L’utilisation d’hydrogels photodégradables pour isoler les cellules bactériennes à l’aide d’un outil de tapotement de lumière à haute résolution est rapportée. Les procédures expérimentales essentielles, les résultats et les avantages du processus sont examinés. La méthode permet l’isolement rapide et peu coûteux de bactéries ciblées présentant des fonctions rares ou uniques provenant de communautés ou de populations hétérogènes.
Les biologistes tentent depuis longtemps de comprendre la relation entre le phénotype et le génotype. Pour mieux comprendre ce lien, il est crucial de développer des technologies pratiques qui associent le criblage cellulaire microscopique à l’isolement cellulaire à haute pureté pour l’analyse génétique en aval. Ici, l’utilisation d’hydrogels de poly(éthylène glycol) photodégradables pour le dépistage et l’isolement de bactéries avec des phénotypes de croissance uniques à partir de populations cellulaires hétérogènes est décrite. La méthode repose sur l’encapsulation ou le piégeage des cellules avec l’hydrogel, suivie d’une culture, d’un criblage microscopique, puis de l’utilisation d’un outil de modélisation lumineuse à haute résolution pour le contrôle spatio-temporel de la dégradation de l’hydrogel et la libération de cellules sélectionnées dans une solution à récupérer. L’application de différents modèles de lumière permet de contrôler la morphologie de la cellule extraite, et des motifs tels que des anneaux ou des croix peuvent être utilisés pour récupérer des cellules avec une exposition directe minimale aux rayons UV afin d’atténuer les dommages à l’ADN des isolats. De plus, l’outil de modélisation de la lumière fournit une dose de lumière réglable pour atteindre divers taux de dégradation et de libération cellulaire. Il permet la dégradation à haute résolution, permettant la récupération des cellules avec une précision spatiale à l’échelle du micron. Ici, l’utilisation de ce matériau pour filtrer et récupérer les bactéries des hydrogels en vrac et des dispositifs de laboratoire sur puce microfabriqués est démontrée. La méthode est peu coûteuse, simple et peut être utilisée pour des applications courantes et émergentes en microbiologie, y compris l’isolement de souches bactériennes avec des profils de croissance rares à partir de bibliothèques mutantes et l’isolement de consortiums bactériens avec des phénotypes émergents pour les caractérisations génomiques.
L’isolement de cellules ayant des comportements uniques dans un environnement complexe et hétérogène est fondamental pour obtenir des informations génétiques en biologie1. En microbiologie, la sélection et l’isolement de microbes rares ou uniques après observation deviennent importants dans de nombreuses applications qui nécessitent un lien entre l’information génomique et l’information phénotypique observable. Ces applications comprennent la sélection de souches phénotypiquement rares à partir de bibliothèques de mutants2,la sélection de micro-organismes clés à partir de communautés microbiennes complexes3,4et la sélection phénotypiquement rares mais importantes de bactéries à partir de populations isogéniques. L’isolement de cellules viables mais non cultivables (VBNC) d’une population bactérienne est un exemple important de cette dernière, où les cellules avec le phénotype VBNC sont souvent cachées dans des populations bactériennes à 1:102 à 1:105 rapports5,6. En raison des difficultés généralisées d’isolement des bactéries, beaucoup reste inconnu sur de nombreux micro-organismes phénotypiquement rares. Ces limitations soulignent la nécessité de techniques d’isolement cellulaire pour identifier d’abord la ou les cellules cibles à partir d’un mélange, puis les récupérer et les isoler pour une analyse moléculaire en aval7.
Certaines des méthodes les plus couramment établies d’isolement cellulaire comprennent la cytométrie en flux et le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)8,la séparation immunomagnétique9,10et la microfluidique11. Bien que ces méthodes d’isolement aient une grande valeur, elles présentent également des inconvénients qui limitent leur utilisation. Par exemple, le FACS peut fournir un isolement microbien de routine au niveau d’une seule cellule pour l’analyse génomique de suivi3, mais il est souvent limité par sa disponibilité et son coût, ainsi que par les problèmes de contamination en aval11. Les approches microfluidiques telles que la cytométrie en flux microfluidique ont suscité beaucoup d’attention, ce qui, par rapport à la cytométrie en flux conventionnelle, permet une réduction significative du volume d’échantillon requis12. Cependant, la séparation et la récupération d’une ou de petites collections de cellules à partir de dispositifs microfluidiques est souvent un problème difficile qui nécessite généralement une configuration et une conception de dispositif plus complexes13. De nombreuses approches microfluidiques caractérisent génétiquement les cellules avant qu’elles ne soient entrées et observées dans un dispositif14,limitant ainsi le nombre d’espèces uniques observées lors de la réalisation d’un écran fonctionnel. Compte tenu de ces limites, d’autres innovations de méthodes et de matériaux pratiques pour le criblage et l’isolement cellulaires sont nécessaires pour une utilisation généralisée dans de nombreux laboratoires.
