En reporterbasert mobilanalyse for overvåking av skjøteeffektivitet
Summary
Denne protokollen beskriver en minigene reporteranalyse for å overvåke virkningen av 5′-spleisestedmutasjoner på skjøting og utvikler undertrykkeren U1 snRNA for redning av mutasjonsindusert skjøtehemming. Reporteren og undertrykkeren U1 snRNA-konstruksjoner uttrykkes i HeLa-celler, og skjøting analyseres av primerutvidelse eller RT-PCR.
Abstract
Under genuttrykk innebærer det viktige trinnet for pre-mRNA-skjøting nøyaktig anerkjennelse av skjøteplasser og effektiv montering av skjøteosomale komplekser for å bli med i eksoner og fjerne introner før cytoplasmatisk eksport av den modne mRNA. Skjøteeffektivitet kan endres ved tilstedeværelse av mutasjoner på skjøteplasser, påvirkning av transvirkende skjøtefaktorer eller aktiviteten til terapeutiske stoffer. Her beskriver vi protokollen for en cellulær analyse som kan brukes til å overvåke skjøteeffektiviteten til en gitt exon. Analysen bruker en tilpasningsdyktig plasmidkodet 3-exon/2-intron minigene reporter, som kan uttrykkes i pattedyrceller ved forbigående transfeksjon. Etter transfeksjon er total cellulær RNA isolert, og effektiviteten av exon skjøting i reporter mRNA bestemmes av enten primer forlengelse eller semi-kvantitativ omvendt transcriptase-polymerase kjedereaksjon (RT-PCR). Vi beskriver hvordan virkningen av sykdom assosiert 5′ skjøte-området mutasjoner kan bestemmes ved å introdusere dem i reporteren; og hvordan undertrykkelsen av disse mutasjonene kan oppnås ved samtransfeksjon med U1 liten kjernefysisk RNA (snRNA) konstruere bærer kompensatoriske mutasjoner i sin 5′ region som basepairs med 5′-spleise steder på exon-intron veikryss i pre-mRNAs. Dermed kan reporteren brukes til utformingen av terapeutiske U1 partikler for å forbedre anerkjennelsen av mutant 5′ skjøte-nettsteder. Innsetting av cis-fungerende regulatoriske nettsteder, for eksempel spleiseforsterker eller lyddempersekvenser, i reporteren kan også brukes til å undersøke rollen til U1 snRNP i regulering formidlet av en bestemt alternativ skjøtefaktor. Til slutt, reporter uttrykker celler kan inkuberes med små molekyler for å bestemme effekten av potensielle terapeutiske på konstitutive pre-mRNA skjøting eller på exons bærer mutant 5′ skjøte steder. Totalt sett kan reporteranalysen brukes til å overvåke skjøteeffektivitet under en rekke forhold for å studere grunnleggende skjøtemekanismer og skjøterelaterte sykdommer.
Introduction
Pre-mRNA skjøting er et viktig behandlingstrinn som fjerner ikke-koding introner og nøyaktig ligates koding exons å danne modne mRNA. Anerkjennelse av konsensussekvenser ved ekson-intronkryss, referert til som 5′-skjøte sted og 3′-skjøte sted, av komponenter i skjøtemaskineriene initierer skjøteprosessen. U1 liten kjernefysisk ribonucleoprotein (snRNP) gjenkjenner 5′-spleise stedet ved base paring av U1 snRNA til pre-mRNA1. Genetisk arvelige mutasjoner som endrer 5′-spleise sted sekvenser er forbundet med mange sykdommer2,3. Det er spådd at tapet av basepairing av U1 snRNA med mutant 5′-spleise nettsteder forårsaker avvikende skjøting, noe som kan kompromittere oversettelsen av den berørte transkripsjonen. En potensiell terapeutisk tilnærming for å korrigere skjøtefeil innebærer undertrykkelse av mutasjoner ved modifisert U1 snRNA bærer kompenserende nukleotid endringer i sin 5′-region som basepairs med 5′-spleise stedet. Slike modifiserte U1 snRNAer, også referert til som exon spesifikke U1 snRNAs, har vist seg å være effektive i reversering skjøtefeil, noe som resulterer i økt proteinuttrykk fra den reddet mRNA4,5,6,7,8.
Her beskriver vi U1 snRNP komplementeringsanalyse, en reporterbasert cellulær skjøteanalyse som tillater vurdering av effekten av 5′-ss mutasjoner på skjøting av en exon og kan også brukes til utvikling av modifiserte U1 snRNAer for å muliggjøre redning av exon inkludering. Vi tilbyr også protokoller for overvåking av skjøtede reporterutskrifter ved primerutvidelse og RT-PCR, og for å bestemme uttrykket for modifiserte U1 snRNAer ved primerutvidelse og RT-qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analysen kan tilpasses for skjøteanalyse i andre cellelinjer enn HeLa, men faktorer som påvirker transfeksjonseffektiviteten, for eksempel cellesammenstrømning og mengde DNA, må kanskje optimaliseres. Konstruereforholdet mellom reporter og U1 er en annen kritisk parameter som kanskje må bestemmes avhengig av uttrykksnivåene som observeres i andre celletyper. Kvaliteten på ekstrahert RNA er avgjørende for skjøteanalyse; Derfor anbefales bruk av RNase-fritt vann og dekontaminering av overflater med RNase inaktiver…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av midler til S.S. fra National Institutes of Health (R21CA170786 og R01GM127464) og American Cancer Society (Institutional Research Grant 74-001-34-IRG) og til S.S. og W.M. fra Valley Research Partnership Program (P1-4009 og VRP77). Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health.
