Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins(본질적으로 무질서한 단백질의 자기 연관성을 검출하고 특성화하기 위한 상자성 이완 향상)
Summary
본질적으로 무질서한 단백질에서 약하고 일시적인 분자 간 및 분자 내 상호 작용을 감지하기 위한 상자성 이완 강화 NMR 분광법의 적용을 위한 프로토콜이 제시됩니다.
Abstract
본질적으로 무질서한 단백질과 단백질 내의 본질적으로 무질서한 영역은 인간 프로테옴의 크고 기능적으로 중요한 부분을 구성합니다. 이러한 서열의 매우 유연한 특성으로 인해 다양한 생체 분자 파트너와 약하고 장거리이며 일시적인 상호 작용을 형성할 수 있습니다. 구체적이지만 친화도가 낮은 상호 작용은 무차별 결합을 촉진하고 본질적으로 무질서한 단일 세그먼트가 다수의 표적 부위와 상호 작용할 수 있도록 합니다. 이러한 상호 작용의 일시적인 특성으로 인해 단백질에 의존하여 하나의 우세한 형태를 형성하는 구조 생물학 방법으로 특성화하기 어려울 수 있습니다. 상자성 이완 강화 NMR은 약하고 일시적인 상호 작용의 구조적 토대를 식별하고 정의하는 데 유용한 도구입니다. 본질적으로 무질서한 단백질과 단백질, 핵산 또는 기타 생체 분자 파트너 사이에 형성되는 저인구 만남 복합체를 특성화하기 위해 상자성 이완 향상을 사용하기 위한 자세한 프로토콜이 설명됩니다.
Introduction
내인성 장애(ID)는 안정적인 2차 또는 3차 구조로 자발적으로 접히지 않고 생물학적으로 활성인 단백질(IDP) 또는 단백질 내 영역(IDR)을 설명합니다. 일반적으로 IDP/IDR의 기능은 생리학적 조건에서 생체 분자와의 특이적이면서도 가역적인 상호작용을 촉진하는 것이다1. 따라서, 국내실향민 및 IDR은 다중단백질 복합체의 모집, 조직 및 안정화, 예를 들어, 스플라이소좀2의 조립 및 활성, DNA 손상부위에서의 성분의 모집 및 조직화3, 전사 복합체4 또는 염색질 리모델러BAF5의 모집의 조직 및 안정화를 포함하는 다양한 세포 기능에 관여한다. 또한 IDP는 서로 다른 결합 파트너에 대한 난잡함으로 인해 세포 단백질 네트워크를 통한 정보 전달을 매개할 수 있는 신호 연결 고리에서 발견됩니다6. 최근 연구에서는 IDR 영역이 액체-액체 상 분리 과정을 통해 생체 분자 응축수를 자가 결합하는 경향이 있음이 밝혀졌다7. ID를 포함하는 전술한 기능들 중 많은 것들은 또한 응축수 형성(condensate formation)8의 어떤 측면을 포함하는 것으로 생각된다. 생체 분자 복합체 조립, 안정화, 스캐폴딩 및 신호 전달에 대한 ID의 중요성에도 불구하고, IDP 및 IDR은 일반적으로 X선 결정학 또는 극저온 전자 현미경을 사용한 구조 조사에 적합하지 않기 때문에 특정 상호 작용의 원자 세부 사항을 식별하기 어렵습니다.