Cet article présente une nouvelle approche basée sur les matériaux pour le dépistage et l’isolement des bactéries. La méthode utilise des hydrogels photodégradables pour l’encapsulation cellulaire, la culture, l’observation microscopique et la libération et la récupération à la demande de bactéries ciblées avec des phénotypes uniques. Les hydrogels sont conçus pour contenir un maillage de 10 nm, où chaque réticulation contient desgroupes o-nitrobenzyle15. Le matériau encapsule ou piège les cellules pour l’observation tout en permettant la diffusion des nutriments et des déchets vers et depuis les cellules pour la culture. L’exposition du matériau à une source de lumière UV à motifs de 365 nm à travers un microscope vertical permet une dégradation locale de l’hydrogel par photodéveloppement des groupes o-nitrobenzyle16, 17. La dégradation déclenche la libération sélective de cellules pour la récupération en vue d’une analyse en aval, y compris l’analyse génomique et, potentiellement, protéomique et transcriptomique. La configuration expérimentale et le protocole sont relativement simples, peu coûteux et translationnels pour les laboratoires de microbiologie. Il ne nécessite que l’encapsulation cellulaire par la formation d’hydrogel, l’observation des cellules capturées avec un microscope à champ lumineux et à fluorescence, et l’éclairage des cellules d’intérêt avec une source de lumière UV à motifs pour la récupération.
L’un des principaux avantages de cette approche du dépistage basée sur les matériaux est son adaptabilité aux différents formats de criblage. Dans son format le plus basique, le matériau peut être utilisé pour le criblage en encapsulant une collection de cellules hétérogènes dans des hydrogels en vrac. Les cellules sont ensuite observées pour le phénotype souhaité, et les cellules individuelles d’intérêt sont retirées pour la caractérisation génomique. Dans des formats plus élaborés, le matériau peut également être intégré dans des dispositifs de laboratoire sur puce pour fournir une libération et une récupération précises des cellules dans les zones souhaitées de l’appareil. Les deux formats sont décrits ici, et les deux ont permis de nouvelles applications récentes de dépistage et de sélection microbiens17,18,19. La méthode est démontrée ici avec des organismes à Gram négatif modèles (Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens) et un organisme modèle à Gram positif (Bacillus subtilis) et a été facilement étendue à une variété d’autres bactéries.
Ce manuscrit démontre l’utilisation d’hydrogels photodégradables pour le dépistage et l’isolement des bactéries. Le matériau et l’approche permettent une culture à haut débit, le contrôle des milieux de croissance et des conditions de croissance, ainsi qu’une extraction cellulaire propre et précise de manière simple et rentable. L’extraction ne nécessite qu’un microscope fluorescent couplé à l’outil d’éclairage à motifs et peut être effectuée de manière séquentielle pour isoler plusieurs cibles cellulaires. Chaque extraction prend 5 à 10 minutes et jusqu’à 30 colonies ciblées ont été retirées d’un seul hydrogel. L’un des principaux avantages de l’approche est son adaptabilité à une variété de formats de dosage différents, comme démontré ici avec le criblage à partir d’hydrogels en vrac et de réseaux de micropuits. Le processus de séparation dans les deux formats a été utilisé avec succès pour isoler les bactéries qui présentent un comportement de croissance unique pour le génotypage en aval après la culture et l’observation microscopique, une capacité essentielle pour connecter le génotype cellulaire au phénotype. À ce jour, les caractérisations génomiques des bactéries extraites de ces interfaces ont inclus le séquençage amplicon 16S pour identifier les collections multi-espèces de bactéries à partir de microbiomes environnementaux qui génèrent un comportement de croissance émergent18, et pour le séquençage du génome entier afin d’identifier avec succès les mutations génétiques qui provoquent des profils de croissance rares dans les cellules présentes dans les bibliothèques mutantes19.
L’utilisation d’hydrogels en vrac pour le criblage et l’isolement cellulaires est le format le plus simple et le plus simple. Les hydrogels photodégradables en vrac se forment rapidement (25 min) après avoir mélangé les précurseurs sur des couvercles en verre transparent pour encapsuler les cellules dans une matrice de culture cellulaire 3D imagée avec un microscope à fluorescence vertical ou inversé standard. Ainsi, la méthode a le potentiel d’être translationnelle pour les laboratoires de microbiologie courants qui ne disposent pas de ressources ou d’expertise en microfabrication. Un inconvénient de ce format est que les cellules sont orientées de manière aléatoire dans l’hydrogel tridimensionnel. Par conséquent, les cellules peuvent apparaître hors du plan focal lors de l’imagerie avec des objectifs de grossissement plus élevés et l’extraction peut être difficile si les colonies cellulaires sont orientées trop près les unes des autres ou s’il y a une superposition verticale de colonies. Le dépôt d’un hydrogel mince (<13 μm) tel que décrit est essentiel pour atténuer cet inconvénient. L’exposition à des motifs de lumière croisée brisée(Figure 4B)est préférable ici, car ce motif donne des cellules exemptes de l’hydrogel qui ont une exposition minimale à la lumière UV et peuvent être facilement récupérées par placage.
