Yüksek çözünürlüklü bir ışık sıvazlama aracı kullanarak bakteri hücrelerini izole etmek için fotobozunur hidrojellerin kullanıldığı bildirilmektedir. Sürecin temel deneysel prosedürleri, sonuçları ve avantajları gözden geçirilmiştir. Yöntem, heterojen topluluklardan veya popülasyonlardan nadir veya benzersiz işlevler gösteren hedeflenen bakterilerin hızlı ve ucuz izolasyon edilmesini sağlar.
Biyologlar uzun zamandır fenotip ve genotip arasındaki ilişkiyi anlamaya çalıştılar. Bu bağlantıyı daha iyi anlamak için, aşağı akış genetik analizi için mikroskobik hücre taramasını hücre izolasyonu ile yüksek saflıkta birleştirilen pratik teknolojiler geliştirmek çok önemlidir. Burada, heterojen hücre popülasyonlarından benzersiz büyüme fenotiplerine sahip bakterilerin taranır ve izolasyonu için fotobozunur poli (etilen glikol) hidrojellerin kullanımı açıklanmıştır. Yöntem, hücreleri hidrojel ile kapsüllemek veya içine almak, ardından kültür, mikroskobik tarama, daha sonra hidrojel bozulmasının mekansal kontrolü ve seçilen hücrelerin geri alma için bir çözeltiye salınması için yüksek çözünürlüklü bir ışık desenleme aracının kullanılmasına dayanır. Farklı ışık desenlerinin uygulanması, çıkarılan hücrenin morfolojisi üzerinde kontrol sağlar ve izolatlardaki DNA hasarını azaltmak için halkalar veya haçlar gibi desenler, en az doğrudan UV ışığına maruz kalan hücreleri almak için kullanılabilir. Ayrıca, ışık desenleme aracı, çeşitli bozulma ve hücre salınım hızlarına ulaşmak için ayarlanabilir bir ışık dozu sunar. Mikron ölçeğinde uzamsal hassasiyetle hücre alımını sağlayarak yüksek çözünürlükte bozulmaya izin verir. Burada, bu malzemenin hem dökme hidrojellerden hem de çip üzerindeki mikrofabrik laboratuvardan bakterileri taramak ve almak için kullanımı gösterilmiştir. Yöntem ucuz, basittir ve mutant kütüphanelerden nadir büyüme profillerine sahip bakteri suşlarının izolasyonu ve genomik karakterizasyonlar için acil fenotipli bakteri konsorsiyumlarının izolasyonu da dahil olmak üzere mikrobiyolojide yaygın ve gelişmekte olan uygulamalar için kullanılabilir.
Karmaşık ve heterojen bir ortamdan benzersiz davranışlara sahip hücrelerin izolasyonu biyolojide genetik bilgi elde etmek için temeldir1. Mikrobiyolojide, genomik bilgiler ile gözlemlenebilir fenotipik bilgiler arasında bağlantı gerektiren birçok uygulamada nadir veya benzersiz mikropların gözlemden sonra seçilmesi ve izolasyonu önem kazanmaktadır. Bu uygulamalar arasında mutant kütüphanelerden fenotipik olarak nadir suşların seçilmesi2, karmaşık mikrobiyal topluluklardan kilit taşı mikroorganizmalarının seçilmesi3,4ve izojenik popülasyonlardan fenotipik olarak nadir ancak önemli bakterilerin seçilmesi yer almaktadır. Canlı ancak kültüre dönüştürülemeyen hücrelerin (VBNC) bakteri popülasyonundan izolesi, VBNC fenotipine sahip hücrelerin genellikle 1:102 ila 1:10 5 oranlarında5 ,6’dabakteri popülasyonlarında gizlendiği ikincisinin önemli bir örneğidir. Bakteri izolasyonundaki yaygın zorluklar nedeniyle, birçok fenotipik olarak nadir mikroorganizma hakkında çok şey bilinmemektedir. Bu sınırlamalar, önce hedef hücreyi veya hücreleri bir karışımdan tanımlamak ve daha sonra aşağı akış moleküler analizi için bunları almak ve izole etmek için hücre izolasyon tekniklerine duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır7.
