用于细菌筛选、选择和分离的可光降解水凝胶接口

Summary

据报道，使用光降解水凝胶通过高分辨率光拍工具分离细菌细胞。回顾了该过程的基本实验程序，结果和优点。该方法可以快速、廉价地分离出来自异质群落或种群的具有罕见或独特功能的靶向细菌。

Abstract

生物学家长期以来一直试图了解表型和基因型之间的关系。为了更好地理解这种联系，开发实用技术至关重要，该技术将微观细胞筛选与高纯度的细胞分离相结合，以进行下游遗传分析。在这里，描述了使用可光降解的聚（乙二醇）水凝胶来筛选和分离来自异质细胞群的具有独特生长表型的细菌。该方法依赖于用水凝胶封装或包埋细胞，然后进行培养，显微镜筛选，然后使用高分辨率光图案化工具进行时空控制水凝胶降解并将所选细胞释放到溶液中进行检索。应用不同的光模式可以控制提取细胞的形态，并且环或交叉等模式可用于以最小的直接紫外线照射检索细胞，以减轻DNA对分离株的损伤。此外，光图案化工具提供可调节的光剂量，以实现各种降解和细胞释放速率。它允许以高分辨率降解，从而能够以微米级的空间精度进行细胞检索。在这里，演示了使用这种材料来筛选和检索来自散装水凝胶和微加工芯片实验室设备的细菌。该方法价格低廉，简单，可用于微生物学中的常见和新兴应用，包括从突变文库中分离具有罕见生长谱的细菌菌株，以及分离具有新兴表型的细菌联盟以进行基因组表征。

Introduction

从复杂和异质的环境中分离具有独特行为的细胞是获得生物学遗传信息的基础^1。在微生物学中，观察后稀有或独特微生物的选择和分离在许多需要基因组信息和可观察表型信息之间连接的应用中变得非常重要。这些应用包括从突变文库²中选择表型罕见的菌株，从复杂的微生物群落^3，4中选择关键微生物^，以及从等基因群体中选择表型罕见但重要的细菌。从细菌群体中分离出可存活但不可培养的细胞（VBNC）是后者的一个重要例子，其中具有VBNC表型的细胞通常以1：10²至1：10⁵的比例隐藏在细菌群体中^5，6。由于细菌分离的广泛困难，许多表型罕见的微生物仍然未知。这些局限性强调了细胞分离技术的必要性，即首先从混合物中鉴定出一个或多个目标细胞，然后检索并分离它们以进行下游分子分析^7。

一些最常用的细胞分离方法包括流式细胞术和荧光活化细胞分选（FACS）8，免疫磁性分离^9，10和微流体^11。虽然这些隔离方法具有很高的价值，但它们也有限制其使用的缺点。例如，FACS可以在单细胞水平上为后续基因组分析提供常规微生物分离^3，但通常受到其可用性和费用以及下游污染问题^{的限制11。}基于微流体的方法，如微流体流式细胞术已经引起了很多关注，与传统的流式细胞术相比，它允许显着减少所需的样品体积¹²。然而，从微流体装置中分离和检索单个或少量细胞集合通常是一个具有挑战性的问题，通常需要更复杂的设置和装置设计^13。许多基于微流体的方法在细胞被输入和观察之前在装置¹⁴中对细胞进行遗传表征，限制了在进行功能筛选时观察到的独特物种的数量。鉴于这些局限性，许多实验室需要进一步创新对细胞筛选和分离具有实用性的方法和材料。

本文提出了一种新的、基于材料的细菌筛选和分离方法。该方法使用可光降解的水凝胶进行细胞封装，培养，显微镜观察以及按需释放和回收具有独特表型的目标细菌。水凝胶被设计为包含10nm的目尺寸，其中每个交联含有15个o-硝基苄基。该材料封装或捕获细胞以进行观察，同时使营养物质和废物能够扩散到细胞中或从细胞中扩散以进行培养。通过正置显微镜将材料暴露于图案化的365nm紫外光源下，可以通过邻硝基苄基^团16，17的光清除使水凝胶的局部降解。降解触发细胞的选择性释放，用于下游分析的回收，包括基因组学，以及潜在的蛋白质组学和转录组学分析。实验设置和方案相对简单，便宜，并且可以转化为微生物学实验室。它只需要通过水凝胶形成进行细胞封装，用直立的明场和荧光显微镜观察捕获的细胞，以及用图案化的UV光源照射感兴趣的细胞以进行检索。

这种基于材料的筛选方法的一个关键优点是它对不同筛选格式的适应性。在其最基本的格式中，该材料可以通过将异质细胞集合封装在散装水凝胶中来用于筛选。然后观察细胞的所需表型，并去除感兴趣的单个细胞以进行基因组表征。在更复杂的格式中，材料还可以集成到芯片实验室设备中，以提供精确的细胞释放和从设备所需区域的检索。这里描述了这两种格式，并且都使最近的新型微生物筛选和选择应用^{成为可能17，18，19。}该方法在这里用模式革兰氏阴性生物（大肠杆菌，根瘤菌）和革兰氏阳性生物（枯草芽孢杆菌）来证明，并且很容易扩展到各种其他细菌。