핵 자기 공명(NMR)은 단단하거나 균질한 구조 앙상블의 존재에 의존하지 않고 개별 핵의 즉각적인 국소 환경에 대해 보고하기 때문에 ID를 조사하는 데 이상적인 기술입니다. 주어진 분자 내 핵의 공명 주파수(resonant frequency) 또는 화학적 이동(chemical shift)은 국소 전자 분포에 의해 유도된 약한 자기장의 영향을 받으며, 이는 다시 결합 길이, 각도, 다른 핵의 근접성, 결합 파트너와의 상호작용 및 기타 요인에 따라 달라진다9. 따라서 각 핵은 지역 화학 환경의 변화에 민감한 고유한 부위별 구조 프로브 역할을 합니다. 이러한 장점에도 불구하고 NMR은 벌크 기술이며 관찰된 화학적 이동은 특정 핵에 의해 샘플링된 모든 환경의 평균입니다. 이 문제에 설명된 다양한 NMR 기술은 평균 화학적 이동10,11에 포함된 고에너지, 저인구 생체 분자 형태에 대한 구조적, 동적 및 운동학적 정보를 복구하기 위해 개발되었습니다. 비록 일시적인 인구가 채워져 있기는 하지만, 이들 상태의 식별과 정량화는 기능적 메커니즘의 세부사항을 결정하는 데 중요하다12. 예를 들어, IDP 및 IDR의 경우, 구조적 앙상블은 생리학적 결합 파트너와의 만남 복합체의 형성을 위해 생산적인 샘플 형태를 우선적으로 샘플링하도록 편향될 수 있습니다. 이러한 상태의 검출과 잔류물 특이적 분자 간 및 분자 내 상호 작용 및 역학의 식별은 단백질 기능 및 복합체 형성의 기본 구조적 메커니즘을 결정하는 데 중요합니다.
IDP/IDR 매개 생체 분자 복합체의 형성에 중요한 일시적이고 인구가 적은 상태를 조사하기 위해 상자성 이완 향상(PRE) NMR을 사용하기 위한 프로토콜이 설명되어 있습니다13. 이 접근법은 α-시누클레인 14,15 또는 FUS 16의 자가 결합으로부터 아밀로이드 원섬유의 조립을 촉진하는 것과 같은 일시적인 단백질-단백질 상호작용을 연구하고 신호 전달 단백질17 사이의 특정 단백질-단백질 상호작용을 특성화하는 데 유용합니다. 자기 연관 IDP의 예가 제시되며, 특정 분자 간 및 분자 내 상호 작용이 우선적으로 압축된 상태와 자기 결합을 유도하는 부위별 상호 작용을 초래합니다.
PRE는 등방성 g-텐서가 있는 상자성 중심에 대한 핵의 자기 쌍극자 상호 작용에서 발생하며, 일반적으로 질산화물 그룹 또는 상자성 금속 원자18에 짝을 이루지 않은 전자의 형태로 공급됩니다(그림 1). 이방성 g-텐서를 가진 원자도 PRE 효과를 생성하지만, 이러한 시스템의 분석은 의사 접촉 이동(PCS) 또는 잔류 쌍극자 결합(RDC)에 의해 기여되는 교란 효과로 인해 더 어렵습니다13,19. 핵과 상자성 중심 사이의 상호 작용 강도는 둘 사이의 <r-6> 거리에 따라 달라집니다. 이 상호 작용은 핵 이완 속도를 증가시켜 장거리 상호 작용 (~ 10-35 Å)에서도 검출 가능한 선이 넓어지게하는데, 이는 짝을 이루지 않은 전자의 자기 모멘트가 매우 강하기 때문입니다20,21. PRE로 과도 상태를 감지하는 것은 다음 두 가지 조건이 충족되는 경우 가능합니다. (1) 일시적인 상호 작용은 NMR 시간 척도에서 빠른 교환에 있습니다(관찰된 화학적 이동은 교환 상태의 모집단 가중 평균임). (2) 상자성 중심 거리까지의 핵은 주요 상태(11)에서보다 일시적으로 채워진 상태에서 더 짧다. 횡방향 PRE는 Γ2로 표시되며, 실용적인 목적을 위해 상자성 중심과 반자성 대조군을 포함하는 샘플 사이의 1H횡방향 이완 속도의 차이로부터 계산됩니다. 빠르고 느린 교환 체제에서 PRE 이론 및 관련 의사 접촉 교대에 대한 심층적 인 치료를 위해 독자는 Clore와 동료13,22의 포괄적 인 검토를 참조합니다. 여기서, 1HN-Γ 2 가 빠른 교환 체제에있는 상황 만 고려되며, 여기서 PRE의 r-6– 의존성으로 인해 관찰 된 이완 속도는 상자성 중심이 핵에 접근하는 거리와 그 형태에서 소비하는 시간과 관련이 있습니다. 따라서 근접 접근을 포함하지 않는 과도 형태는 작은 PRE를 생성하는 반면, 근접 상호 작용은 수명이 짧더라도 더 큰 PRE를 생성합니다.