Hücre izolasyonunun en yaygın yöntemlerinden bazıları akış sitometrisi ve floresan aktif hücre sıralama (FACS)8, immünmanyetik ayırma9,10ve mikroakışkanlar11 ‘dir. Bu yalıtım yöntemleri yüksek değere sahip olsa da, kullanımlarını sınırlayan dezavantajları da vardır. Örneğin, FACS takip genomik analizi için tek hücreli düzeyde rutin mikrobiyal izolasyon sağlayabilir3, ancak genellikle kullanılabilirliği ve giderinin yanı sıra aşağı akış kontaminasyon sorunları ile sınırlıdır11. Mikroakışkan akış sitometrisi gibi mikroakışkan tabanlı yaklaşımlar, geleneksel akış sitometrisine kıyasla, gerekli numune hacminde önemli bir azalma sağlayan çok dikkat çekmiş12. Bununla birlikte, mikroakışkan cihazlardan bireysel veya küçük hücre koleksiyonlarının ayrılması ve alınması genellikle daha karmaşık bir kurulum ve cihaz tasarımı gerektiren zorlu bir sorundur13. Birçok mikroakışkan tabanlı yaklaşım, hücreleri bir cihazda girilmeden ve gözlemlenmeden önce genetik olarak karakterize edilir14fonksiyonel bir ekran gerçekleştirirken gözlenen benzersiz türlerin sayısını sınırlar. Bu sınırlamalar göz önüne alındığında, birçok laboratuvarda yaygın kullanım için hücre taraması ve izolasyon için pratik olan hem yöntemlerin hem de malzemelerin daha fazla yenilendirilerek yenilendir.
Bu makale, bakteri taraması ve izolasyonu için yeni, malzeme tabanlı bir yaklaşım salamektedir. Yöntem, hücre kapsülleme, kültür, mikroskobik gözlem ve benzersiz fenotiplere sahip hedeflenen bakterilerin isteğe bağlı salınımı ve geri kazanımı için fotobozunur hidrojeller kullanır. Hidrojeller, her çapraz bağlantının o-nitrobenzyl grupları 15 içerdiği10 nmağ boyutu içerecek şekilde tasarlanmıştır. Malzeme, besin maddelerinin ve atık ürünlerin kültür için hücrelere ve hücrelerden yayılmasına olanak tanırken hücreleri gözlem için kapsüller veya hapsedir. Malzemenin dik bir mikroskopla desenli 365 nm UV ışık kaynağına maruzlenmesi, o-nitrobenzil gruplarının fotokopleajı yoluyla hidrojelin lokal olarak bozulmasını sağlar16,17. Bozulma, genomik ve potansiyel olarak proteomik ve transkriptomik analiz de dahil olmak üzere aşağı akış analizi için hücrelerin seçici olarak geri salınımını tetikler. Deneysel kurulum ve protokol nispeten basit, ucuz ve mikrobiyoloji laboratuvarlarına çeviriseldir. Sadece hidrojel oluşumu yoluyla hücre kapsüllemesi, yakalanan hücrelerin dik bir parlak alan ve floresan mikroskopla gözlemlenmesi ve geri alma için desenli bir UV ışık kaynağı ile ilgi çekici hücrelerin aydınlatılmasını gerektirir.
Taramaya yönelik bu materyal tabanlı yaklaşımın önemli bir avantajı, farklı tarama formatlarına uyarlanabilirliğidir. En temel formatında, malzeme dökme hidrojellerde heterojen bir hücre koleksiyonunu kapsülleyerek tarama için kullanılabilir. Hücreler daha sonra istenen fenotip için gözlenir ve genomik karakterizasyon için tek tek ilgi çekici hücreler çıkarılır. Daha ayrıntılı formatlarda, malzeme, cihazın istenen alanlarından hassas hücre salınımı ve alımı sağlamak için çip üzerindeki laboratuvar cihazlarına da entegre edilebilir. Her iki format da burada açıklanmıştır ve her ikisi de son zamanlarda yeni mikrobiyal tarama ve seçim uygulamalarınıetkinleştirdi 17,18,19. Yöntem burada model Gram-negatif organizmalar(Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens) ve bir model Gram-pozitif organizma (Bacillus subtilis) ile gösterilmiştir ve çeşitli diğer bakterilere kolayca genişletilmiştir.
