAG BEI |
| Sphk1 | Sphingosinkinase 1 | TCC AGA AAC CCC TGT GTA GC | CAG CAG TGT GCA GTT GAT GA |
| Syp | Synaptophysin | ATCTCAGTGTCCCGATCCCA | GCTGTCTTCCTGGTGTAC |
| Tnf-α | Tumornekrosefaktor α | GCC TCT TCT CAT TCC TGC TT | AGG AGB TGG GCC ATA GAA CT |
Tabelle 4: RT-qPCR-Primer-Sequenzen.
| Anregung | Für 1-Brunnen | Für n-Brunnen |
| Cy3 Perlen (1 Zelle: 50 Perlen) | 8, 100, 000 | X = (8, 100, 000) x n |
| 1x PBS | Y =(100+X)/n | 50 |
| FBS | 50 |
Tabelle 5: Herstellung der Perlenmischung für den phagozytischen Assay.
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Discussion
Die aktuelle Arbeit präsentiert eine primäre Mikrogliazellkultur mit magnetisch sortierten CD11b+-Zellen. Neben der mikroglialen Funktionsbewertung (RT-qPCR und phagozytäre Assays) wurde auch die Reinheit der Mikrogliakultur bestimmt.
Klassische Mikroglia-Zellkulturen werden üblicherweise aus P1- oder P2-Nagetier-Neugeborenengehirn und Co-Kultur mit Astrozyten für mindestens 10 Tage erzeugt. Mikroglia werden dann mechanisch mit einem Orbitalschüttler getrennt. Die Methode zur Isolierung und Kultur von Mikroglia in vitro wurde erstmals Ende der 1990er Jahre aus den Gehirnen neugeborener Ratten beschrieben40,41. Seitdem wird es häufig zur Analyse von Mikroglia-Phänotypen wie aktivierten / ruhenden Mikroglia oder entzündungsfördernden / entzündungshemmenden Mikroglia verwendet. Darüber hinaus war dieses Experiment grundlegend für die Definition von Mikroglia als neurotoxische Zellen, die mit Neuronen kokultiviert werden. Im Jahr 2014 beschrieben Biber und Mitarbeiter jedoch drei signifikante Nachteile der Untersuchung von Mikroglia in vitro mit klassischen Methoden42. (1) Das Experiment verwendet neugeborene Ratten- / Mausgehirne (P1 / P2), und diese Zellen haben nicht alle Reifungsprozesse durchlaufen, die in vivo auftreten können. (2) Im Kokulturmedium wird 10% FBS verwendet; In vivo begegnen Mikroglia solchen Komponenten jedoch niemals in einer "normalen" Umgebung. (3) Neuere Studien zeigen, dass in vivo Mikroglia durch mehrere hemmende Komponenten zurückgehalten werden, die in der Kultur43,44 nicht vorhanden sind. Darüber hinaus beschrieben viele Studien (elektrophysiologisch45 und Transkriptomik46,47) nicht stimulierte primäre Mikroglia als "aktiviert".
Die vorliegende Methode schlägt eine alternative Technik zur Erzeugung von Mikrogliakulturen unter Verwendung der magnetisch zellsortierten Technologie vor. Mit diesem Protokoll werden Mikroglia nur wenige Stunden nach dem Tod des Tieres ohne Kokulturschritt geerntet. Darüber hinaus werden Mikroglia nur 2 Tage in vitro (DIV) vor der Stimulation kultiviert, verglichen mit 10-14 DIV, einschließlich Co-Kultur in anderen Protokollen. Dies ermöglicht es, sich den physiologischen Bedingungen der Mikroglia anzunähern. Dieses Verfahren der Kultivierung von Mikroglia in vitro wurde zuvor veröffentlicht 25,26,27,28,29. Die aktuelle Arbeit präsentierte ein optimiertes Protokoll für neugeborene Mäuse, standardisiert zur Reduzierung der Anzahl der verwendeten Tiere und ohne Myelinentfernungsschritt.
Um die Anzahl der Mäuse zu reduzieren, die für die primäre Mikrogliakultur verwendet werden, haben wir uns entschieden, bei P8 im OF1-Stamm zu arbeiten. In diesem Stadium der Gehirnentwicklung im OF1-Stamm wurden bis zu 750.000 Mikrogliazellen pro Gehirn erhalten, im Gegensatz zu 500.000 Mikrogliazellen pro C57BL6/J-Stammmausgehirn im gleichen Alter. Der C57BL6/J-Stamm wurde in einem anderen Entwicklungsstadium für die Mikroglia-Kulturveröffentlicht 27,28. Das vorliegende Protokoll wurde auch mit Fmr1KO-Mäusen verwendet, um phagozytische Eigenschaften von Mikroglia zu bewerten, die mit dieser Mutation verbunden sind, und LysMCre: Dicerfl / + Mäuse zur Beurteilung von Mikroglia-Aktivierungsphänotypen mittels RT-qPCR. Daher ist die Arbeit mit dem C57BL/6 J-Mausstamm etwas schwieriger als die Arbeit mit dem OF1-Stamm, da (1) weniger Mikrogliazellen pro Gehirn im gleichen Entwicklungsstadium vorhanden sind und (2) Mikroglia, die aufgrund mechanischer Aktivierung anfälliger zum Absterben neigen, anfälliger sind (siehe Abschnitt Fehlerbehebung).