Protocol

1. 细菌菌株和培养方案 补充有适当生长培养基的琼脂平板上的细菌条纹菌落。在本报告中，枯草芽孢杆菌（菌株1A1135，芽孢杆菌遗传储备中心）在ATGN上培养（0.079 M KH2PO4，0.015M（NH4）2SO4，0.6 mM MgSO4·7H2O，0.06 mM CaCl2·2H2O，0.0071 mM MnSO4·H2O， 0.125 M FeSO4·7H2O，28 mM葡萄糖，pH：7 ±0.2，15 g / L琼脂）琼脂平板，补充有100μg/ mL大观霉素和大肠杆菌（菌株25922，ATCC）在补充100μg/ mL氨苄西林的ATGN琼脂平板上。注意：先前关于水凝胶封装和释放来自Fattahi等人的这些材料的报道19 改用 A. tumefaciens C58细胞 从ATGN琼脂平板中挑选所需的菌落并开始过夜培养。对于这里使用的 大肠杆菌 和 枯草芽孢杆菌 菌株，在37°C下培养，同时在ATGN液体培养基中以215rpm振荡24小时。将细胞培养物储存在-80°C的50%甘油中，直到将来使用。 使用无菌接种回路从甘油储备中挑选两种菌株的菌落，并在ATGN液体培养基中以37°C和215rpm孵育24小时。 2. 水凝胶形成所需材料的制备 可光降解的PEG-o-NB-二丙烯酸酯合成注：PEG-o-NB-二丙烯酸酯的内部合成已经得到了很好的描述，并且之前报道过16，17。或者，由于合成是常规的，因此可以从化学合成设施外包。 交联缓冲液 取所选细菌菌株培养基的配方，并用2倍营养素制备培养基。向培养基中加入磷酸盐，例如NaH2PO4， 至终浓度为100mM。然后，使用5 M NaOH（aq）将pH值调节至8。 灭菌缓冲溶液并将其储存在-20°C直至进一步使用。注意：不要在介质中存在任何过渡金属，因为这些金属催化硫醇氧化成二硫化物。 PEG-O-NB-二丙烯酸酯溶液 对于每毫克等分试样的PEG-o-NB-二丙烯酸酯（分子量为3，400 Da）粉末，加入3.08μL超纯水以达到49mM浓度的PEG-o-NB-二丙烯酸酯（98mM丙烯酸酯浓度）。 涡旋溶液直至充分混合，并将该溶液储存在-20°C直至进一步使用。 4臂聚乙二醇硫醇溶液 对于4臂PEG硫醇（分子量为10，000 Da）的制备，每mg粉末加入4μL超纯水以达到20mM浓度（80mM硫醇浓度）。 涡旋该溶液直至充分混合，并将该溶液储存在-20°C直至进一步使用。 3. 全氟烷基化（非反应性）盖玻片的制备 将最多 5 个载玻片 （25 mm x 75 mm x 1 mm） 放入聚丙烯载玻片邮件中。用2%（w / v）洗涤剂溶液（材料表）超声处理载玻片20分钟。 用超纯水冲洗载玻片三次，然后将载玻片在水中超声处理20分钟。使用N2流干燥载玻片。 等离子体清洁（ 见材料表）根据第4.1节中的协议在载玻片的两侧进行2分钟。 将等离子清洗的载玻片放回载玻片邮件中，并在容器中加入甲苯中0.5%（v / v）三氯（1H，1H，2H，-全氟辛基）硅烷溶液。让这些载玻片在室温（RT）下功能化3小时。 载玻片功能化后，在载玻片邮寄器内冲洗载玻片，首先用甲苯冲洗，然后用乙醇冲洗（用每种溶剂冲洗三次）。接下来，用N2流干燥每个功能化的载玻片。 4. 硫醇官能化（碱）盖玻片的制备 使用等离子清洗机清洁玻璃盖玻片 将 18 mm x 18 mm 盖玻片放入培养皿中。然后，将培养皿放入等离子清洗器室中，并打开等离子清洗机的电源。 打开真空泵以清除腔室内的空气，直到压力表读数为400 mTorr。 打开计量阀，让空气进入腔室，直到压力表达到稳定压力（800-1000 mTorr）。然后，选择具有”Hi”模式的RF并曝光盖玻片3分钟。 3分钟后，关闭射频模式和真空泵。 将培养皿从腔室中取出，翻转盖玻片，然后将其放回腔室中，以等离子暴露玻璃盖玻片的另一侧。 重复步骤4.1.2-4.1.4，用等离子体清洁玻璃盖玻片的未处理侧。 完成该过程后，从腔室中取出培养皿，然后关闭等离子清洗机和真空泵。 用食人鱼溶液清洁和羟基化盖玻片注意：标准食人鱼清洁规程可用于清洁和羟基化玻璃胶片。食人鱼溶液是H2O 2和H 2 SO4的30：70（v / v）混合物。 也可以使用清洁玻璃盖玻片的替代方法。注意：食人鱼溶液具有很强的腐蚀性和有机溶剂的爆炸性，应极其谨慎地处理。应采取适当的安全和遏制措施，例如使用适当的个人防护装备（实验室外套、耐化学腐蚀围裙、安全眼镜、面罩、耐酸丁基手套）。所有与食人鱼溶液接触的玻璃器皿和工作表面在使用前应清洁，干燥且无有机残留物。食人鱼溶液不应储存在部分封闭或封闭的容器中。 将干净的100 mm x 50 mm玻璃盘放在通风橱下搅拌速度可调的电炉磁力搅拌器上，然后向培养皿中加入14 mL H2SO4。 使用特氟龙涂层的镊子轻轻地将一个小的，特氟龙涂层的磁性搅拌棒放在盘子内。然后，缓慢转动搅拌器，以避免酸溅起。 接下来，轻轻地将6毫升H2O2 加入培养皿中，让溶液充分混合。 关闭搅拌器，然后使用镊子将搅拌棒从培养皿中取出。接下来，使用镊子轻轻地将盖玻片放入培养皿内，并将温度设置为60-80°C。 30分钟后，使用镊子轻轻取出盖玻片，并将其浸没在去离子水（DI）水中两次，以洗掉残留的食人鱼溶液。 用水冲洗后，将盖玻片存放在室温下的去离子水中，直至进一步使用。 关闭电炉，让食人鱼溶液冷却。 要处理食人鱼溶液，轻轻地将装有冷却食人鱼溶液的100 mm x 50 mm玻璃盘放入体积至少为1.5 L的较大空玻璃烧杯中。然后加入1L水稀释，加入碳酸氢钠粉末中和。请注意，碳酸氢钠会引起起泡和发热，应非常缓慢地添加，否则冒泡可能会导致酸飞溅。当进一步添加碳酸氢钠不会引起冒泡时，请用pH纸检查pH值，以验证其已被中和。一旦溶液被中和和冷却，就可以将其倒入水槽中。 盖玻片的硫醇功能化 在干甲苯中制备5%（v / v）269mM（3-巯基丙基）三甲氧基硅烷（MPTS）溶液。 