Bu makale, bakteri taraması ve izolasyonu için fotobozunur hidrojellerin kullanımını göstermektedir. Malzeme ve yaklaşım, yüksek verimli kültür, büyüme ortamı ve büyüme koşulları üzerinde kontrol ve basit ve uygun maliyetli bir şekilde temiz ve hassas hücre ekstraksiyonu sağlar. Ekstraksiyon sadece desenli aydınlatma aracı ile birleştirilmiş floresan bir mikroskop gerektirir ve birden fazla hücre hedefini izole etmek için sıralı bir şekilde yapılabilir. Her ekstraksiyon 5-10 dakika sürer ve tek bir hidrojelden 30’a kadar hedeflenen koloni çıkarılmıştır. Yaklaşımın önemli bir avantajı, hem dökme hidrojellerden hem de microwell dizilerinden tarama ile burada gösterildiği gibi, çeşitli farklı test formatlarına uyarlanabilirliğidir. Her iki formattaki ayırma işlemi, hücre genotipini fenotipe bağlamak için kritik bir yetenek olan kültür ve mikroskobik gözlemden sonra aşağı akış genotipleme için benzersiz büyüme davranışı gösteren bakterileri izole etmek için başarıyla kullanılmıştır. Bugüne kadar, bu arayüzlerden çıkarılan bakterilerin genomik karakterizasyonları, acil büyüme davranışı üreten çevresel mikrobiyomlardan çok türlü bakteri koleksiyonlarını tanımlamak için16Samplicon dizilimini ve mutant kütüphanelerinde bulunan hücrelerde nadir büyüme profillerine neden olan genetik mutasyonları başarıyla tanımlamak için tam genom dizilimini içermektedir19.
Hücre taraması ve izolasyonu için dökme hidrojel kullanmak en basit ve basit formattır. Dökme fotobozunur hidrojeller, standart bir dik veya ters floresan mikroskobu ile görüntülenen 3-B hücre kültürü matrisinde hücreleri kapsüllemek için öncülleri şeffaf cam kapaklar üzerinde karıştırdıktan sonra hızla (25 dk) oluşur. Bu nedenle, yöntem mikrofabrikasyon kaynakları veya uzmanlığı olmayan yaygın mikrobiyoloji laboratuvarlarına çeviri potansiyeline sahiptir. Bu biçimin bir dezavantajı, hücrelerin üç boyutlu hidrojel boyunca rastgele yönlendirilmiş olmasıdır. Bu nedenle, hücreler daha yüksek büyütme hedefleri ile görüntüleme yaparken odak düzleminin dışında görünebilir ve hücre kolonileri birbirine çok yakın yönlendirilirse veya kolonilerin dikey bir kaplaması varsa ekstraksiyon zor olabilir. Açıklandığı gibi ince bir hidrojel (<13 μm) biriktirmek, bu dezavantajı azaltmak için kritik öneme sahiptir. Kırık çapraz ışık desenlerinde pozlama (Şekil 4B) burada tercih edilir, çünkü bu desen UV ışığına minimum maruziyete sahip hidrojel içermeyen hücrelerle sonuçlanır ve kaplama yoluyla kolayca kurtarılabilir.
Buna karşılık, bakteri hücreleri küçük kültür veya ortak kültür siteleri17 , 18,26olarak hizmet veren ayrı mikrowelllere bölündürken, microwell dizi formatı daha iyi kontrol edilen bir arayüz sağlar. Microwell boyut, perde ve yoğunluk standart fotolitografik teknikler kullanılarak tam olarak üretilmiştir. Dökme hidrojellerle karşılaştırıldığında, hücreler hidrojel boyunca rastgele dağılmadığı için, hücreler sadece önceden tanımlanmış yerlerde bulunduğundan, bakteriler daha yüksek özgüllük derecesine ve çapraz kontaminasyon şansına sahip mikrowell dizilerinden çıkarılabilir. Tohumlama çözeltisindeki bakteri hücrelerinin konsantrasyonu ve oranları, önceki raporlarda karakterize edilen bir tohumlama işlemi ile mikrowell inoculum miktarını ve bileşimini kontrol etmek için de değiştirilebilir26, kullanıcıya ekranın deneysel tasarımında esneklik sağlar. Microwell dizisi formatı ile taramanın birincil dezavantajı, mikrofabrikasyon için gereken ek zaman ve uzmanlıktır. Mikrowelllerin imalatının, malzeme maliyetleri ve temiz oda giderlerini içeren dizi başına ~ 10 $ ‘a mal olduğu tahmin edildi. Ek olarak, mikrowells dizileri geleneksel olarak silikondan yapılır, bu da substratlar şeffaf olmadığından görüntüleme zorluklarına neden olabilir. Ayrıca, silikon yüzeyden yüksek miktarda ışık saçılım mikrowells içinde görüntüleme sınırlayabilir ve desenli aydınlatma aracından UV ışığı ile hidrojel maruziyeti sırasında desen çözünürlüğünü azaltabilir (Şekil 8A,B’degörülür). Bu tür sınırlamaları gidermek için şeffaf kuvars substratlarında benzer mikrowelller üretilmiştir27; ancak, bu imalat önemli ölçüde daha zordur. Kuyunun çevresini aydınlatan halka desenlerine maruz kalmak, UV maruziyetini en aza indirirken kuyulardan serbest hücreler salmak için tercih edilir.
