בדיקה סלולרית מבוססת כתב לניטור יעילות חיבור
Summary
פרוטוקול זה מתאר בדיקה עיתונאית minigene כדי לפקח על ההשפעה של מוטציות באתר 5-splice באתר על חיבור ומפתח מדכא U1 snRNA להצלת עיכוב חיבור המושרה מוטציה. הכתב והמדכא U1 snRNA מבנים באים לידי ביטוי בתאי HeLa, ו splicing מנותח על ידי הרחבת פריימר או RT-PCR.
Abstract
במהלך ביטוי הגנים, השלב החיוני של חיבור טרום mRNA כרוך בזיהוי מדויק של אתרי חיבור והרכבה יעילה של מתחמים spliceosomal להצטרף exons ולהסיר introns לפני ייצוא cytoplasmic של mRNA בוגר. יעילות חיבור יכולה להשתנות על ידי נוכחות של מוטציות באתרי חיבור, ההשפעה של גורמי חיבור טרנס-פעולה, או את הפעילות של טיפולית. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול לבדיקה סלולרית שניתן ליישם לניטור יעילות החיבור של כל אקסון נתון. הבדיקה משתמשת בפלסמיד אדפטיבי המקודד 3-exon/2-intron minigene כתב, אשר יכול לבוא לידי ביטוי בתאי יונקים על ידי טרנספקטיבה חולפת. לאחר ההעברה, הרנ”א התאי הכולל מבודד, והיעילות של חיבור אקסון ב-mRNA הכתב נקבעת על ידי הרחבת פריימר או תגובת שרשרת חצי כמותית הפוכה תמלול-פולימראז (RT-PCR). אנו מתארים כיצד ניתן לקבוע כיצד ניתן לקבוע את ההשפעה של מחלות הקשורות 5′ מוטציות באתר splice-site על ידי הצגתם בכתב; וכיצד ניתן להשיג את הדיכוי של מוטציות אלה על ידי שיתוף טרנספקטיה עם U1 קטן גרעיני RNA (snRNA) לבנות נושא מוטציות מפצות באזור 5 ′ שלה כי basepairs עם אתרי 5 ′-splice בצמתים exon-intron ב pre-mRNAs. לכן, הכתב יכול לשמש לעיצוב של חלקיקי U1 טיפולית כדי לשפר את ההכרה של מוטציה 5′ splice-sites. החדרת אתרים רגולטוריים הפועלים cis- פועל, כגון חיבור משפר או רצפי משתיק קול, לתוך הכתב יכול לשמש גם כדי לבחון את התפקיד של U1 snRNP ברגולציה בתיווך על ידי גורם חיבור חלופי ספציפי. לבסוף, כתב המבטא תאים יכול להיות דגירה עם מולקולות קטנות כדי לקבוע את ההשפעה של טיפוליים פוטנציאליים על חיבור לפני mRNA המכונן או על exons נושא אתרי מוטציה 5 ′ splice. בסך הכל, בדיקת הכתב ניתן ליישם כדי לפקח על יעילות splicing במגוון רחב של תנאים כדי ללמוד מנגנונים חיבור בסיסיים ומחלות הקשורות splicing.
Introduction
חיבור טרום-mRNA הוא שלב עיבוד חיוני שמסיר אינטרונים שאינם מקודדים ובדיוק ליגטות exons קידוד כדי ליצור mRNA בוגר. הכרה ברצפי קונצנזוס בצמתים אקסון-אינטרון, המכונים אתר 5′-splice ואתר 3′-splice, על ידי רכיבים של מכונות החיבור יוזמת את תהליך החיבור. ריבונוקלאופרוטאין גרעיני קטן U1 (snRNP) מזהה את האתר 5′-splice על ידי זיווג בסיס של SnRNA U1 לקדם mRNA1. מוטציות תורשתיות גנטית שמשנות 5′-splice רצפי אתר קשורים למחלות רבות2,3. זה צפוי כי אובדן basepairing של U1 snRNA עם אתרי מוטציה 5′-splice גורם חיבור חריג, אשר יכול לסכן את התרגום של התמליל המושפע. גישה טיפולית פוטנציאלית לתיקון פגמי החיבור כרוכה בדיכוי מוטציות על ידי U1 snRNA שונה הנושא שינויים נוקלאוטידים מפצים באזור 5′שלו כי basepairs עם אתר 5′-splice. כזה שונה U1 snRNAs, המכונה גם exon ספציפי U1 snRNAs, נמצאו יעילים בהיפוך פגמים חיבור, וכתוצאה מכך ביטוי חלבון מוגבר מן mRNA4,5,5,6,7,8.
כאן, אנו מתארים את בדיקת ההשלמה של U1 snRNP, בדיקת חיבור סלולרי המבוססת על כתב המאפשרת הערכה של ההשפעה של מוטציות 5′-ss על חיבור של אקסון וניתן להשתמש בה גם לפיתוח של U1 snRNAs שונה כדי לאפשר את ההצלה של הכללת exon. אנו מספקים גם פרוטוקולים לניטור תמלילי הכתבים המשולבים על ידי הרחבת פריימר ו- RT-PCR, ולקביעת הביטוי של U1 snRNAs שונה על ידי הרחבת פריימר ו- RT-qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
הבדיקה יכולה להיות מותאמת לניתוח חיבור בשורות תאים שאינם HeLa, עם זאת, גורמים המשפיעים על יעילות טרנספקטיה, כגון מפגש תאים וכמות של DNA ייתכן שיהיה צורך אופטימיזציה. יחס מבנה הכתב ל- U1 הוא פרמטר קריטי נוסף שייתכן שיהיה צורך לקבוע בהתאם לרמות הביטוי שנצפו בסוגי תאים אחרים. איכות הרנ”א המופק היא ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי כספים ל- S.S. מהמכונים הלאומיים לבריאות (R21CA170786 ו- R01GM127464) ולאגודה האמריקאית לסרטן (מענק המחקר המוסדי 74-001-34-משמרות המהפכה) ול- S.S. ו- W.M מתוכנית שותפות המחקר בעמק (P1-4009 ו- VRP77). התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.