将10mL溶液加入单独的50mL锥形离心管中，并在每个管中放置一个清洁的盖玻片并将其浸入溶液中。注：每50 mL管使用一个盖玻片，以确保底物两侧的硫化，而不会受到其他基材的干扰。 4小时后，用甲苯，1：1（v / v）乙醇：甲苯混合物和乙醇洗涤每个盖玻片（每个盖玻片四次洗涤）。注意：这是通过将每个盖玻片依次浸入含有上述溶液的锥形离心管中来完成的。 冲洗底物后，将它们浸没在乙醇中并储存在4°C直至进一步使用。注意：根据盖玻片的数量，由于一次处理一个盖玻片，此方法可能会变得费力。对于多个盖玻片，可以使用同时适合多个盖玻片的哥伦比亚罐。 5. 硅微孔阵列的制造 聚对二甲苯涂层：使用先前研究文章20，21中描述的标准方案用聚对二甲苯涂覆硅片。 微细加工：遵循Barua等人18描述的协议来设计和制造微孔阵列（补充图1）。注：Timm等人描述的标准光刻技术17 应用于在聚对二甲苯涂层硅晶片上制造微孔阵列。 6. 水凝胶形成 在玻璃盖玻片上形成体水凝胶 水凝胶前体溶液：将12.5μL交联缓冲液加入0.5mL微量离心管中，然后加入5.6μLPEG-o-NB-二丙烯酸酯溶液。最后，向混合物中加入6.9μL4臂PEG硫醇溶液。注意：将4臂PEG硫醇加入混合物中可引发交联反应。因此，水凝胶前体溶液应在混合后立即使用。 对于水凝胶前体溶液中的细胞封装，请遵循步骤6.1.3-6.1.9。 对于细胞封装，在步骤6.1.1之前，接种具有所需细胞密度的交联缓冲液。如前所述，19，观察到交联缓冲液中7.26×107 CFU / mL的细胞密度与包封在水凝胶上的约90个细胞/ mm2 的密度相关。 将硫化基盖玻片放在干净的培养皿上。在盖玻片的两个相对的一侧放置两个垫片（见 材料表）。注意：盖玻片的硫醇官能化对于水凝胶与盖玻片表面的共价连接是必要的。这是通过表面上的硫醇基团和水凝胶前体溶液中存在的丙烯酸酯基团的反应来完成的。 通过将垫片贴在培养皿上，将垫片固定在底盖上。 在非反应性全氟烷基化载玻片上移取所需体积的前体溶液。 将全氟烷基化载玻片放在底盖玻片上（图1C）。在室温下等待25分钟，水凝胶形成完成。 凝胶化后，轻轻取出全氟烷基化的载玻片。水凝胶将保持附着在基础盖玻片上。注：对于18 mm x 8 mm盖玻片以获得12.7μm厚的膜，请使用~7μL的前体溶液（图1A，B）。使用较大量的前体溶液可能导致基盖玻片下方的水凝胶。这可能会导致基础盖玻片粘在培养皿上，并在尝试移除时破裂。此外，盖玻片下方的水凝胶残留物对显微镜检查也有问题。需要轻柔地去除非反应性全氟烷基化载玻片，因为快速去除会损坏水凝胶。 将底物置于指定培养基中的60 mm x 15 mm培养皿中。在这里，在37°C下使用补充有100μg/ mL大观霉素的ATGN培养基用于 枯草芽孢杆菌 或100μg/ mL氨苄西林用于 大肠杆菌 24小时培养时间。 图1：硫化玻璃盖玻片上的水凝胶形成（A）厚度为12.7μm的垫片放置在含有活性硫醇基团的基础盖玻片的两个相对的侧面。（B） 将水凝胶前体溶液移液在非反应性氟化载玻片上。（C）将非反应性载玻片放置在垫片上，形成12.7μm厚的水凝胶。（D）轻轻地除去非反应性载玻片，留下附着在底盖玻片上的水凝胶。（E） 制备的水凝胶可在培养基中孵育用于培养。请点击此处查看此图的放大版本。 7. 微孔阵列上的水凝胶形成 微孔阵列中的细菌播种注意：将700μL0.1 OD600 细胞悬浮液接种在微孔阵列底物上，并使用Timm等人描述的方案应用Parylene剥离方法从背景中除去细胞。22. 通过将5.6μLPE-o-NB-二丙烯酸酯与12.5μLpH 8磷酸盐缓冲盐水ATGN混合并与6.9μL四臂PEG硫醇溶液混合来制备水凝胶前体溶液。 在非反应性全氟烷基化载玻片上移液12.5μL前体溶液，并将两个38μm钢垫片（见 材料表）放在接种细胞的微孔阵列底物的两个相对侧。 用前体溶液液滴反转全氟烷基化载玻片，并将液滴置于微孔基板的中间。然后，在室温下孵育25分钟以形成水凝胶。 轻轻地从微孔基板上取出载玻片。水凝胶膜应保持附着在微孔底物上。继续执行步骤 6.1.9。 8. 细胞提取的材料制备 PDMS 支架准备 将一堆 10 个 18 x 18 mm 的盖玻片粘在一起，并将这堆盖玻片粘在培养皿的底部。 为了制造PDMS支架，在塑料杯中以10：1的体积比混合PDMS前驱体和固化剂，在真空干燥器中对混合物进行脱气，然后将混合物倒入培养皿中。 在80°C下固化PDMS90分钟。 然后，在胶带块周围切割以取下PDMS支架，并将PDMS支架放在载玻片上，以便于显微镜操作。 微量注射器和管路制备 切下20厘米的PTFE管（0.05英寸内径），并将管子的一端连接到100μL微升注射器上。注意：对于提取，避免使用移液器，因为通过移液器吸头抽取释放的细胞会损坏水凝胶表面并导致污染。 9. 使用图案化照明工具进行水凝胶降解 注意：本节中描述的以下步骤对于散装水凝胶和微孔阵列是相同的，除了步骤9.6.4-9.6.6和9.6.7-9.6.10中描述的光暴露模式。 打开显微镜（见 材料表）。然后，打开图案照明工具（请参见 材料表）。 打开 365 nm LED 光源模拟和数字控制模块。接下来，打开LED光源控制模块。 打开显微镜软件和图案化照明工具的软件。打开硬件配置窗口后，选择” 加载 “按钮。注意：此处将加载三个设备。（第三方相机、控制模块、图案化照明工具） 按 “开始” 按钮。现在将打开光照图案化软件窗口。选择窗口左侧边栏上的第一个选项 ，即”设备控制 “按钮。 校准图案照明工具。注：校准必须使用与光照相同的显微镜物镜和滤光片进行。 将显微镜物镜设置为10倍放大倍率。注：此放大倍率允许显微镜透镜和样品表面之间有足够的工作距离。它还允许通过图像窗口实时监控和记录检索过程。 将显微镜镜头和滤光片设置为用于光照的设置，并将校准镜放在显微镜下。 