Her iki formatta da ortaya çıkan en yaygın sorun, hidrojel şişmesi nedeniyle kültür sırasında hidrojelin alttaki substrattan çıkarılmasıdır. Bu dökme hidrojeller için bir sorunsa, kimyasal (MTPS) bağlantı tabakasındaki tiyol gruplarının taban cam kapak kapağının yüzeyindeki varlığı, yoğunluğu ve homojenliği uygun bir yüzey karakterizasyon tekniği (XPS, ATR-FTIR, AFM vb.) kullanılarak doğrulanmalıdır. Verimsiz yüzey fonksiyonelleşmesi nedeniyle yüzey tiyool gruplarının düşük yoğunlukları, substrat ve hidrojel arasında zayıf bir etkileşime yol açabilir. Düşük düzeyde yüzey tiyolasyonu meydana gelirse, MTPS çözeltisinin stabilitesi kontrol edilmelidir. MTPS tedavisinden önce temiz bir yüzey sağlamak için cam kaydırağın ilk temizliğinde dikkatli olunmalı ve MTPS yüzey reaksiyonunda susuz toluen kullanımından emin olunmalıdır (Protokol Bölüm 4). Mikrowell dizileri söz konusu olduğunda, yüzeyler tiyolated değildir ve hidrojeller bunun yerine, hidrojelleri silikon substrata bağlayan hidrojel ile kuyuların kısmi doldurulması yoluyla bağlanır17. Hidrojel müfrezesi bu sistemde bir sorunsa, daha güçlü bağlanmayı teşvik etmek için hidrojel’i substrata daha fazla tutturmak için diziye daha fazla mikrowell veya diğer mikro ölçekli özellikler kazınabilir.
Tekniğin her iki formatta da bir sınırlaması, hidrojellerin bakteri varlığında sınırlı stabilitesidir. A. tumefaciensgibi bazı bakterilerin, deney süresini sınırlayan 5-7 gün17,19boyunca hidrojelleri bozabileceği belirtilmiştir. Bakteriyel bozulma mekanizmalarının mevcut soruşturması devam etmektedir; diakrilat monomerlerden mevcut olan ester gruplarının, diğer sistemlerde belirtildiği gibi bakteri aracılı hidroliz ve/veya enzimatik bozulmaya maruz kaldığı varsayılır17. Daha kararlı hidrojel kimyaları geliştirmek, bakterilerin hidrojelde kalabileceği süreyi uzatacak ve ekranı daha yavaş büyüme oranlarına sahip mikroorganizmalara genişletecektir. İkinci bir sınırlama, her iki formatta da, hücre kurtarma ve ekstraksiyonu açık bir ortamda meydana gelir ve bu da dış kontaminasyona duyarlı olabilen nispeten yüksek ekstraksiyon hacimlerine (30-100 μL) neden olur. Bu nedenle, ekstraksiyon çözeltisi hacmini en aza indirirken hedef kolonilerden yeterli hücrenin bulunduğundan emin olmak için dikkatli olunmalıdır. Kaplama ve geri kazanım veya DNA materyalinin çıkarılması için yeterli hücre elde etmek için, dökme hidrojellerde hücrelerin en az 10 μm koloni çaplarına ulaşacak kadar uzun süre kültürlenmesi gerektiği gözlenmiştir. Hücre ekstraksiyonu için gerekli hacmi azaltmak için, bir mikroliter şırınga ve boru kullanmanın (Şekil 2) pipetlemeden daha verimli olduğu gözlenmiştir. Boru, izolelerin serbest bırakma noktasından daha doğru bir şekilde çekilmesini sağladı, daha az çözelti hacmi gerektirdi ve kirlenme olasılığını azalttı.
