Potenziamento del rilassamento paramagnetico per rilevare e caratterizzare le auto-associazioni di proteine intrinsecamente disordinate
Summary
Viene presentato un protocollo per l’applicazione della spettroscopia NMR di potenziamento del rilassamento paramagnetico per rilevare interazioni inter- e intra-molecolari deboli e transitorie in proteine intrinsecamente disordinate.
Abstract
Le proteine intrinsecamente disordinate e le regioni intrinsecamente disordinate all’interno delle proteine costituiscono una parte ampia e funzionalmente significativa del proteoma umano. La natura altamente flessibile di queste sequenze consente loro di formare interazioni deboli, a lungo raggio e transitorie con diversi partner biomolecolari. Interazioni specifiche ma a bassa affinità promuovono il legame promiscuo e consentono a un singolo segmento intrinsecamente disordinato di interagire con una moltitudine di siti target. A causa della natura transitoria di queste interazioni, possono essere difficili da caratterizzare con metodi di biologia strutturale che si basano sulle proteine per formare una singola conformazione predominante. La NMR di miglioramento del rilassamento paramagnetico è uno strumento utile per identificare e definire la base strutturale delle interazioni deboli e transitorie. Viene descritto un protocollo dettagliato per l’utilizzo del potenziamento del rilassamento paramagnetico per caratterizzare i complessi di incontro scarsamente popolati che si formano tra proteine intrinsecamente disordinate e la loro proteina, acido nucleico o altri partner biomolecolari.
Introduction
Il disturbo intrinseco (ID) descrive proteine (IDP) o regioni all’interno delle proteine (IDR) che non si ripiegano spontaneamente in strutture secondarie o terziarie stabili ma sono biologicamente attive. In generale, la funzione degli IDP/IDR è quella di facilitare interazioni specifiche ma reversibili con le biomolecole in condizioni fisiologiche1. Pertanto, gli IDP e gli IDR sono coinvolti in una serie di funzioni cellulari, tra cui il reclutamento, l’organizzazione e la stabilizzazione di complessi multiproteici, ad esempio, l’assemblaggio e l’attività dello spliceosoma2, il reclutamento e l’organizzazione dei componenti nei siti di danno al DNA3, l’organizzazione e la stabilizzazione del reclutamento dei complessi di trascrizione4 o del rimodellatore della cromatina BAF5. Inoltre, gli IDP si trovano nei nessi di segnalazione in cui la loro promiscuità per diversi partner di legame consente loro di mediare il trasferimento di informazioni attraverso le reti proteiche cellulari6. Recenti lavori hanno anche rivelato una propensione per le regioni IDR ad auto-associare condensati biomolecolari formanti attraverso il processo di separazione di fase liquido-liquido7. Molte delle funzioni sopra menzionate che coinvolgono l’ID sono ora pensate per coinvolgere alcuni aspetti della formazione di condensa8. Nonostante l’importanza dell’ID per l’assemblaggio di complessi biomolecolari, la stabilizzazione, l’impalcatura e la trasduzione del segnale, i dettagli atomici delle loro interazioni specifiche sono difficili da identificare poiché gli IDP e gli IDR non sono tipicamente suscettibili di indagini strutturali utilizzando la cristallografia a raggi X o la microscopia elettronica criogenica.
La risonanza magnetica nucleare (NMR) è una tecnica ideale per studiare l’ID in quanto non dipende dalla presenza di insiemi strutturali rigidi o omogenei, ma riferisce sull’ambiente locale immediato dei singoli nuclei. La frequenza di risonanza, o spostamento chimico, di un nucleo in una data molecola è influenzata da deboli campi magnetici indotti dalla distribuzione elettronica locale, che a sua volta dipende dalle lunghezze di legame, dagli angoli, dalla vicinanza di altri nuclei, dalle interazioni con i partner di legame e da altri fattori9. Pertanto, ogni nucleo agisce come una sonda strutturale unica e specifica del sito sensibile ai cambiamenti nel suo ambiente chimico locale. Nonostante questi vantaggi, la NMR è una tecnica di massa e lo spostamento chimico osservato è la media di tutti gli ambienti campionati da un particolare nucleo. Una serie di tecniche NMR, molte delle quali sono descritte in questo numero, sono state sviluppate per recuperare informazioni strutturali, dinamiche e cinetiche su conformazioni biomolecolari ad alta energia e scarsamente popolate contenute nello spostamento chimico medio10,11. Sebbene popolati transitoriamente, l’identificazione e la quantificazione di questi stati sono importanti per determinare i dettagli dei meccanismi funzionali12. Ad esempio, nel caso degli IDP e degli IDR, l’insieme conformazionale può essere distorto per campionare preferenzialmente conformazioni che sono produttive per la formazione di complessi di incontro con partner di legame fisiologici. L’individuazione di questi stati, così come l’identificazione delle interazioni e dinamiche inter- e intra-molecolari specifiche del residuo, sono importanti per determinare i meccanismi strutturali sottostanti alla funzione e alla formazione delle proteine.
