Репортерный клеточный анализ для мониторинга эффективности сплайсинга
Summary
Этот протокол описывает минигенный репортерный анализ для мониторинга влияния мутаций 5-образного сайта сращивания на сплайсинг и разрабатывает супрессор U1 snRNA для спасения ингибирования сплайсинга, вызванного мутациями. Конструкции репортера и супрессора U1 snRNA экспрессируются в клетках HeLa, а сплайсинг анализируется путем праймерного расширения или ОТ-ПЦР.
Abstract
Во время экспрессии генов жизненно важный этап сплайсинга пре-мРНК включает в себя точное распознавание участков сращивания и эффективную сборку сплайсеосомальных комплексов для соединения экзонов и удаления интронов до цитоплазматического экспорта зрелой мРНК. Эффективность сплайсинга может быть изменена наличием мутаций в местах сращивания, влиянием транс-действующих факторов сплайсинга или активностью терапевтических средств. Здесь мы описываем протокол для клеточного анализа, который может быть применен для мониторинга эффективности сплайсинга любого данного экзона. В анализе используется адаптируемый плазмидный закодированный 3-экзон/2-интронный минигенный репортер, который может быть экспрессирован в клетках млекопитающих путем транзиторной трансфекции. После трансфекции выделяют общую клеточную РНК, а эффективность сплайсинга экзонов в репортерной мРНК определяют либо расширением праймера, либо полуколичественной обратной транскриптазно-полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР). Мы описываем, как влияние связанных с заболеванием 5′ мутаций сращивания может быть определено путем введения их в репортер; и как подавление этих мутаций может быть достигнуто путем совместной трансфекции с конструкцией малой ядерной РНК (snRNA) U1, несущей компенсаторные мутации в ее 5′-области, которая базирует пары с 5′-сращивающимися участками на экзон-интронных переходах в премРНК. Таким образом, репортер может быть использован для проектирования терапевтических частиц U1 для улучшения распознавания мутантных 5′ сращивающихся сайтов. Вставка цис-действующих регуляторных сайтов, таких как последовательности усилителя сращивания или глушителя, в репортер также может быть использована для изучения роли U1 snRNP в регулировании, опосредованном конкретным альтернативным фактором сплайсинга. Наконец, репортерные экспрессирующие клетки могут быть инкубированы с небольшими молекулами для определения влияния потенциальных терапевтических средств на конститутивное сплайсинг пре-мРНК или на экзоны, несущие мутантные 5′ места сращивания. В целом, репортерный анализ может быть применен для мониторинга эффективности сплайсинга в различных условиях для изучения фундаментальных механизмов сплайсинга и заболеваний, связанных со сплайсингом.
Introduction
Сплайсинг пре-мРНК является важным этапом обработки, который удаляет некодирующие интроны и точно кодирует кодирующие экзоны для формирования зрелой мРНК. Распознавание консенсусных последовательностей на экзон-интронных переходах, называемых 5‘-сращивающим участком и 3‘-сращивающим участком, компонентами сращивающего механизма инициирует процесс сращивания. Малый ядерный рибонуклеопротеин U1 (snRNP) распознает сайт 5‘-сращивания путем спаривания основания snRNA U1 с пре-mRNA1. Генетически унаследованные мутации, которые изменяют последовательности 5‘-сращивания, связаны со многими заболеваниями2,3. Прогнозируется, что потеря парировки основания snRNA U1 с мутантными 5‘-сращивающими сайтами вызывает аберрантное сплайсинг, что может поставить под угрозу трансляцию пораженного транскрипта. Потенциальный терапевтический подход к исправлению дефектов сплайсинга включает подавление мутаций модифицированной U1 snRNA, несущей компенсаторные нуклеотидные изменения в своей 5‘-области, которая имеет основания с 5‘-сращенным участком. Было обнаружено, что такие модифицированные U1 snRNAs, также называемые экзон-специфическими U1 snRNAs, эффективны в обращении вспять дефектов сплайсинга, что приводит к увеличению экспрессии белка из спасенной мРНК4,5,6,7,8.
Здесь мы описываем анализ комплементации U1 snRNP, основанный на репортерах клеточный сплайсинг, который позволяет оценить влияние мутаций 5’ss на сплайсинг экзона, а также может быть использован для разработки модифицированных U1 snRNAs для спасения включения экзонов. Мы также предоставляем протоколы для мониторинга сращенных репортерных транскриптов с помощью праймерного расширения и ОТ-ПЦР, а также для определения экспрессии модифицированных snRNAs U1 с помощью праймерного расширения и RT-qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ может быть адаптирован для анализа сплайсинга в клеточных линиях, отличных от HeLa, однако факторы, влияющие на эффективность трансфекции, такие как клеточная конфузия и количество ДНК, возможно, потребуется оптимизировать. Отношение репортера к конструкции U1 является еще одним к…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана фондами S.S. от Национальных институтов здравоохранения (R21CA170786 и R01GM127464) и Американского онкологического общества (грант на институциональные исследования 74-001-34-IRG), а также S.S. и W.M. от Valley Research Partnership Program (P1-4009 и VRP77). Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.