Materials
| Reagent Grade Deionized Water | ThermoFisher Scientific | 23-751628 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet | Gibco | 12100-046 | |
| Sodium Bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-22 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N | Sigma-Aldrich | S2567-16A | |
| Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0% | ThermoFisher Scientific | A144-500 | |
| Disposable PES Bottle Top Filters | ThermoFisher Scientific | FB12566510 | |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | Amresco | 0105-2.5KG | |
| 2.5% Trypsin (10x), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| Potassium Chloride | Fisher Bioreagent | BP366-1 | |
| Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate | Fisher Bioreagent | BP332-1 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Fisher Bioreagent | BP362-1 | |
| Transfection medium – Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Transfection Reagent – Lipofectamine™ 2000 | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| TRIzol™ Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP1145-1 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2818-4 | |
| Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2618-212 | |
| Glycogen (5 mg/ml) | ThermoFisher Scientific | AM9510 | |
| Direct-zol RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R2052 | |
| ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi | PerkinElmer | NEG035C001MC | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | |
| Size exclusion beands – Sephadex® G-25 | Sigma-Aldrich | G2580-10G | |
| Size exclusion mini columns | USA Scientific | 1415-0600 | |
| pBR322 DNA-MspI Digest | New England Biolabs | N3032S | |
| Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt | Affymetrix | 76410 100 UL | |
| Rnase inactivating reagents – RNaseZAP™ | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | |
| dNTP Mix (10 mM ea) | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
| RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| Reverse Transcriptase – M-MLV Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 28025013 | used for primer extension |
| Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10342020 | |
| Random Hexamers (50 µM) | ThermoFisher Scientific | N8080127 | |
| Real time PCR mix – SYBR™ Select Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4472903 | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080093 | used for cDNA preparation |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| 5X First-Strand Buffer | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| Formamide (≥99.5%) | ThermoFisher Scientific | BP228-100 | Review Material Safety Data Sheets |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma-Aldrich | 114405-5G | |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | |
| Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP168-500 | |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP1406-1 | Review Material Safety Data Sheets |
| Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.) | ThermoFisher Scientific | BP169-212 | |
| Ammonium peroxodisulphate (APS) ≥98%, Pro-Pure, Proteomics Grade | VWR | M133-25G | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ≥99%, Ultrapure | VWR | 0761-25ML | Review Material Safety Data Sheets |
| Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon | VWR | ASG-400 | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm | VWR | NGP-125NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm | VWR | NGP-200NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm | VWR | NGP-400NR | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE28-9564 | |
| Typhoon™ FLA 7000 Biomolecular Imager | GE Healthcare | 28-9610-73 AB | |
| Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter | GMI | 8043-30-1194 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific | ||
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems | ThermoFisher Scientific |
Referências
- Zhuang, Y., Weiner, A. M. A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5′ splice site mutation. Cell. 46 (6), 827-835 (1986).
- Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nature Review Genetics. 17 (1), 19-32 (2016).
- Ward, A. J., Cooper, T. A. The pathobiology of splicing. Journal of Pathology. 220 (2), 152-163 (2010).
- Scalet, D., et al. Disease-causing variants of the conserved +2T of 5′ splice sites can be rescued by engineered U1snRNAs. Human Mutatation. 40 (1), 48-52 (2019).
- Yamazaki, N., et al. Use of modified U1 small nuclear RNA for rescue from exon 7 skipping caused by 5′-splice site mutation of human cathepsin A gene. Gene. 677, 41-48 (2018).
- Yanaizu, M., Sakai, K., Tosaki, Y., Kino, Y., Satoh, J. I. Small nuclear RNA-mediated modulation of splicing reveals a therapeutic strategy for a TREM2 mutation and its post-transcriptional regulation. Science Reports. 8 (1), 6937 (2018).
- Balestra, D., et al. Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130 (2019).
- Donadon, I., et al. Exon-specific U1 snRNAs improve ELP1 exon 20 definition and rescue ELP1 protein expression in a familial dysautonomia mouse model. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2466-2476 (2018).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).
- Dominski, Z., Kole, R. Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons. Molecular Cell Biology. 11 (12), 6075-6083 (1991).
- Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. Exon repression by polypyrimidine tract binding protein. RNA. 11 (5), 699-716 (2005).
- Le Guedard-Mereuze, S., et al. Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites. Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).
- Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly. Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).
- Steitz, J. A., et al. . Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles. , 115-154 (1988).
- Fortes, P., et al. Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5′ end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).
- Roca, X., et al. Widespread recognition of 5′ splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides. Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).
- Roca, X., Krainer, A. R. Recognition of atypical 5′ splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA. Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).
- Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression. Methods. 167, 134-142 (2019).
- Hamid, F. M., Makeyev, E. V. A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).
- Martelly, W., et al. Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing. RNA Biology. , 1-18 (2021).