IDP의 경우 PRE는 단일 분자 내(분자 내)와 개별 분자 간(분자 간)에서 발생하는 상호 작용을 측정하고 구별하는 데 사용됩니다. 가시적(예: 15N-표지) 또는 가시적(예: 14N-자연적 존재비) NMR 단백질에 상자성 중심을 부착하여 PRE의 소스(분자간 또는 분자내)를 결정할 수 있습니다(그림 2). 시스테인 잔기를 도입하는 부위-지시적 돌연변이유발은 단백질23에 상자성 중심(스핀-라벨)을 부착하는 편리한 접근법이다. 금속 킬레이트화(EDTA 기반) 및 자유 라디칼(니트록시드 기반)을 포함하여 스핀 라벨로 사용하기 위해 여러 유형의 분자가 제안되었습니다.24. 다양한 산화질소 스핀 표지가 설명되었으며 메탄티오술포네이트, 말레이미드 및 요오도아세트아미드25,26과 같은 다양한 시스테인 반응성 화학 물질과 함께 사용할 수 있습니다(그림 1). 태그 또는 링커의 고유한 유연성은 특정 분석에 문제가 될 수 있으며, 이러한 상황에서는 부피가 큰 화학 그룹을 추가하거나 태그를 단백질에 고정하기 위해 두 번째 링커를 사용하는 것과 같이 태그의 움직임을 제한하기 위한 다양한 전략이 제안되었습니다(27). 28. 추가로, 상업적으로 이용가능한 태그는 부분입체이성질체 단백질을 함유할 수 있지만, 일반적으로 이것은 관찰된 PRE29에 기여하지 않을 것이다. 말레이미드 화학을 통해 유리 시스테인에 부착된 3-말레이미도-PROXYL의 사용은 쉽게 구할 수 있고 비용 효율적이며 비가역적이며 환원제인 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)이 라벨링 반응 전반에 걸쳐 용액에서 유지될 수 있기 때문에 설명됩니다. 3-Maleimido-PROXYL은 등방성 g-텐서를 갖기 때문에, PCS 또는 RDC가 유도되지 않으며, 상자성 및 반자성 샘플(13) 모두에 대해 동일한 화학적 이동 할당이 사용될 수 있다.
상기 1HNT2는 8 내지 12개의 시점으로 구성된 완전한 진화 시리즈를 수집하는 것만큼 정확한 것으로 이전에 밝혀진 2개의 시점 전략(Ta, Tb)을 사용하여 측정된다(30). 제 1 시점 (Ta)은 실제적으로 0에 가깝게 설정되고, 제 2 시점의 최적 길이는 주어진 샘플에 대해 예상되는 가장 큰 PRE의 크기에 의존하며, 다음으로부터 추정될 수 있다: Tb~1.15/(R2,dia+Γ2) 여기서 R2,dia는 반자성 샘플(13)의 R2를 나타낸다. 가장 큰 PRE의 크기가 알려지지 않은 경우, Tb를 단백질의 1H T2의 ~1배로 설정하는 것은 양호한 초기 추정치이며, 신호 대 잡음을 개선하기 위해 T2를 조정함으로써 추가로 최적화된다. 이 2점 측정 전략은 PRE를 측정하는 데 필요한 실험 시간을 크게 단축하고, 특히 분자 간의 비특이적 접촉의 영향을 최소화하기 위해 상대적으로 희석된 샘플이 사용되기 때문에 더 많은 신호 평균화를 위한 시간을 허용합니다. HSQC 기반 펄스 시퀀스는 1H, N-T2를 측정하는 데 사용되며 다른 곳에서도30에 자세히 설명되어 있습니다. 감도 향상을 위해 순방향 및 후방 INEPT 전송의 하드 펄스를 성형 펄스로 대체할 수 있습니다. 대안적으로, 시퀀스는 TROSY-기반 판독(31)으로 쉽게 변환된다. IDP는 일반적으로 유사한 크기의 구형 단백질보다 훨씬 더 긴 횡방향 이완 속도를 가지므로 (내재적 장애로 인해) 더 좁은 선폭을 초래하기 때문에 간접 차원에서 긴 획득 시간을 사용하여 스펙트럼 분해능을 개선하고 IDP에 내재된 화학적 이동 분산 제한을 완화할 수 있습니다.