在”设备控制”窗口中，按 “LED 控制 “选项卡。打开 LED #1 并将灯光强度设置为所需数量。在标准提取实验中，这设置为 60%。 在”设备控制”窗口中按标题为图案化照明工具产品名称的选项卡。然后，按 “显示网格 “按钮。注：校准镜上将投影一个网格图案。 调整显微镜对焦和相机曝光以获得高图像质量的网格，并旋转相机以对齐平行于相机窗框的网格线。 选择标有图案照明工具产品名称的选项卡下的校准 向导 按钮，然后按照此窗口中软件提供的说明进行操作。注：将打开第三方照相机设置窗口。 将打开校准类型选择窗口。选择 自动校准， 然后按 下一步。 当”预校准调整”窗口打开时，按照软件说明进行操作，然后按 “下一步 “按钮。 当”映射信息”窗口打开时，将此校准相应地保存在所需的文件夹中。这是通过输入日期，显微镜名称，物镜和滤光片来完成的。 校准后，按标题为图案化照明工具产品名称的选项卡下的” 工作区定义 “按钮，以根据需要定义图案化照明工具的工作区域。 用于图案准备的序列设计部分。 按软件窗口左侧边栏上的序列 设计 按钮。然后，按 “配置文件序列编辑器 “按钮。 当”配置文件序列编辑器”窗口打开时，选择”配置文件列表”下的”新建配置文件”选项。注意：现在，将打开”图案编辑器”窗口。 通过选择不同的图案形状和大小，为光照准备所需的图案，或者如果需要，请手动绘制图案。 对于散装水凝胶的圆形和破碎的交叉图案，请遵循步骤9.6.5- 9.6.6 对于圆形图案，在目标细菌菌落上定义一个直径为30μm的圆圈，以覆盖整个菌落。选择形状填充颜色白色。 对于断裂的交叉图案，请从图案绘制窗口中选择尺寸为 3 μm x 8 μm 的矩形形状。在目标菌落的边缘放置四个具有此尺寸的矩形，而一半的图案与菌落叠加在一起。 对于微孔阵列的圆形和环形图案，请执行步骤 9.6.8-9.6.10。 对于圆图案，在孔周边绘制一个直径为 10 μm 的圆。选择形状填充颜色白色。 对于戒指图案，绘制一个直径为20μm的圆圈，将其放在孔上，然后选择形状填充颜色白色。 绘制另一个直径为10μm的圆形图案，填充形状为黑色，并将其放置在井的周围。 根据所需的提取方法编辑图案并修改形状。确保所需图案存在于图案化照明工具的工作区域内。 将样品置于PDMS支架中，并将定义的培养基移液到样品顶部，以防止样品脱水并为释放的细胞提供载体溶液。 然后，将其替换为校准镜。 调整显微镜焦点以获得水凝胶内菌落的清晰图像。检查菌落以确定感兴趣的菌落。 在这里，设计光模式，同时相机视图显示样品内的菌落，以测试不同的细胞提取模式。 保存定义的模式。保存定义的模式后，选择”会话控制”部分。 在本节中，在标题为图案化照明工具产品名称的选项卡下，添加保存的序列。 添加序列后，选择模拟图案的选项，以查看并针对所需的曝光位置进行调整。注：样品位置可以在此处调整，以确保图案精确地投射到目标区域。 接下来，在LED控制选项卡下将光强度调整为60%，将曝光时间调整为40秒，然后开始曝光过程。 以实时和明场模式监测水凝胶降解，以确保细胞释放。注意：在光照下，防止样品的任何移动，因为这会导致水凝胶中不需要的区域退化，从而导致交叉污染。 10. 细胞检索 注意：细胞检索程序对于散装水凝胶和微孔阵列是相同的。 在365nm光照和细胞释放后，使用微升注射器和微流体管收集细胞（图2）。注意：细胞检索需要在图案曝光后立即进行。这允许在释放的细胞离开照射区域之前进行局部细胞恢复。 将显微镜从明场更改为FITC或TRITC滤光片，以便用肉眼观察样品的暴露区域。 找到暴露区域后，将管子的末端放在受辐射的点上。然后将显微镜滤光片切换回明场，以实时监测细胞检索。 使用连接到管子另一端的注射器小心地抽出释放的细胞。取出200μL溶液并将溶液插入1.5mL离心管中进行DNA分析或电镀。 图2：用于收集从水凝胶中释放的细胞的提取方法的示意图。 在这里，在365 nm紫外暴露，水凝胶降解和细胞释放后立即使用显微镜用来自TRITC滤光片的光照亮水凝胶样品，从而产生覆盖细胞释放区域的亮绿色斑点。这有助于用户识别样品采集的空间位置。在可视化该区域后，将连接到微升注射器的收集管放置在该位置并收集样品。10倍放大倍率的明场显微镜用于实时监测管材末端和水凝胶表面，以进行精确的细胞收集。 请点击此处查看此图的放大版本。 11. 基因组DNA纯化和DNA质量测量 使用DNA纯化试剂盒（ 见材料表）从细菌分离物中提取DNA。 遵循DNA纯化试剂盒手册23 中描述的制造商规范，直到最后一步（步骤7），需要用缓冲液AE洗脱。 对于洗脱步骤，请遵循制造商的规格，使用100μL缓冲液AE而不是200μL的区别。 按照步骤11.1.2中所述重复洗脱一次。这一步导致整体DNA产量的增加。 使用紫外可见分光光度计测量DNA质量（见 材料表）。 打开分光光度计。设备初始化后，在主页上，选择屏幕上的 dsDNA 选项。 接下来，抬起基座臂，用去离子水和无绒湿巾清洁基座位置。 在底座位置移取2μL空白溶液，这里为AE缓冲液，轻轻地将基座臂放下，然后在屏幕上选择 空白 。 接下来，抬起基座并用去离子水清洁基座位置，以去除先前测量中的任何残留材料。 将样品（2μL）加载到基座位置，将基座臂放下，然后选择屏幕上的” 测量 “按钮。 对所有样本重做步骤 11.2.4 和 11.2.5。 测量完成后，在屏幕上选择”结束实验”。将闪存驱动器插入设备，然后按屏幕上的”导出数据”。 12. 从水凝胶和微孔提取物中确定细胞活力 使用96孔板以稀释因子105 稀释细菌悬浮液。 移取10μL稀释的细菌悬浮液，并在ATGN板上对每个细菌悬浮液进行三次点。 倾斜平板以将细胞扩散到琼脂表面上。风干含有细菌悬浮液的ATGN板。 将板在37°C孵育48小时。计算并记录殖民地形成单位（CFU）数量。计算每个板上所有三种细菌悬浮液的扩散。注：在生物安全柜中执行步骤12.1-12.4，以避免污染板。