En revanche, le format de réseau de micropuits fournit une interface plus bien contrôlée, car les cellules bactériennes sont divisées en micropuits discrets qui servent de petits sites de culture ou de co-cultures17,18,26. La dimension, le pas et la densité des micropuits sont fabriqués avec précision à l’aide de techniques photolithographiques standard. Par rapport aux hydrogels en vrac, les bactéries peuvent être extraites de réseaux de micropuits avec un degré de spécificité plus élevé et un risque plus faible de contamination croisée, car les cellules ne sont présentes qu’à des endroits prédéfinis, et non dispersées au hasard dans l’hydrogel. La concentration et les ratios des cellules bactériennes dans la solution d’ensemencement peuvent également être modifiés pour contrôler la quantité et la composition de l’inoculum de micropuit grâce à un processus d’ensemencement caractérisé dans les rapports précédents26, donnant à l’utilisateur une flexibilité dans la conception expérimentale de l’écran. Le principal inconvénient du criblage avec le format de réseau de micropuits est le temps et l’expertise supplémentaires requis pour la microfabrication. La fabrication de micropuits a été estimée à environ 10 $ par réseau, ce qui comprend les coûts des matériaux et les dépenses en salle blanche. De plus, les réseaux de micropuits sont traditionnellement fabriqués à partir de silicium, ce qui peut causer des difficultés d’imagerie puisque les substrats ne sont pas transparents. De plus, une grande quantité de diffusion de la lumière à partir de la surface du silicium peut limiter l’imagerie dans les micropuits et peut diminuer la résolution du motif pendant l’exposition à l’hydrogel avec la lumière UV de l’outil d’éclairage à motifs (vu à la figure 8A,B). Des micropuits similaires ont été fabriqués sur des substrats de quartz transparents pour répondre à ces types de limitations27; cependant, cette fabrication est considérablement plus difficile. L’exposition à des motifs d’anneaux qui éclairent le périmètre du puits est préférable ici pour libérer les cellules libres des puits tout en minimisant l’exposition aux UV.
Le problème le plus courant qui se produit dans l’un ou l’autre format est le détachement de l’hydrogel du substrat sous-jacent pendant la culture en raison d’un gonflement de l’hydrogel. S’il s’agit d’un problème pour les hydrogels en vrac, la présence, la densité et l’uniformité des groupes thiol dans la couche de fixation chimique (MTPS) sur la surface du couvercle en verre de base doivent être vérifiées à l’aide d’une technique de caractérisation de surface appropriée (XPS, ATR-FTIR, AFM, etc.). De faibles densités de groupes thiols de surface dus à une fonctionnalisation de surface inefficace peuvent entraîner une faible interaction entre le substrat et l’hydrogel. Si un faible niveau de thiolation de surface se produit, la stabilité de la solution MTPS doit être vérifiée. Lors du nettoyage initial de la lame de verre, il faut veiller à assurer une surface propre avant le traitement MTPS, et veiller à ce que le toluène anhydre soit utilisé pendant la réaction de surface MTPS (section 4 du protocole). Dans le cas des réseaux de micropuits, les surfaces ne sont pas thiolées et les hydrogels se fixent plutôt par le remplissage partiel des puits avec l’hydrogel, qui ancre l’hydrogel au substrat desilicium 17. Si le détachement d’hydrogel est un problème dans ce système, plus de micropuits ou d’autres caractéristiques à l’échelle microscopique peuvent être gravés dans le réseau pour ancrer davantage l’hydrogel au substrat afin de favoriser une fixation plus forte.