PRE는 단백질-단백질 및 단백질-핵산 상호작용, 특히 일시적이거나 인구가 적은 상호작용을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 단백질 정제, 부위 지정 스핀 라벨링, 펄스 프로그램 설정 및 보정, NMR 데이터 처리 및 해석을 위한 단계를 포함하여 PRE 측정에 적합한 NMR 샘플을 준비하기 위한 자세한 프로토콜이 제공됩니다. 데이터 품질 및 실험 결과에 영향을 미칠 수 있는 중요한 실험 고려 사항(샘플 농도, 스핀 라벨 선택, 상자성 성분 제거)이 전체적으로 언급됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
PRE를 사용하여 본질적으로 무질서한 단백질과 다양한 결합 파트너 사이에 낮은 집단에 존재하는 일시적인 상호 작용을 특성화하는 방법이 제시되었습니다. 제시된 예에서, 단백질은 자가 회합이며, 따라서 PRE는 분자간 및 분자내 상호작용의 조합으로부터 발생할 수 있다. 이 방법은 두 개의 서로 다른 단백질 간의 상호 작용을 특성화할 수 있는 이종 샘플로 쉽게 확장됩니다. 단백질의 상이한 영?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
유용한 토론과 기술 지원을 해주신 Jinfa Ying 박사와 Kristin Cano에게 감사드립니다. DSL은 St. Baldrick’s Scholar이며 St. Baldrick’s Foundation(634706)의 지원을 인정합니다. 이 작업은 Welch Foundation(AQ-2001-20190330)에서 DSL로, Max and Minnie Tomerlin Voelcker Fund(DSL에 대한 Voelcker Foundation Young Investigator Grant), DSL에 대한 UTHSA 스타트업 펀드, CNJ에 대한 Greehey Graduate Fellowship in Children’s Health에서 부분적으로 지원되었습니다. 이 작업은 샌안토니오에 있는 텍사스 대학교 보건 과학 센터의 기관 연구 핵심의 일부인 구조 생물학 핵심 시설에서 수행된 연구를 기반으로 하며, 연구 담당 부사장실과 Mays Cancer Center 약물 발견 및 구조 생물학 공유 리소스(NIH P30 CA054174).