Representative Results

为了研究紫外光触发受控水凝胶降解以释放细胞的能力，首先将水凝胶封装在没有细菌存在的硫化盖玻片上。每个水凝胶暴露在不同强度和曝光时间的三种复制圆形模式的光下。在紫外光照射后计算凝胶降解百分比，在每种光强度下，然后通过将侧链硫醇基团与荧光素-5-maelimide染料偶联用于荧光成像来量化暴露时间19，24。这两个参数如何影响水凝胶降解的代表性示例如图3所示。显而易见，图案化照明工具提供的图案光以仅能够释放少量细胞的分辨率提供对水凝胶降解的时空控制。 图3：控制水凝胶降解。 紫外光剂量和由此产生的水凝胶降解速率可通过图案化照明工具进行调节。（插图）选择两种不同的光强度进行图案化水凝胶降解。在365nm紫外光照射后，用荧光素-5-马来酰亚胺标记水凝胶进行荧光成像。转载（改编）经Fattahi等人许可19 版权所有 2020 美国化学学会。请点击此处查看此图的放大版本。 对于细胞提取，使用不同的光模式来研究细胞释放（图4）。在这里， 将农杆菌 细菌细胞封装在硫醇化玻璃盖玻片上的散装水凝胶中，然后培养成微尺度菌落。然后在明场显微镜下检查水凝胶，并将目标微克隆暴露于不同的紫外光模式。观察到不同的暴露模式影响了释放细胞的形态。这对各种应用都有潜在的好处。例如，暴露目标菌落周围的环形图案会导致整个菌落的释放仍然封装在保护性PEG水凝胶中，并且没有直接的紫外线照射（图4A），这可以保存细胞并提供易于下游纯化。相反，通过将部分或全部菌落暴露在紫外光下，细胞可以作为聚集的细胞簇（图4B）或游离的单个细胞（图4C）提取。 图4：控制提取细胞的形态（A）使用环形图案释放整个细胞集落，保护在PEG基质中。（B） 使用破碎的交叉模式在聚集体中释放细胞。（C） 使用交叉图案释放单个细胞。经Fattahi等人许可转载（改编）19 请单击此处查看此图的放大版本。 封装方案中的关键是细胞接种密度和水凝胶的厚度，因为这两个参数都会影响掺入水凝胶中用于观察的细胞数量。为了证明，使用培养的薄垫片（12.7μm）或厚垫片（40μm）将 A. tumefaciens 细胞样品封装到两种不同厚度的水凝胶中，并按照既定方案成像。更薄的水凝胶导致整个水凝胶的微克隆密度为90个/ mm2， 其中观察到最小的菌落重叠（图5A）。相反，大于12.7μm的水凝胶厚度导致在垂直方向上形成重叠的菌落（图5B），这可能导致提取多个菌落。由于光图案的二维性质，重叠的菌落在提取过程中会导致交叉污染。例如，可以靶向顶部菌落，同时也可以用它提取底层菌落（图5C）。因此，建议使用12.7μm垫片进行水凝胶制备。 图5：水凝胶厚度影响提取纯度。 （A）通过利用厚度为12.7μm的垫片形成水凝胶，菌落在一个10倍的焦平面内形成。（B） 如果使用厚度大于12.7μm的垫片，则可以在10倍放大倍率下观察到菌落的覆盖。（C）在细胞释放过程中，菌落的叠加可能发生交叉污染：（i）使用环形模式释放靶向细胞集落，（ii）靶向细胞集落与水凝胶分离，以及（iii）在靶向集落下方的光照照期间观察到第二个潜在的集落。该菌落也被移除，导致交叉污染。转载（改编）经Fattahi等人许可19版权所有 2020 美国化学学会。请点击此处查看此图的放大版本。 鉴于紫外光对细菌的潜在损害，使用模型，革兰氏阳性菌（枯草芽孢杆菌）和模型，革兰氏阴性菌（大肠杆菌）进一步研究了各种紫外光微模式对细胞活力的影响。将每种水凝胶封装在散装水凝胶中，并根据标准方案培养成微尺度菌落，验证它们与水凝胶的相容性。然后将相同大小（26±1μm直径）的目标微克隆暴露于恒定的光剂量（168 mJ / mm2），以圆形模式的形式将整个微克隆暴露于紫外线或交叉模式，仅降解水凝胶边缘以最大限度地减少对细胞的光暴露。然后回收细胞并接种以量化从每个集落中回收的CFU / mL。未发现细胞恢复水平的显着差异（图6A）。为了进一步研究提取细胞的纯度，从 大肠杆菌 样品中提取DNA并使用紫外可见分光光度计进行分析。对于这两种模式，DNA质量水平都在A260/ A280 范围内，介于1.8和2.0之间（图6B），这是基因组测序的理想范围25。这表明，在所述条件下用于释放的UV模式对从大量水凝胶中回收的活细胞数量或提取后的基因组DNA质量的影响最小。 图6：不同光照模式对从大量水凝胶中释放的细菌的细胞活力和DNA质量的影响（A）使用交叉模式和圆形模式提取后大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的细胞恢复水平。