Gelecekteki çalışmalar, hidrojel mekanik özelliklerinin hücre büyümesi üzerindeki etkisinin anlaşılmasını içerir, çünkü bu hidrojellerin mekanik özellikleri çeşitli moleküler ağırlıkların uygun PEG tabanlı monomer öncüllerinin seçimi ile iyi kontrol edilir28ve mekanik etkileşimler muhtemelen bakteri davranışında önemli bir rol oynar29. Hidrojel malzemeler çeşitli farklı sistem ve cihazlara kolayca dahil edilebildiğinden, bu malzemenin mikroakışkan sistemlere entegrasyonuna da odaklanmaktadır. Bu, şu anda açık koleksiyon formatında gerekli olan geleneksel 30-100 μL hacimlere kıyasla, femtoliter’den picoliter hacimlerine ekstraksiyon çözümünü azaltacaktır. Daha küçük çözelti hacimleri potansiyel kontaminasyonu büyük ölçüde azaltır ve yaklaşımı tek hücreli izolasyon ve karakterizasyona doğru taşır.
The authors have nothing to disclose.
Bu araştırma NSF CAREER Award #1944791 tarafından desteklendi.
(3-Mercaptopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 175617-25G | > 95% |
Alconox detergent powder | Alconox | 1104 | |
Ammonium sulfate | Fisher Chemical | A702-500 | Certified ACS Granular |
Autoclave SK300C | Yamato Scientific | 18016 | |
Bacillus subtilis 1A1135 | Bacillus Genetic Stock Center | 1A1135 | |
Brightfield upright microscope | Olympus Corporation | BX51 | |
Calcium chloride, anhydrous | Fisher Chemical | C614-500 | For Desiccators Pellets, 4-20 Mesh |
Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702 | |
Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909-500G | ACS reagent, > 99.0% |
D-Glucose (Dextrose) | VWR Amresco Life Science | 0188-1KG | |
Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | DNA purification kit |
DOWSIL 184 silicone elastomer base | Dow Silicones Corporation | Storage temperature: -30-60 °C | |
DOWSIL 184 silicone elastomer curing agent | Dow Silicones Corporation | Storage temperature: < 32 C | |
EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments | EPOCH2 | |
Escherichia coli ATCC 25922 | Thermo Fisher Scientific | R19020 | |
Ethanol, anhydrous | Fisher Chemical | 459844 | |
Fisherbrand microscope cover glass | Fisher Scientific | 12540A | |
Fisherfinest premium microscope slides plain | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763-500ML | Contains inhibitor, 30 wt% in H2O |
Incu-Shaker Mini | Benchmark | E5-0014-01 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
Magnesium sulfate, 7-hydrate | Macron Fine Chemicals | 6066-04 | Avantor Performance Materials, Inc. |
Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | ACS reagent, > 99.8% |
NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | |
Nitrogen, compressed | Matheson | UN1066 | |
Oxygen plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001-HP | |
Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene (4 arm-PEG) | NOF America Corporation | PTE-100SH | Sunbright-PTE-100SH |
Phosphate buffered saline (PBS), 10X | VWR Amresco Life Science | K813-500ML | Store between 15 °C–30 °C |
Polydimethyl siloxane (PDMS) Slygard 184 | Dow Corning | 4019862 | |
Polygon400 | Mightex | DSI-D-000 | |
Premium microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | 25 x 75 x 1 mm |
Sodium chloride | Sigma Life Science | S5886-500G | Bioreagent, suitable for cell culture |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | BioXtra, > 98%, pellets (anhydrous) |
Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71505-250G | BioUltra, for molecular biology, > 99.0% (T) |
Stainless steel thickness gage | Precision Brand Products | 77739 | |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-2.5L | |
Toluene, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | 244511-1L | Anhydrous, > 99.8% |
Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooctyl) silane (TPS), 97% | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
Tryptic soy broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | For microbiology |
Ultrasonic sonicator | Fischer Scientific | FS-110H |