Viene descritto un protocollo per l’utilizzo della NMR di potenziamento del rilassamento paramagnetico (PRE) per studiare stati transitori e scarsamente popolati importanti per la formazione di complessi biomolecolari mediati da IDP/IDR13. Questo approccio è utile per studiare le interazioni transitorie proteina-proteina come quelle che promuovono l’assemblaggio di fibrille amiloidi da α-sinucleina 14,15 o l’autoassociazione di FUS16, nonché per caratterizzare specifiche interazioni proteina-proteina come tra proteine di segnalazione17. Viene presentato un esempio di IDP auto-associante, in cui specifiche interazioni inter- e intra-molecolari si traducono in stati preferenzialmente compattati e interazioni sito-specifiche che guidano l’auto-associazione.
Il PRE deriva dall’interazione dipolare magnetica di un nucleo ad un centro paramagnetico con un tensore g isotropo, comunemente fornito sotto forma di un elettrone spaiato su un gruppo nitroxide o come atomo metallico paramagnetico18 (Figura 1). Mentre gli atomi con tensori g anisotropi producono anche un effetto PRE, l’analisi di questi sistemi è più difficile a causa degli effetti confondenti forniti dagli spostamenti pseudo-di contatto (PCS) o dall’accoppiamento dipolare residuo (RDC)13,19. La forza dell’interazione tra un nucleo e il centro paramagnetico dipende dalla distanza <r-6> tra i due. Questa interazione si traduce in un aumento dei tassi di rilassamento nucleare, che causa un allargamento della linea rilevabile anche per interazioni a lungo raggio (~10-35 Å), perché il momento magnetico dell’elettrone spaiato è così forte20,21. Il rilevamento di stati transitori con il PRE è possibile se sono soddisfatte le seguenti due condizioni; (1) l’interazione transitoria è in rapido scambio sulla scala temporale NMR (lo spostamento chimico osservato è una media ponderata per la popolazione degli stati di scambio); e (2) la distanza tra nuclei e centro paramagnetico è più breve nello stato popolato transitoriamente che nello stato maggiore11. Il PRE trasversale è indicato con Γ2 e, per motivi pratici, è calcolato dalla differenza nei tassi di rilassamento trasversale 1H tra un campione contenente un centro paramagnetico e un controllo diamagnetico. Per una trattazione approfondita della teoria del PRE e dei relativi spostamenti pseudo-di contatto nei regimi di scambio rapido e lento, si rimanda il lettore alle recensioni complete di Clore e collaboratori13,22. Qui, viene considerata solo la situazione in cui 1H N-Γ2 è nel regime di scambio veloce, dove a causa della dipendenza r-6 del PRE, il tasso di rilassamento osservato è correlato sia alla distanza a cui il centro paramagnetico si avvicina al nucleo sia alla quantità di tempo che trascorre in quella conformazione. Pertanto, le conformazioni transitorie che non implicano un approccio ravvicinato producono un piccolo PRE mentre interazioni più strette, anche se di breve durata, produrranno un PRE più grande.
Per gli IDP, il PRE viene utilizzato per misurare e differenziare le interazioni che si verificano all’interno di una singola molecola (intramolecolare) e tra molecole separate (intermolecolari). Attaccando un centro paramagnetico a una proteina NMR visibile (ad esempio, 15N-marcata) o NMR invisibile (ad esempio, abbondanza naturale 14N), è possibile determinare la fonte (inter- o intra-molecolare) del PRE (Figura 2). La mutagenesi sito-diretta che introduce un residuo di cisteina è un approccio conveniente per attaccare un centro paramagnetico (spin-label) a una proteina23. Sono stati proposti diversi tipi di molecole per l’uso come etichette di spin, tra cui la chelazione dei metalli (a base di EDTA) e i radicali liberi (a base di nitroxide)24. Sono state descritte varie etichette di spin nitroxide e sono disponibili con diverse sostanze chimiche reattive alla cisteina come metanetiosolfonato, maleimmide e iodoacetamide25,26 (Figura 1). La flessibilità intrinseca del tag o del linker può essere problematica per alcune analisi e, in queste situazioni, sono state proposte diverse strategie per limitare il movimento del tag, ad esempio aggiungendo gruppi chimici ingombranti o l’uso di un secondo linker per ancorare il tag alla proteina (attacco a due siti)27, 28. Inoltre, i tag disponibili in commercio possono contenere proteine diastereomeriche, ma generalmente ciò non contribuirà al PRE29 osservato. L’uso del 3-Maleimido-PROXYL legato ad una cisteina libera tramite chimica maleimmide è descritto poiché è prontamente disponibile, economico, non reversibile e l’agente riducente tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP) può essere mantenuto nella soluzione per tutta la reazione di etichettatura. Poiché 3-Maleimido-PROXYL ha un tensore g isotropo, non vengono indotti PCS o RDC e le stesse assegnazioni di spostamento chimico possono essere utilizzate sia per i campioni paramagnetici che diamagnetici13.