对于该实验，从具有相同直径（26μm±1μm）的球形菌落中进行提取，以确保每个菌落释放的细胞数量是等效的。然后将提取的溶液电镀以计算从每种模式获得的CFU / mL。统计分析显示，从大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的交叉和圆形模式中获得的CFU / mL无显着差异（两种菌株的P值>0.05，n = 6）。（B） 使用交叉和圆形模式对分离的大肠杆菌细胞的DNA质量进行分光光度法定量。在这里，统计分析没有显示所用模式的DNA质量显着差异（P值>0.05，n = 6）（C）暴露于交叉和圆形图案的具有相同直径的菌落的明场图像。请点击此处查看此图的放大版本。 微孔阵列提供了一种替代的芯片实验室筛选界面，与散装水凝胶相比，可提供更可控的筛选功能。例如，微孔阵列可以将细菌接种到可以控制接种物中细胞数量的离散培养位点。微孔的几何特征，如井深和直径，也通过标准的微细加工方法进行控制。有了这些好处，微孔可用于研究细菌在空间限制下26的生长，最近用于发现不同细菌物种在微尺度上限制在一起时的共生和拮抗相互作用18。从孔中提取细胞进行基因组分析，如16S扩增子测序，对于这些应用至关重要。使用相同的水凝胶材料，紫外线可以暴露在含有感兴趣细胞的孔上，无论是圆形还是环形图案。 后者确保仅在微孔周边进行水凝胶降解，以防止细胞的直接照射。为了证明这一点，将表达mCherry 的A. tumefaciens 细胞接种到孔中，然后将水凝胶连接到微孔阵列上。培养细胞，然后用圆形或环形图案照射细胞。然后用荧光素-5-马来酰亚胺染料染色膜。双色荧光图像显示，膜和孔内的细胞都被移除以进行两种照射模式17。与体水凝胶形式不同，这里的细胞提取仅以细胞簇18的形状观察到。 图7：具有代表性的共聚焦显微镜图像，显示光模式对微孔阵列细胞分离的影响。（A） 在播种和培养后直径为40μm的含有细菌（红色）的微孔。（B） 使用圆形和环形图案（蓝色）进行光照。（C）减少的红色荧光表明细胞是从辐照孔中提取的。（D） 照射后膜和细菌的双色荧光图像，表明从靶井中去除水凝胶（绿色）和细菌（红色）。（E）Z-堆叠，目标孔的双色荧光图像。（D）中的红线表示在（E）中成像的xz平面，（E）中的绿线表示在（D）中成像的xy平面。将图像中的样品（C-E）洗涤以去除释放的细胞，然后固定并成像。比例尺 = 40 μm。转载（改编）经范德弗利斯等人许可17.版权所有 2019 美国化学公司。请点击此处查看此图的放大版本。 为了量化以这种格式提取后的细菌细胞活力和DNA质量，接种枯草芽孢杆菌和大肠杆菌细胞，然后使用圆形和环形图案从微孔阵列中释放（图8A，B）。然后将释放的细胞接种在ATGN琼脂平板上，并定量提取细胞的DNA质量。为了确保在每次提取过程中存在一致数量的细胞，具有相似荧光强度（〜6000 A.U.）的微孔因此被靶向释放。使用圆形图案提取的活细胞数量与使用环形图案提取的任一细菌的活细胞数量没有显着差异（图8C）。此外，两种细菌的圆圈和环形图案之间的DNA质量水平没有显着差异（图8D）。因此，与散装水凝胶中的发现类似，在这里指定的强度和持续时间下施加紫外光对从微孔阵列中提取的细胞的活力和DNA质量的影响可以忽略不计。这些发现表明，可以从微孔中选择性地检索活细菌细胞，而对下游分析的损害最小。 图8：不同光照模式对微孔阵列释放的细菌的细胞活力和DNA质量的影响。 （A，B）对于 大肠杆菌 和 枯草芽孢杆菌，圆图和环形图用于从10μm微孔中提取细胞。本实验使用直径为10μm的圆形图案和内径为10μm，外径为20μm的环形图案进行细胞提取。使用具有相同直径的微孔来确保每个微孔释放的细胞数量相同。（C）然后将提取的溶液电镀以计算从每种暴露模式获得的CFU / mL。统计分析显示 ，大肠杆菌 和 枯草 芽孢杆菌从圆形和环形图中获得的CFU/mL无显著差异（两种菌株的P值>0.05，n = 6）。（D） 分光光度法用于测量 大肠杆菌 和 枯草芽孢 杆菌细胞的DNA质量，使用圆形和环形图。在这里，统计分析没有显示所用模式的DNA质量有任何显着差异（两种菌株的P值>0.05，n = 6）。 请点击此处查看此图的放大版本。 补充图1：微孔阵列的设计和制造。（A）标准微加工技术被应用于在硅晶圆上制造微孔阵列。（B）每个基板由7 x 7个直径为10μm的井阵列组成，深度为20μm，间距为30μm。（C）每个阵列由225个微孔组成。这个数字是从Barua等人18修改而来的。版权所有 2021 前沿媒体。请点击此处下载此文件。

