Un test cellulare basato su reporter per il monitoraggio dell'efficienza di giunzione
Summary
Questo protocollo descrive un minigene reporter assay per monitorare l’impatto delle mutazioni del sito di giunzione 5′-splicing sullo splicing e sviluppa snRNA U1 soppressore per il salvataggio dell’inibizione dello splicing indotta da mutazioni. I costrutti di snRNA U1 reporter e soppressore sono espressi in cellule HeLa e lo splicing viene analizzato mediante estensione di primer o RT-PCR.
Abstract
Durante l’espressione genica, la fase vitale dello splicing pre-mRNA comporta un riconoscimento accurato dei siti di giunzione e un assemblaggio efficiente di complessi spliceosomiali per unire gli esoni e rimuovere gli introni prima dell’esportazione citoplasmatica dell’mRNA maturo. L’efficienza dello splicing può essere alterata dalla presenza di mutazioni nei siti di giunzione, dall’influenza di fattori di splicing trans-agenti o dall’attività terapeutica. Qui, descriviamo il protocollo per un test cellulare che può essere applicato per monitorare l’efficienza di giunzione di un dato esone. Il test utilizza un reporter minigene plasmidico codificato plasmidico 3-esone/2-introne adattabile, che può essere espresso in cellule di mammifero mediante trasfezione transitoria. Dopo la trasfezione, l’RNA cellulare totale viene isolato e l’efficienza dello splicing dell’esone nell’mRNA reporter è determinata dall’estensione del primer o dalla reazione a catena semi-quantitativa della trascrittasi-polimerasi inversa (RT-PCR). Descriviamo come l’impatto delle mutazioni del sito di giunzione 5′ associate alla malattia può essere determinato introducendole nel reporter; e come la soppressione di queste mutazioni può essere ottenuta mediante co-trasfezione con il piccolo costrutto di RNA nucleare U1 (snRNA) che porta mutazioni compensatorie nella sua regione 5′ che le parti base con i siti di giunzione 5′-giunzione alle giunzioni esone-introne nei pre-mRNA. Pertanto, il reporter può essere utilizzato per la progettazione di particelle U1 terapeutiche per migliorare il riconoscimento dei siti di giunzione 5′ mutanti. L’inserimento di siti regolatori ad azione cis, come il potenziatore di splicing o le sequenze di silenziatori, nel reporter può anche essere utilizzato per esaminare il ruolo dell’U1 snRNP nella regolazione mediata da uno specifico fattore di splicing alternativo. Infine, le cellule che esprimono reporter possono essere incubate con piccole molecole per determinare l’effetto di potenziali terapie sullo splicing costitutivo pre-mRNA o su esoni portatori di siti di giunzione 5′ mutanti. Nel complesso, il test reporter può essere applicato per monitorare l’efficienza dello splicing in una varietà di condizioni per studiare i meccanismi fondamentali di splicing e le malattie associate allo splicing.
Introduction
Lo splicing pre-mRNA è una fase di elaborazione essenziale che rimuove gli introni non codificanti e lega precisamente gli esoni codificanti per formare mRNA maturo. Il riconoscimento delle sequenze di consenso alle giunzioni esone-introne, denominate sito di giunzione 5′ e sito di giunzione 3′, da parte dei componenti del macchinario di giunzione avvia il processo di giunzione. La piccola ribonucleoproteina nucleare U1 (snRNP) riconosce il sito di giunzione 5′ mediante accoppiamento di basi dello snRNA U1 al pre-mRNA1. Le mutazioni geneticamente ereditate che alterano le sequenze del sito di giunzione 5′ sono associate a molte malattie2,3. Si prevede che la perdita di basepairing di SnRNA U1 con i siti mutanti di giunzione 5′ causi uno splicing aberrante, che può compromettere la traduzione del trascritto interessato. Un potenziale approccio terapeutico per correggere i difetti di splicing comporta la soppressione delle mutazioni da parte di snRNA U1 modificato che trasporta cambiamenti nucleotidici compensatori nella sua regione 5′ che le parti base con il sito di giunzione 5′. Tali snRNA U1 modificati, noti anche come snRNA U1 specifici dell’esone, sono risultati efficaci nell’invertire i difetti di splicing, con conseguente aumento dell’espressione proteica dall’mRNA salvato4,5,6,7,8.
Qui, descriviamo il test di complementazione U1 snRNP, un test di splicing cellulare basato su reporter che consente di valutare l’effetto delle mutazioni 5′-ss sullo splicing di un esone e può anche essere utilizzato per lo sviluppo di snRNA U1 modificati per consentire il salvataggio dell’inclusione di esoni. Forniamo anche protocolli per il monitoraggio delle trascrizioni del reporter spliced tramite estensione primer e RT-PCR e per determinare l’espressione di snRNA U1 modificati mediante estensione primer e RT-qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il test può essere adattato per l’analisi di splicing in linee cellulari diverse da HeLa, tuttavia, potrebbe essere necessario ottimizzare i fattori che influenzano l’efficienza della trasfezione, come la confluenza cellulare e la quantità di DNA. Il rapporto tra il costruttore reporter e U1 è un altro parametro critico che potrebbe dover essere determinato in base ai livelli di espressione osservati in altri tipi di cellule. La qualità dell’RNA estratto è fondamentale per l’analisi dello splicing; pertanto, l’uso d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da fondi a S.S. dal National Institutes of Health (R21CA170786 e R01GM127464) e dall’American Cancer Society (Institutional Research Grant 74-001-34-IRG) e a S.S. e W.M. dal Valley Research Partnership Program (P1-4009 e VRP77). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health.