L’1HN-T 2 viene misurato utilizzando una strategia a due punti temporali (T a, Tb) che in precedenza ha dimostrato di essere accurata quanto la raccolta di una serie di evoluzione completa composta da 8 a 12 punti temporali30. Il primo punto temporale (T a) è fissato il più vicino possibile allo zero e la lunghezza ottimale del secondo punto temporale dipende dalla grandezza del PRE più grande atteso per un dato campione e può essere stimato da: Tb ~ 1,15 / (R 2,dia + Γ 2) dove R 2,dia rappresenta l’R 2 del campione diamagnetico13. Se la grandezza dei PRE più grandi è sconosciuta, impostare T b a ~ una volta l’1H T 2 della proteina è una buona stima iniziale e ulteriormente ottimizzata regolando T2 per migliorare il segnale al rumore. Questa strategia di misurazione a due punti riduce significativamente il tempo sperimentale necessario per misurare i PR e consente di calcolare la media del segnale, in particolare perché vengono utilizzati campioni relativamente diluiti per ridurre al minimo gli effetti dei contatti non specifici tra le molecole. Una sequenza di impulsi basata su HSQC viene utilizzata per misurare 1H N-T2 ed è stata descritta in dettaglio altrove30. Per una migliore sensibilità, gli impulsi duri dei trasferimenti INEPT avanti e indietro possono essere sostituiti con impulsi sagomati; in alternativa, la sequenza viene prontamente convertita in una lettura basata su TROSY31. Poiché gli IDP hanno tipicamente tassi di rilassamento trasversale molto più lunghi con conseguenti larghezze di linea più strette (a causa del disturbo intrinseco) rispetto alle proteine globulari di dimensioni simili, lunghi tempi di acquisizione nella dimensione indiretta possono essere utilizzati per migliorare la risoluzione spettrale e alleviare la limitazione della dispersione dello spostamento chimico inerente agli IDP.
PRE è uno strumento utile per studiare le interazioni proteina-proteina e proteina-acido nucleico, in particolare le interazioni che sono transitorie o scarsamente popolate. Viene fornito un protocollo dettagliato per la preparazione di un campione NMR adatto alla misurazione dei PRE, comprese le fasi per la purificazione delle proteine, l’etichettatura dello spin diretto al sito, l’impostazione e la calibrazione del programma di impulsi, l’elaborazione e l’interpretazione dei dati NMR. Importanti considerazioni sperimentali sono notate in tutto ciò che può influire sulla qualità dei dati e sui risultati sperimentali, compresa la concentrazione del campione, la selezione dell’etichetta di spin e la rimozione dei componenti paramagnetici.
Protocol
Representative Results
Discussion
È stato presentato un metodo per caratterizzare le interazioni transitorie che esistono in popolazioni basse tra proteine intrinsecamente disordinate e vari partner di legame che utilizzano PRE. Nell’esempio mostrato, la proteina è auto-associante, e quindi la PRE può derivare da una combinazione di interazioni inter e intramolecolari. Questo metodo è facilmente esteso a campioni eterogenei in cui le interazioni tra due diverse proteine possono essere caratterizzate. Informazioni complementari su come interagiscono l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i dottori Jinfa Ying e Kristin Cano per le utili discussioni e l’assistenza tecnica. DSL è un St. Baldrick’s Scholar e riconosce il sostegno della St. Baldrick’s Foundation (634706). Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla Welch Foundation (AQ-2001-20190330) a DSL, dal Max and Minnie Tomerlin Voelcker Fund (Voelcker Foundation Young Investigator Grant to DSL), UTHSA Start-Up Funds a DSL e da una Greehey Graduate Fellowship in Children’s Health a CNJ. Questo lavoro si basa sulla ricerca condotta nelle Structural Biology Core Facilities, parte dei nuclei di ricerca istituzionali presso l’Health Science Center dell’Università del Texas a San Antonio supportati dall’Ufficio del Vice Presidente per la Ricerca e dal Mays Cancer Center Drug Discovery and Structural Biology Shared Resource (NIH P30 CA054174).