Materials
| Reagent Grade Deionized Water | ThermoFisher Scientific | 23-751628 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet | Gibco | 12100-046 | |
| Sodium Bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-22 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N | Sigma-Aldrich | S2567-16A | |
| Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0% | ThermoFisher Scientific | A144-500 | |
| Disposable PES Bottle Top Filters | ThermoFisher Scientific | FB12566510 | |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | Amresco | 0105-2.5KG | |
| 2.5% Trypsin (10x), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| Potassium Chloride | Fisher Bioreagent | BP366-1 | |
| Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate | Fisher Bioreagent | BP332-1 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Fisher Bioreagent | BP362-1 | |
| Transfection medium – Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Transfection Reagent – Lipofectamine™ 2000 | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| TRIzol™ Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP1145-1 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2818-4 | |
| Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2618-212 | |
| Glycogen (5 mg/ml) | ThermoFisher Scientific | AM9510 | |
| Direct-zol RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R2052 | |
| ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi | PerkinElmer | NEG035C001MC | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | |
| Size exclusion beands – Sephadex® G-25 | Sigma-Aldrich | G2580-10G | |
| Size exclusion mini columns | USA Scientific | 1415-0600 | |
| pBR322 DNA-MspI Digest | New England Biolabs | N3032S | |
| Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt | Affymetrix | 76410 100 UL | |
| Rnase inactivating reagents – RNaseZAP™ | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | |
| dNTP Mix (10 mM ea) | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
| RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| Reverse Transcriptase – M-MLV Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 28025013 | used for primer extension |
| Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10342020 | |
| Random Hexamers (50 µM) | ThermoFisher Scientific | N8080127 | |
| Real time PCR mix – SYBR™ Select Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4472903 | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080093 | used for cDNA preparation |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| 5X First-Strand Buffer | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| Formamide (≥99.5%) | ThermoFisher Scientific | BP228-100 | Review Material Safety Data Sheets |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma-Aldrich | 114405-5G | |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | |
| Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP168-500 | |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP1406-1 | Review Material Safety Data Sheets |
| Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.) | ThermoFisher Scientific | BP169-212 | |
| Ammonium peroxodisulphate (APS) ≥98%, Pro-Pure, Proteomics Grade | VWR | M133-25G | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ≥99%, Ultrapure | VWR | 0761-25ML | Review Material Safety Data Sheets |
| Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon | VWR | ASG-400 | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm | VWR | NGP-125NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm | VWR | NGP-200NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm | VWR | NGP-400NR | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE28-9564 | |
| Typhoon™ FLA 7000 Biomolecular Imager | GE Healthcare | 28-9610-73 AB | |
| Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter | GMI | 8043-30-1194 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific | ||
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems | ThermoFisher Scientific |
Referências
- Zhuang, Y., Weiner, A. M. A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5′ splice site mutation. Cell. 46 (6), 827-835 (1986).
- Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nature Review Genetics. 17 (1), 19-32 (2016).
- Ward, A. J., Cooper, T. A. The pathobiology of splicing. Journal of Pathology. 220 (2), 152-163 (2010).
- Scalet, D., et al. Disease-causing variants of the conserved +2T of 5′ splice sites can be rescued by engineered U1snRNAs. Human Mutatation. 40 (1), 48-52 (2019).
- Yamazaki, N., et al. Use of modified U1 small nuclear RNA for rescue from exon 7 skipping caused by 5′-splice site mutation of human cathepsin A gene. Gene. 677, 41-48 (2018).
- Yanaizu, M., Sakai, K., Tosaki, Y., Kino, Y., Satoh, J. I. Small nuclear RNA-mediated modulation of splicing reveals a therapeutic strategy for a TREM2 mutation and its post-transcriptional regulation. Science Reports. 8 (1), 6937 (2018).
- Balestra, D., et al. Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130 (2019).
- Donadon, I., et al. Exon-specific U1 snRNAs improve ELP1 exon 20 definition and rescue ELP1 protein expression in a familial dysautonomia mouse model. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2466-2476 (2018).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).
- Dominski, Z., Kole, R. Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons. Molecular Cell Biology. 11 (12), 6075-6083 (1991).
- Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. Exon repression by polypyrimidine tract binding protein. RNA. 11 (5), 699-716 (2005).
- Le Guedard-Mereuze, S., et al. Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites. Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).
- Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly. Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).
- Steitz, J. A., et al. . Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles. , 115-154 (1988).
- Fortes, P., et al. Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5′ end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).
- Roca, X., et al. Widespread recognition of 5′ splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides. Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).
- Roca, X., Krainer, A. R. Recognition of atypical 5′ splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA. Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).
- Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression. Methods. 167, 134-142 (2019).
- Hamid, F. M., Makeyev, E. V. A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).
- Martelly, W., et al. Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing. RNA Biology. , 1-18 (2021).