Materials
| 0.45 µm and 0.22 µm syringe filters | Millipore Sigma | SLHVM33RS SLGVR33RS |
Filter lysate before first purification step and before size exclusion chromatography. |
| 100 mm Petri Dish | Fisher | FB0875713 | Agar plates for bacterial transformation. |
| 14N Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 576794 | Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein |
| 15N Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 299251 | Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein |
| 3 L Fernbach baffled flask | Corning | 431523 | Bacterial expression culture |
| 3-Maleimido-Proxyl | Sigma Aldrich | 253375 | Nitroxide spin label |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Fisher | 14-432-22 | Solution/protein storage |
| Amicon centrifugal filter | Millipore Sigma | UFC900308 | Protein concentration |
| Ampicillan | Sigma Aldrich | A5354 | Antibiotic for a selective marker, exact choice depends on the expression construct plasmid |
| Analytical balance | Oahus | 30061978 | Explorer Pro, for weighing reagents |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | AX1775 | Reduces nitroxide spin label |
| Autoclave | Sterilize glassware and culture media | ||
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | M9 media component |
| Centrifuge bottles | Thermo Fisher | 010-1459 | Harvest E. coli cells after recombinant protein expression |
| Centrifuge, hand-crank | Thomas Scientific | 0241C68 | Boekel hand-driven, low-speed centrifuge with 15 mL buckets that can accommodate NMR tubes |
| Chelex 100 | Sigma Aldrich | C7901 | Remove contaminating paramagnetic compounds from buffer solutions |
| Computer workstation | Linux or Mac OS compatable with NMR data processing and analysis software packages such as NMRPipe and Sparky | ||
| Deuterium oxide | Sigma Aldrich | 151882 | Needed for NMR lock signal |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | M9 media component |
| Dibasic Sodium Phosphate | Sigma Aldrich | S5136 | M9 media component |
| Ellman's reagent (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Fisher | 22582 | Quantification of free cystiene residues |
| High speed centrifuge tubes | Thermo Fisher | 3114-0050 | Used to clear bacterial lysate. |
| High-field NMR instrument (600 – 800 MHz) | Bruker | Equiped with a multichannel cryogenic probe and temperature control | |
| IMAC column, HisTrap FF | Cytvia | 17528601 | Initial fractionation of crude bacterial lysate |
| Isopropyl B-D-thiogalactoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758 | Induces protein expression for genes under control of lac operator |
| LB agar | Thermo Fisher | 22700025 | Items are used for transforming E. coli to express protein of interest, substitions for any of these items with like products is acceptable. |
| LB broth | Thermo Fisher | 12780052 | |
| Low-pressure chromatography system | Bio-Rad | 7318300 | BioRad BioLogic is used for low-pressure chomatograph such as running IMAC columns |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | M9 media component |
| Medium pressure chromatography system | Bio-Rad | 7880007 | BioRad NGC equipped with a multi-wavelength detector, pH and conductivity monitors, and automatic fraction collector |
| MEM vitamin solution | Sigma Aldrich | M6895 | M9 media component |
| Microfluidizer | Avestin | EmulsiFlex-C3 | Provides rapid and efficient bacterial cell lysis |
| Micropipettes | Thermo Fisher | Calibrated set of micropippetters with properly fitting disposable tips (available from multiple manufacturers e.g. Eppendorf) | |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | 1551139 | M9 media component |
| NMR pipettes | Sigma Aldrich | 255688 | To remove sample from NMR tube |
| NMR sample tube | NewEra | NE-SL5 | Suitable for high-field NMR spectrometers |
| Preparative Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-HC | Harvest E. coli cells after recombinant protein expression |
| Round bottom polystyrene centrifuge tubes | Corning | 352057 | Clear bacterial lysate |
| Shaking incubator | Eppendorf | S44I200005 | Temperature controlled growth of E. coli starter and expression cultures |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S5886 | M9 media component |
| Sonicating water bath and vacuum source | Thomas Scientific | Used to degas buffer solutions | |
| Sonicator | Thermo Fisher | FB505110 | Used for bacterial cell lysis or shearing bacterial DNA |
| Spectrophotometer | Implen | OD600 Diluphotometer | Monitor growth of E.coli protein expression cultures |
| Superdex 200 16/600 size exculsion colum | Cytvia | 28989333 | Final protein purification step |
| Topspin software, version 3.2 or later | Bruker | Operating software for the NMR instrument | |
| Transformation competent E. coli cells | Thermo Fisher | C600003 | One Shot BL21 Star (DE3) chemically competent E. coli, other strains may be compatable |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | ThermoFisher | 20490 | Reducing agent compatable with some sulfhydryl-reactive conjugations |
| UV-Vis spectrophotometer | Implen | NP80 | Measure protein concentration. |
| Water bath, temperature controlled | ThermoFisher | FSGPD25 | For heat shock step of bacterial transformation |
| Yeast extract | Sigma Aldrich | Y1625 | For supplementing M9 media if required |
Referências
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