Abhängig vom Entwicklungsstadium, das für die primäre Mikrogliakultur gewählt wird, muss die Myelinisierung in Betracht gezogen werden, da sie um P5 beginnt. In einer klassischen Mikrogliakultur (bei P0-2) ist die Myelinisierung kein Problem; In anderen veröffentlichten Methoden zur Isolierung von Mikroglia wird Myelin jedoch unter Verwendung des Percoll-Gradienten oder der Anti-Myelin-Antikörper25,26,28,29 entfernt. Im vorliegenden Protokoll werden Tiere bei P8 eingeschläfert, wenn die Myelinisierung bereits begonnen hat; Große Volumina werden zum Spülen von Pellets verwendet, und das neu gebildete Myelin kann ohne zusätzliches Verfahren entfernt werden. Dies kann eine Methode zur Fehlerbehebung sein (siehe Abschnitt Trümmer).
Der Hersteller und die zuvor veröffentlichte mikrogliale magnetische Isolierung verwendeten DMEM F-12-Medien, ergänzt mit 10% FBS - 1% P / S 25,26,27,28,29. Biber et al.42 beschrieben, dass Mikroglia selten in vivo mit Serum in Kontakt kommen. Tatsächlich enthält die extrazelluläre Flüssigkeit des zentralen Nervensystems selten Protein und bioaktive Faktoren29. Aus diesem Grund wird im vorliegenden Protokoll serumfreies Makrophagenmedium (SFM) + 1% P/S verwendet.
Das MACS-Protokoll (Magnetic-activated cell sorting) kann auch postnatale Rattenmikroglia mit einigen Modifikationen isolieren und kultivieren25,29. Ratten-Mikroglia werden tatsächlich mit Microbead-beschichtetem Anti-Ratten-CD11b / c isoliert. Da die Gehirngröße jedoch größer ist als bei P8-Mäusen, sollte nur ein Gehirn pro Dissoziationsröhre und Säule verwendet werden. Mikroglia wurden aus P10-14-Rattengehirnen in zuvor veröffentlichten Protokollen isoliert, einschließlich des Myelinisierungsentfernungsschritts29. Trotz der vorherigen Kommentare zum Kulturmedium werden für die Mikrogliakultur von Ratten F-12-Medien + 10% FBS und 550.000-600.000 Zellen pro 12-Well-Platte für nachgeschaltete Anwendungen empfohlen.
Fehlerbehebung
Dissoziation: Die Dissoziationsmischung wie in Tabelle 1 beschrieben wird für die maximale Menge an Gehirn berechnet, die bei OF1-Mäusen dissoziiert werden kann und bei P8 fortschreitet. Wenn mehr Gehirn hinzugefügt wird, kann die Dissoziation am Ende von Schritt 3.2 nicht abgeschlossen werden, und es wird nicht dissoziiertes Hirngewebe gefunden. In diesem Fall wird empfohlen, das NTDK-Programm auf der Röhre mit nicht dissoziiertem Gewebe auszuführen und die anderen Röhrchen bei 4 °C zu halten.
Verstopftes Sieb und/oder Säule: Wie zuvor beschrieben, wird die Dissoziationsmischung für die maximale Menge an Hirngewebe berechnet, die das Sieb in Schritt 3.5 passieren kann. Wenn mehr Gehirn hinzugefügt wird, kann die Filtration länger dauern, aber schließlich wird es passieren. Es wird empfohlen, die Zellsuspension auf der Oberseite des Siebs vorsichtig zu resuspendieren, bis die gesamte Zellsuspension gefiltert ist.
In Schritt 3.12 muss der Experimentator die markierte Zellsuspension durch eine Säule innerhalb des Magnetfeldes führen. Die Säule kann in diesem Stadium des Verfahrens verstopft sein, (1) wenn zu viel Hirngewebe pro Röhrchen dissoziiert wird, (2) wenn das Resuspensionsvolumen nicht korrekt ist oder (3) wenn ein mechanisch induzierter Zelltod vorliegt (etwas DNA kann vorhanden sein); In diesem Fall wird empfohlen, die sichtbare DNA mit einer 200 μL-Spitze vorsichtig zu entfernen.
Mechanisch induzierter Zelltod und/oder Aktivierung: Das hier beschriebene Protokoll stellt eine wesentliche Herausforderung dar: die Vermeidung mechanischer Aktivierung. Dazu ist es wichtig, schonend zu pipettieren und die Zentrifugationsgeschwindigkeit niedrig zu halten. Wenn nicht, können unreife Mikroglia aufgrund der mechanischen Belastung absterben oder aktiviert werden, was zu einer hohen Variabilität der RT-qPCR-Ergebnisse führt.