Materials
| Reagent Grade Deionized Water | ThermoFisher Scientific | 23-751628 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet | Gibco | 12100-046 | |
| Sodium Bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-22 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N | Sigma-Aldrich | S2567-16A | |
| Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0% | ThermoFisher Scientific | A144-500 | |
| Disposable PES Bottle Top Filters | ThermoFisher Scientific | FB12566510 | |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | Amresco | 0105-2.5KG | |
| 2.5% Trypsin (10x), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| Potassium Chloride | Fisher Bioreagent | BP366-1 | |
| Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate | Fisher Bioreagent | BP332-1 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Fisher Bioreagent | BP362-1 | |
| Transfection medium – Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Transfection Reagent – Lipofectamine™ 2000 | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| TRIzol™ Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP1145-1 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2818-4 | |
| Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2618-212 | |
| Glycogen (5 mg/ml) | ThermoFisher Scientific | AM9510 | |
| Direct-zol RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R2052 | |
| ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi | PerkinElmer | NEG035C001MC | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | |
| Size exclusion beands – Sephadex® G-25 | Sigma-Aldrich | G2580-10G | |
| Size exclusion mini columns | USA Scientific | 1415-0600 | |
| pBR322 DNA-MspI Digest | New England Biolabs | N3032S | |
| Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt | Affymetrix | 76410 100 UL | |
| Rnase inactivating reagents – RNaseZAP™ | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | |
| dNTP Mix (10 mM ea) | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
| RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| Reverse Transcriptase – M-MLV Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 28025013 | used for primer extension |
| Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10342020 | |
| Random Hexamers (50 µM) | ThermoFisher Scientific | N8080127 | |
| Real time PCR mix – SYBR™ Select Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4472903 | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080093 | used for cDNA preparation |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| 5X First-Strand Buffer | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| Formamide (≥99.5%) | ThermoFisher Scientific | BP228-100 | Review Material Safety Data Sheets |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma-Aldrich | 114405-5G | |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | |
| Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP168-500 | |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP1406-1 | Review Material Safety Data Sheets |
| Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.) | ThermoFisher Scientific | BP169-212 | |
| Ammonium peroxodisulphate (APS) ≥98%, Pro-Pure, Proteomics Grade | VWR | M133-25G | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ≥99%, Ultrapure | VWR | 0761-25ML | Review Material Safety Data Sheets |
| Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon | VWR | ASG-400 | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm | VWR | NGP-125NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm | VWR | NGP-200NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm | VWR | NGP-400NR | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE28-9564 | |
| Typhoon™ FLA 7000 Biomolecular Imager | GE Healthcare | 28-9610-73 AB | |
| Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter | GMI | 8043-30-1194 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific | ||
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems | ThermoFisher Scientific |
Referências
- Zhuang, Y., Weiner, A. M. A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5′ splice site mutation. Cell. 46 (6), 827-835 (1986).
- Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nature Review Genetics. 17 (1), 19-32 (2016).
- Ward, A. J., Cooper, T. A. The pathobiology of splicing. Journal of Pathology. 220 (2), 152-163 (2010).
- Scalet, D., et al. Disease-causing variants of the conserved +2T of 5′ splice sites can be rescued by engineered U1snRNAs. Human Mutatation. 40 (1), 48-52 (2019).
- Yamazaki, N., et al. Use of modified U1 small nuclear RNA for rescue from exon 7 skipping caused by 5′-splice site mutation of human cathepsin A gene. Gene. 677, 41-48 (2018).
- Yanaizu, M., Sakai, K., Tosaki, Y., Kino, Y., Satoh, J. I. Small nuclear RNA-mediated modulation of splicing reveals a therapeutic strategy for a TREM2 mutation and its post-transcriptional regulation. Science Reports. 8 (1), 6937 (2018).
- Balestra, D., et al. Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130 (2019).
- Donadon, I., et al. Exon-specific U1 snRNAs improve ELP1 exon 20 definition and rescue ELP1 protein expression in a familial dysautonomia mouse model. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2466-2476 (2018).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).
- Dominski, Z., Kole, R. Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons. Molecular Cell Biology. 11 (12), 6075-6083 (1991).
- Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. Exon repression by polypyrimidine tract binding protein. RNA. 11 (5), 699-716 (2005).
- Le Guedard-Mereuze, S., et al. Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites. Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).
- Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly. Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).
- Steitz, J. A., et al. . Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles. , 115-154 (1988).
- Fortes, P., et al. Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5′ end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).
- Roca, X., et al. Widespread recognition of 5′ splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides. Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).
- Roca, X., Krainer, A. R. Recognition of atypical 5′ splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA. Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).
- Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression. Methods. 167, 134-142 (2019).
- Hamid, F. M., Makeyev, E. V. A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).
- Martelly, W., et al. Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing. RNA Biology. , 1-18 (2021).