Discussion

本手稿展示了使用光降解水凝胶进行细菌筛选和分离。该材料和方法能够以直接且经济高效的方式实现高通量培养，控制生长培养基和生长条件，以及清洁和精确的细胞提取。提取只需要荧光显微镜与图案化照明工具相结合，并且可以按顺序完成以分离多个细胞靶标。每次提取需要5-10分钟才能完成，并且从单个水凝胶中除去多达30个靶向菌落。该方法的一个关键优点是其对各种不同测定形式的适应性，正如这里从散装水凝胶和微孔阵列中筛选所证明的那样。两种形式的分离过程已成功用于分离在培养和显微观察后表现出下游基因分型独特生长行为的细菌，这是将细胞基因型连接到表型的关键能力。迄今为止，从这些界面中提取的细菌的基因组表征包括16S扩增子测序，以鉴定来自环境微生物组的细菌的多物种集合，产生紧急生长行为^18，以及全基因组测序以成功鉴定导致突变文库中存在的细胞中罕见生长谱的基因突变^19。

使用散装水凝胶进行细胞筛选和分离是最直接和最简单的格式。在透明玻璃盖玻片上混合前体后，大量可光降解水凝胶迅速形成（25分钟），以将细胞封装在3-D细胞培养基质中，该基质用标准直立或倒置荧光显微镜成像。因此，该方法有可能转化为没有微加工资源或专业知识的常见微生物实验室。这种格式的缺点是细胞在整个三维水凝胶中随机定向。因此，当使用更高放大倍率物镜进行成像时，细胞可能会出现在焦平面之外，如果细胞集落彼此定向太近或存在垂直叠加的菌落，则提取可能很困难。如上所述沉积薄水凝胶（<13μm）对于减轻此缺点至关重要。在这里，在破碎的交叉光模式中曝光（图4B）是优选的，因为这种模式导致没有水凝胶的细胞对紫外线的暴露最小，并且可以通过电镀轻松恢复。

相比之下，微孔阵列格式提供了一个控制更好的接口，因为细菌细胞被分成离散的微孔，作为小培养或共培养位点17，18，26。微孔尺寸、间距和密度均使用标准光刻技术精确制造。与散装水凝胶相比，可以从微孔阵列中提取细菌，具有更高的特异性和更低的交叉污染机会，因为细胞仅存在于预定义的位置，而不是随机分散在整个水凝胶中。播种溶液中细菌细胞的浓度和比例也可以改变，以通过播种过程来控制微孔接种物的数量和组成，这在先前的报告²⁶中已经有所表征，使用户在筛选的实验设计中具有灵活性。使用微孔阵列形式进行筛选的主要缺点是微细加工所需的额外时间和专业知识。据估计，每个阵列的微孔制造成本约为10美元，其中包括材料成本和洁净室费用。此外，微孔阵列传统上由硅制成，由于基板不透明，这可能会导致成像困难。此外，来自硅表面的大量光散射会限制微孔内的成像，并且在使用来自图案化照明工具的UV光照射水凝胶期间会降低图案分辨率（如图8A，B所示）。在透明石英衬底上已经制造了类似的微孔，以解决这些类型的局限性²⁷;然而，这种制造要困难得多。在这里，暴露于照亮孔周边的环形图案是优选的，以便从孔中释放游离细胞，同时最大限度地减少紫外线照射。