Une limitation de la technique dans l’un ou l’autre format est la stabilité limitée des hydrogels en présence de bactéries. Il a été noté que certaines bactéries, telles que A. tumefaciens, peuvent dégrader l’hydrogel au cours de 5-7 jours17,19, ce qui limite le temps de l’expérience. Des recherches sont en cours sur les mécanismes de dégradation bactérienne; on suppose que les groupes esters présents à partir des monomères de diacrylate sont soumis à une hydrolyse médiée par les bactéries et/ou à une dégradation enzymatique, comme indiqué dans d’autres systèmes17. Le développement de chimies d’hydrogel plus stables prolongera le temps pendant lequel les bactéries peuvent rester dans l’hydrogel et étendra l’écran aux micro-organismes ayant des taux de croissance plus lents. Une deuxième limite est que dans les deux formats, la récupération et l’extraction cellulaires se produisent dans un environnement ouvert, ce qui entraîne des volumes d’extraction relativement élevés (30-100 μL), qui peuvent être sensibles à la contamination extérieure. Ainsi, il faut veiller à ce que suffisamment de cellules soient présentes dans les colonies cibles tout en minimisant le volume de la solution d’extraction. Pour obtenir suffisamment de cellules pour le placage et la récupération ou pour l’extraction de matériel ADN, il a été observé que dans les hydrogels en vrac, les cellules doivent être cultivées assez longtemps pour atteindre des diamètres de colonies d’au moins 10 μm. Pour réduire le volume requis pour l’extraction cellulaire, il a été observé que l’utilisation d’une seringue et d’un tube en microlitre (figure 2) était plus efficace que le pipetage. Le tube a permis de tirer les isolats du point de libération avec plus de précision, ce qui a nécessité moins de volume de solution et réduit le risque de contamination.
Les travaux futurs impliquent de comprendre l’effet des propriétés mécaniques de l’hydrogel sur la croissance cellulaire, car les caractéristiques mécaniques de ces hydrogels sont bien contrôlées par la sélection de précurseurs monomères appropriés à base de PEG de divers poids moléculaires28, et les interactions mécaniques jouent probablement un rôle important dans le comportement des bactéries29. Comme les matériaux d’hydrogel peuvent être facilement incorporés dans une variété de systèmes et de dispositifs différents, le développement ultérieur est également axé sur l’intégration de ce matériau dans les systèmes microfluidiques. Cela réduirait la solution d’extraction aux volumes femtoliter à picoliter, par rapport aux volumes traditionnels de 30 à 100 μL actuellement requis dans le format de collecte ouverte. Des volumes de solution plus faibles réduiraient considérablement la contamination potentielle et déplaceraient l’approche vers l’isolement et la caractérisation unicellulaires.
The authors have nothing to disclose.
Cette recherche a été soutenue par le NSF CAREER Award #1944791.
(3-Mercaptopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 175617-25G | > 95% |
Alconox detergent powder | Alconox | 1104 | |
Ammonium sulfate | Fisher Chemical | A702-500 | Certified ACS Granular |
Autoclave SK300C | Yamato Scientific | 18016 | |
Bacillus subtilis 1A1135 | Bacillus Genetic Stock Center | 1A1135 | |
Brightfield upright microscope | Olympus Corporation | BX51 | |
Calcium chloride, anhydrous | Fisher Chemical | C614-500 | For Desiccators Pellets, 4-20 Mesh |
Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702 | |
Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909-500G | ACS reagent, > 99.0% |
D-Glucose (Dextrose) | VWR Amresco Life Science | 0188-1KG | |
Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | DNA purification kit |
DOWSIL 184 silicone elastomer base | Dow Silicones Corporation | Storage temperature: -30-60 °C | |
DOWSIL 184 silicone elastomer curing agent | Dow Silicones Corporation | Storage temperature: < 32 C | |
EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments | EPOCH2 | |
Escherichia coli ATCC 25922 | Thermo Fisher Scientific | R19020 | |
Ethanol, anhydrous | Fisher Chemical | 459844 | |
Fisherbrand microscope cover glass | Fisher Scientific | 12540A | |
Fisherfinest premium microscope slides plain | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763-500ML | Contains inhibitor, 30 wt% in H2O |
Incu-Shaker Mini | Benchmark | E5-0014-01 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
Magnesium sulfate, 7-hydrate | Macron Fine Chemicals | 6066-04 | Avantor Performance Materials, Inc. |
Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | ACS reagent, > 99.8% |
NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | |
Nitrogen, compressed | Matheson | UN1066 | |
Oxygen plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001-HP | |
Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene (4 arm-PEG) | NOF America Corporation | PTE-100SH | Sunbright-PTE-100SH |
Phosphate buffered saline (PBS), 10X | VWR Amresco Life Science | K813-500ML | Store between 15 °C–30 °C |
Polydimethyl siloxane (PDMS) Slygard 184 | Dow Corning | 4019862 | |
Polygon400 | Mightex | DSI-D-000 | |
Premium microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | 25 x 75 x 1 mm |
Sodium chloride | Sigma Life Science | S5886-500G | Bioreagent, suitable for cell culture |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | BioXtra, > 98%, pellets (anhydrous) |
Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71505-250G | BioUltra, for molecular biology, > 99.0% (T) |
Stainless steel thickness gage | Precision Brand Products | 77739 | |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-2.5L | |
Toluene, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | 244511-1L | Anhydrous, > 99.8% |
Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooctyl) silane (TPS), 97% | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
Tryptic soy broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | For microbiology |
Ultrasonic sonicator | Fischer Scientific | FS-110H |