Materials
| Reagent Grade Deionized Water | ThermoFisher Scientific | 23-751628 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet | Gibco | 12100-046 | |
| Sodium Bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-22 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N | Sigma-Aldrich | S2567-16A | |
| Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0% | ThermoFisher Scientific | A144-500 | |
| Disposable PES Bottle Top Filters | ThermoFisher Scientific | FB12566510 | |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | Amresco | 0105-2.5KG | |
| 2.5% Trypsin (10x), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| Potassium Chloride | Fisher Bioreagent | BP366-1 | |
| Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate | Fisher Bioreagent | BP332-1 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Fisher Bioreagent | BP362-1 | |
| Transfection medium – Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Transfection Reagent – Lipofectamine™ 2000 | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| TRIzol™ Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP1145-1 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2818-4 | |
| Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2618-212 | |
| Glycogen (5 mg/ml) | ThermoFisher Scientific | AM9510 | |
| Direct-zol RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R2052 | |
| ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi | PerkinElmer | NEG035C001MC | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | |
| Size exclusion beands – Sephadex® G-25 | Sigma-Aldrich | G2580-10G | |
| Size exclusion mini columns | USA Scientific | 1415-0600 | |
| pBR322 DNA-MspI Digest | New England Biolabs | N3032S | |
| Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt | Affymetrix | 76410 100 UL | |
| Rnase inactivating reagents – RNaseZAP™ | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | |
| dNTP Mix (10 mM ea) | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
| RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| Reverse Transcriptase – M-MLV Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 28025013 | used for primer extension |
| Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10342020 | |
| Random Hexamers (50 µM) | ThermoFisher Scientific | N8080127 | |
| Real time PCR mix – SYBR™ Select Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4472903 | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080093 | used for cDNA preparation |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| 5X First-Strand Buffer | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| Formamide (≥99.5%) | ThermoFisher Scientific | BP228-100 | Review Material Safety Data Sheets |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma-Aldrich | 114405-5G | |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | |
| Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP168-500 | |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP1406-1 | Review Material Safety Data Sheets |
| Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.) | ThermoFisher Scientific | BP169-212 | |
| Ammonium peroxodisulphate (APS) ≥98%, Pro-Pure, Proteomics Grade | VWR | M133-25G | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ≥99%, Ultrapure | VWR | 0761-25ML | Review Material Safety Data Sheets |
| Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon | VWR | ASG-400 | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm | VWR | NGP-125NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm | VWR | NGP-200NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm | VWR | NGP-400NR | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE28-9564 | |
| Typhoon™ FLA 7000 Biomolecular Imager | GE Healthcare | 28-9610-73 AB | |
| Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter | GMI | 8043-30-1194 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific | ||
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems | ThermoFisher Scientific |
Referências
- Zhuang, Y., Weiner, A. M. A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5′ splice site mutation. Cell. 46 (6), 827-835 (1986).
- Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nature Review Genetics. 17 (1), 19-32 (2016).
- Ward, A. J., Cooper, T. A. The pathobiology of splicing. Journal of Pathology. 220 (2), 152-163 (2010).
- Scalet, D., et al. Disease-causing variants of the conserved +2T of 5′ splice sites can be rescued by engineered U1snRNAs. Human Mutatation. 40 (1), 48-52 (2019).
- Yamazaki, N., et al. Use of modified U1 small nuclear RNA for rescue from exon 7 skipping caused by 5′-splice site mutation of human cathepsin A gene. Gene. 677, 41-48 (2018).
- Yanaizu, M., Sakai, K., Tosaki, Y., Kino, Y., Satoh, J. I. Small nuclear RNA-mediated modulation of splicing reveals a therapeutic strategy for a TREM2 mutation and its post-transcriptional regulation. Science Reports. 8 (1), 6937 (2018).
- Balestra, D., et al. Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130 (2019).
- Donadon, I., et al. Exon-specific U1 snRNAs improve ELP1 exon 20 definition and rescue ELP1 protein expression in a familial dysautonomia mouse model. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2466-2476 (2018).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).
- Dominski, Z., Kole, R. Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons. Molecular Cell Biology. 11 (12), 6075-6083 (1991).
- Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. Exon repression by polypyrimidine tract binding protein. RNA. 11 (5), 699-716 (2005).
- Le Guedard-Mereuze, S., et al. Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites. Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).
- Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly. Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).
- Steitz, J. A., et al. . Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles. , 115-154 (1988).
- Fortes, P., et al. Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5′ end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).
- Roca, X., et al. Widespread recognition of 5′ splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides. Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).
- Roca, X., Krainer, A. R. Recognition of atypical 5′ splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA. Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).
- Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression. Methods. 167, 134-142 (2019).
- Hamid, F. M., Makeyev, E. V. A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).
- Martelly, W., et al. Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing. RNA Biology. , 1-18 (2021).