无论哪种形式，最常见的问题都是由于水凝胶膨胀，在培养过程中水凝胶从底层底物上脱落。如果这是散装水凝胶的问题，则应使用适当的表面表征技术（XPS，ATR-FTIR，AFM等）验证基团在基材玻璃盖玻片表面上的化学（MTPS）附着层中硫醇基团的存在，密度和均匀性。由于表面功能化效率低下而导致的表面硫醇基团密度低，可导致底物与水凝胶之间的弱相互作用。如果发生低水平的表面硫化，应检查MTPS溶液的稳定性。在初始清洁载玻片时应小心，以确保在MTPS处理之前表面清洁，并应注意确保在MTPS表面反应期间使用无水甲苯（协议第4节）。在微孔阵列的情况下，表面不被硫醇化，水凝胶而是通过水凝胶的部分填充附着在孔中，水凝胶将水凝胶锚定在硅衬底¹⁷上。如果水凝胶分离是该系统中的一个问题，则可以将更多的微孔或其他微尺度特征蚀刻到阵列中，以进一步将水凝胶锚定在基板上，以促进更强的附着力。

无论哪种形式，该技术的局限性都是水凝胶在细菌存在下的有限稳定性。已经注意到，一些细菌，如A. tumefaciens，可以在5-7天^17，19的过程中降解水凝胶，这限制了实验时间。目前正在对细菌降解机制进行调查;假设来自二丙烯酸酯单体的酯基团受到细菌介导的水解和/或酶降解的影响，如其它系统¹⁷中所述。开发更稳定的水凝胶化学物质将延长细菌可以留在水凝胶中的时间，并将筛选扩展到生长速度较慢的微生物。第二个限制是，在这两种格式中，细胞回收和提取都发生在开放环境中，导致相对较高的提取量（30-100μL），这可能容易受到外部污染。因此，必须注意确保从靶菌落中存在足够的细胞，同时最大限度地减少提取溶液体积。为了获得足够的细胞用于电镀和回收或提取DNA材料，观察到在散装水凝胶中，细胞必须培养足够长的时间以达到至少10μm的集落直径。为了降低细胞提取所需的体积，观察到使用微升注射器和管子（图2）比移液更有效。管道允许更准确地从释放点抽取分离物，需要更少的溶液体积并降低污染的机会。

未来的工作涉及了解水凝胶力学性质对细胞生长的影响，因为通过选择适当的基于PEG的各种分子量的单体前体^28，这些水凝胶的机械特征得到了很好的控制，并且机械相互作用可能在细菌行为^{中发挥重要作用29。}由于水凝胶材料可以很容易地掺入各种不同的系统和设备中，因此进一步的发展也集中在将这种材料集成到微流体系统中。这将减少飞升的提取溶液到皮升的体积，而目前开放收集格式需要传统的30-100μL体积。较小的溶液体积将大大减少潜在的污染，并使方法转向单细胞分离和表征。

Materials

(3-Mercaptopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	175617-25G	> 95%
Alconox detergent powder	Alconox	1104
Ammonium sulfate	Fisher Chemical	A702-500	Certified ACS Granular
Autoclave SK300C	Yamato Scientific	18016
Bacillus subtilis 1A1135	Bacillus Genetic Stock Center	1A1135
Brightfield upright microscope	Olympus Corporation	BX51
Calcium chloride, anhydrous	Fisher Chemical	C614-500	For Desiccators Pellets, 4-20 Mesh
Centrifuge 5702	Eppendorf	5702
Citric acid monohydrate	Sigma-Aldrich	C1909-500G	ACS reagent, > 99.0%
D-Glucose (Dextrose)	VWR Amresco Life Science	0188-1KG
Dneasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69504	DNA purification kit
DOWSIL 184 silicone elastomer base	Dow Silicones Corporation		Storage temperature: -30-60 °C
DOWSIL 184 silicone elastomer curing agent	Dow Silicones Corporation		Storage temperature: < 32 C
EPOCH2 microplate spectrophotometer	BioTek Instruments	EPOCH2
Escherichia coli ATCC 25922	Thermo Fisher Scientific	R19020
Ethanol, anhydrous	Fisher Chemical	459844
Fisherbrand microscope cover glass	Fisher Scientific	12540A
Fisherfinest premium microscope slides plain	Fisher Scientific	12-544-4
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	216763-500ML	Contains inhibitor, 30 wt% in H2O
Incu-Shaker Mini	Benchmark	E5-0014-01
Isopropanol	Sigma-Aldrich	190764
Magnesium sulfate, 7-hydrate	Macron Fine Chemicals	6066-04	Avantor Performance Materials, Inc.
Methanol	Sigma-Aldrich	179337-4L	ACS reagent, > 99.8%
NanoDrop One spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-ONEC-W
Nitrogen, compressed	Matheson	UN1066
Oxygen plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001-HP
Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene (4 arm-PEG)	NOF America Corporation	PTE-100SH	Sunbright-PTE-100SH
Phosphate buffered saline (PBS), 10X	VWR Amresco Life Science	K813-500ML	Store between 15 °C–30 °C
Polydimethyl siloxane (PDMS) Slygard 184	Dow Corning	4019862
Polygon400	Mightex	DSI-D-000
Premium microscope slides	Fisher Scientific	12-544-4	25 x 75 x 1 mm
Sodium chloride	Sigma Life Science	S5886-500G	Bioreagent, suitable for cell culture
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045-500G	BioXtra, > 98%, pellets (anhydrous)
Sodium phosphate monobasic dihydrate	Sigma-Aldrich	71505-250G	BioUltra, for molecular biology, > 99.0% (T)
Stainless steel thickness gage	Precision Brand Products	77739
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	320501-2.5L
Toluene, anhydrous, 99.8%	Sigma-Aldrich	244511-1L	Anhydrous, > 99.8%
Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooctyl) silane (TPS), 97%	Sigma-Aldrich	448931-10G
Tryptic soy broth	Sigma-Aldrich	22092-500G	For microbiology
Ultrasonic sonicator	Fischer Scientific	FS-110H