Materials
| 0.45 µm and 0.22 µm syringe filters | Millipore Sigma | SLHVM33RS SLGVR33RS |
Filter lysate before first purification step and before size exclusion chromatography. |
| 100 mm Petri Dish | Fisher | FB0875713 | Agar plates for bacterial transformation. |
| 14N Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 576794 | Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein |
| 15N Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 299251 | Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein |
| 3 L Fernbach baffled flask | Corning | 431523 | Bacterial expression culture |
| 3-Maleimido-Proxyl | Sigma Aldrich | 253375 | Nitroxide spin label |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Fisher | 14-432-22 | Solution/protein storage |
| Amicon centrifugal filter | Millipore Sigma | UFC900308 | Protein concentration |
| Ampicillan | Sigma Aldrich | A5354 | Antibiotic for a selective marker, exact choice depends on the expression construct plasmid |
| Analytical balance | Oahus | 30061978 | Explorer Pro, for weighing reagents |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | AX1775 | Reduces nitroxide spin label |
| Autoclave | Sterilize glassware and culture media | ||
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | M9 media component |
| Centrifuge bottles | Thermo Fisher | 010-1459 | Harvest E. coli cells after recombinant protein expression |
| Centrifuge, hand-crank | Thomas Scientific | 0241C68 | Boekel hand-driven, low-speed centrifuge with 15 mL buckets that can accommodate NMR tubes |
| Chelex 100 | Sigma Aldrich | C7901 | Remove contaminating paramagnetic compounds from buffer solutions |
| Computer workstation | Linux or Mac OS compatable with NMR data processing and analysis software packages such as NMRPipe and Sparky | ||
| Deuterium oxide | Sigma Aldrich | 151882 | Needed for NMR lock signal |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | M9 media component |
| Dibasic Sodium Phosphate | Sigma Aldrich | S5136 | M9 media component |
| Ellman's reagent (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Fisher | 22582 | Quantification of free cystiene residues |
| High speed centrifuge tubes | Thermo Fisher | 3114-0050 | Used to clear bacterial lysate. |
| High-field NMR instrument (600 – 800 MHz) | Bruker | Equiped with a multichannel cryogenic probe and temperature control | |
| IMAC column, HisTrap FF | Cytvia | 17528601 | Initial fractionation of crude bacterial lysate |
| Isopropyl B-D-thiogalactoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758 | Induces protein expression for genes under control of lac operator |
| LB agar | Thermo Fisher | 22700025 | Items are used for transforming E. coli to express protein of interest, substitions for any of these items with like products is acceptable. |
| LB broth | Thermo Fisher | 12780052 | |
| Low-pressure chromatography system | Bio-Rad | 7318300 | BioRad BioLogic is used for low-pressure chomatograph such as running IMAC columns |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | M9 media component |
| Medium pressure chromatography system | Bio-Rad | 7880007 | BioRad NGC equipped with a multi-wavelength detector, pH and conductivity monitors, and automatic fraction collector |
| MEM vitamin solution | Sigma Aldrich | M6895 | M9 media component |
| Microfluidizer | Avestin | EmulsiFlex-C3 | Provides rapid and efficient bacterial cell lysis |
| Micropipettes | Thermo Fisher | Calibrated set of micropippetters with properly fitting disposable tips (available from multiple manufacturers e.g. Eppendorf) | |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | 1551139 | M9 media component |
| NMR pipettes | Sigma Aldrich | 255688 | To remove sample from NMR tube |
| NMR sample tube | NewEra | NE-SL5 | Suitable for high-field NMR spectrometers |
| Preparative Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-HC | Harvest E. coli cells after recombinant protein expression |
| Round bottom polystyrene centrifuge tubes | Corning | 352057 | Clear bacterial lysate |
| Shaking incubator | Eppendorf | S44I200005 | Temperature controlled growth of E. coli starter and expression cultures |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S5886 | M9 media component |
| Sonicating water bath and vacuum source | Thomas Scientific | Used to degas buffer solutions | |
| Sonicator | Thermo Fisher | FB505110 | Used for bacterial cell lysis or shearing bacterial DNA |
| Spectrophotometer | Implen | OD600 Diluphotometer | Monitor growth of E.coli protein expression cultures |
| Superdex 200 16/600 size exculsion colum | Cytvia | 28989333 | Final protein purification step |
| Topspin software, version 3.2 or later | Bruker | Operating software for the NMR instrument | |
| Transformation competent E. coli cells | Thermo Fisher | C600003 | One Shot BL21 Star (DE3) chemically competent E. coli, other strains may be compatable |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | ThermoFisher | 20490 | Reducing agent compatable with some sulfhydryl-reactive conjugations |
| UV-Vis spectrophotometer | Implen | NP80 | Measure protein concentration. |
| Water bath, temperature controlled | ThermoFisher | FSGPD25 | For heat shock step of bacterial transformation |
| Yeast extract | Sigma Aldrich | Y1625 | For supplementing M9 media if required |
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