Trümmer: Bei diesem Verfahren werden Tiere bei P8 eingeschläfert, wenn die Myelinisierung gerade erst beginnt, und daher gibt es kein Verfahren, um Myelin genau zu entfernen. In diesem Stadium der Entwicklung kann Myelin leicht durch Zentrifugation entfernt werden. Die in diesem Verfahren beschriebenen Resuspensionsvolumina werden berechnet, um das maximale Myelin zu entfernen. Wenn Myelin nicht respektiert wird, könnte es als Zelltrümmer in Kulturtöpfen auftreten. Der Experimentator kann es nicht vollständig entfernen, wenn es in Kulturtöpfen beobachtet wird, indem er das Medium an Tag 2 wechselt. Mikrogliazellen neigen dazu, diese Trümmer zu phagozyten, was den Mikroglia-Aktivierungszustand vor der Stimulation beeinflussen und somit die experimentelle Reproduzierbarkeit beeinträchtigen kann.
Alle zuvor beschriebenen Fehlerbehebungen (Dissoziation, verstopftes Sieb und/oder Säule, mechanisch induzierter Zelltod und/oder -aktivierung und Trümmer) können zu einer Variabilität der Anzahl der CD11b+-Zellen führen, die bei der Zellzählung erhalten werden (Abbildung 5B). Wir empfehlen, darauf zu achten, um die endgültige Zellausbeute zu optimieren.
Kontamination: In diesem Protokoll werden Mikrogliazellen in SFM-Medium + 1% P/S kultiviert. Daher wird empfohlen, das Medium nach Zugabe von P / S in 50-ml-Röhrchen zu aliquotieren, um eine Kontamination des Mediums zu vermeiden. Darüber hinaus müssen alle Experimente so weit wie möglich unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
mRNA-Quantität/-Qualität: Unser Team arbeitet an miRNA- oder siRNA-Transfektionen. Das vorliegende Protokoll ist in hohem Maße kompatibel mit solchen Anwendungen unter Verwendung der magnetischen Transfektion mit einer geringfügigen Änderung des Protokolls; Der Experimentator muss 700.000 Zellen pro 12-Well-Platte ernten, um qualitativ hochwertige mRNA für RT-qPCR zu erhalten. Obwohl RNAseq in der vorliegenden Studie nicht durchgeführt wird, führte unser Team zuvor eine mRNA-Extraktion für RNAseq mit 500.000 Zellen pro 12-Well-Platte48 durch.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll reproduziert werden kann, und es wird erwartet, dass es ein neuer Standard für die Isolierung von Mikroglia in einem juvenilen Entwicklungsstadium sein wird.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Figuren wurden mit BioRender erstellt. Die Forschung wird von Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco und einem zusätzlichen Zuschuss von Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS und Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E. finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti mouse CD11b BV421 | Sony Biotechnology | 1106255 | |
| Anti mouse CD45 BV510 | Sony Biotechnology | 1115690 | |
| Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 | Sony Biotechnology | 1345075 | |
| Anti mouse NeuN PE | Milli-Mark | FCMAB317PE | |
| anti mouse O4 Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-120-016 | |
| BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit | BD Biosciences | 554655 | |
| Bovine Serum Albumin | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Confocal microscope | Leica TCS SP8 | ||
| D-PBS (10x) | Thermo Scientific | 14200067 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | |
| Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353043 | |
| Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353072 | |
| Falcon tubes 50 mL | Dutscher | 352098 | |
| Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) | BD Biosciences | 553142 | |
| Fluorescence microscope | Nikon ECLIPSE TE300 | ||
| gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14065049 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14185045 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-rad | 1725006CUST | |
| Iscript c-DNA synthesis | Bio-rad | 1708890 | |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L2776-1mL | |
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
| Macrophage-SFM serum-free medium | Thermo Scientific | 12065074 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| Mouse IgG1 PE | Millipore | MABC002H | |
| Mouse IgG2a PE Cy7 | Sony Biotechnology | 2601265 | |
| Mouse IL1 beta | Miltenyi Biotec | 130-101-684 | |
| Multi-24 Column Blocks | Miltenyi Biotec | 130-095-691 | |
| MultiMACS Cell24 Separator | Miltenyi Biotec | ||
| Neural Tissue Dissociation Kit - Papain | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| Nucleocounter NC-200 | Chemometec | ||
| Nucleospin RNA Plus XS | Macherey Nagel | 740990.5 | |
| Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Rat IgG2b, k BV421 | BD Biosciences | 562603 | |
| Rat IgG2b, k BV510 | Sony Biotechnology | 2603230 | |
| REA control (S) PE vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-104-616 | |
| REA control (S) Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-113-445 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D System | 485-MI | |
| Recombinant Mouse IL-10 Protein | R&D System | 417-ML | |
| Recombinant Mouse IL-4 Protein | R&D System | 404-ML | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Viability probe (FVS780) | BD Biosciences | 565388 |
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