ऑर्थोटोपिक ओस्टियोसारकोमा और फेफड़ों के मेटास्टेसिस माउस मॉडल उत्पन्न करने के लिए इंट्राटिबियल ओस्टियोसारकोमा सेल इंजेक्शन
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल इंट्राटिबिया ओस्टियोसारकोमा सेल इंजेक्शन का वर्णन करता है ताकि ऑर्थोटोपिक ओस्टियोसारकोमा और फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस घावों वाले माउस मॉडल उत्पन्न किए जा सकें।
Abstract
Osteosarcoma बच्चों और किशोरों में सबसे आम प्राथमिक हड्डी का कैंसर है, जिसमें फेफड़े सबसे आम मेटास्टैटिक साइट के रूप में हैं। फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस के साथ osteosarcoma रोगियों की पांच साल की जीवित रहने की दर 30% से कम है। इसलिए, मनुष्यों में ऑस्टियोसारकोमा विकास की नकल करने वाले माउस मॉडल का उपयोग उपन्यास चिकित्सीय विकसित करने के लिए ऑस्टियोसारकोमा कार्सिनोजेनेसिस और फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस के मौलिक तंत्र को समझने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। यहां, ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं के इंट्राटिबिया इंजेक्शन के माध्यम से प्राथमिक ओस्टियोसारकोमा और फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस माउस मॉडल उत्पन्न करने के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं की सूचना दी गई है। बायोल्यूमिनेसेंस या एक्स-रे लाइव इमेजिंग सिस्टम के साथ संयुक्त, इन जीवित माउस मॉडल का उपयोग ऑस्टियोसारकोमा विकास और मेटास्टेसिस की निगरानी और मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है। इस मॉडल को स्थापित करने के लिए, ऑस्टियोसारकोमा कोशिकाओं वाले एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को एक माइक्रो-वॉल्यूम सिरिंज में लोड किया गया था और एनेस्थेटिक होने के बाद प्रत्येक एथाइमिक माउस के एक टिबिया में इंजेक्ट किया गया था। चूहों की बलि तब दी गई जब प्राथमिक ओस्टियोसारकोमा आईएसीयूसी-अनुमोदित प्रोटोकॉल में आकार सीमा तक पहुंच गया। ऑस्टियोसारकोमा वाले पैर और मेटास्टेसिस घावों वाले फेफड़ों को अलग कर दिया गया था। इन मॉडलों को एक छोटी इनक्यूबेशन अवधि, तेजी से विकास, गंभीर घावों और प्राथमिक और फुफ्फुसीय मेटास्टैटिक घावों के विकास की निगरानी में संवेदनशीलता की विशेषता है। इसलिए, ये ओस्टियोसारकोमा कार्सिनोजेनेसिस और फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में विशिष्ट कारकों के कार्यों और तंत्र की खोज करने और विवो में चिकित्सीय प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए आदर्श मॉडल हैं।
Introduction
Osteosarcoma बच्चों और किशोरों में सबसे आम प्राथमिक हड्डी का कैंसरहै 1,2, जो मुख्य रूप से आसपास के ऊतकों में घुसपैठ करता है, और यहां तक कि रोगियों का निदान होने पर फेफड़ों में मेटास्टेसाइज़ भी करता है। फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस ओस्टियोसारकोमा थेरेपी के लिए मुख्य चुनौती है, और फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस के साथ ओस्टियोसारकोमा रोगियों की पांच साल की जीवित रहने की दर 20% -30% 3,4,5 के रूप में कम बनी हुई है। हालांकि, कीमोथेरेपी 6 की शुरुआत के कारण 1970 के दशक के बाद से प्राथमिक ओस्टियोसारकोमा की पांच साल की जीवित रहने की दर को लगभग 70% तक बढ़ा दिया गयाहै। इसलिए, उपन्यास उपचार विकसित करने के लिए ऑस्टियोसारकोमा कार्सिनोजेनेसिस और फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस के मौलिक तंत्र को समझने के लिए तत्काल आवश्यकता है। माउस मॉडल का आवेदन जो मनुष्यों में ऑस्टियोसारकोमा प्रगति की सबसे अच्छी तरह से नकल करता है,7 का बहुत महत्व है।
Osteosarcoma पशु मॉडल सहज, प्रेरित आनुवंशिक इंजीनियरिंग, प्रत्यारोपण, और अन्य तकनीकों द्वारा उत्पन्न होते हैं। सहज osteosarcoma मॉडल शायद ही कभी लंबे ट्यूमर गठन समय, असंगत ट्यूमर घटना दर, कम रुग्णता, और खराब स्थिरता 8,9 के कारण उपयोग किया जाता है। यद्यपि प्रेरित ऑस्टियोसारकोमा मॉडल सहज ओस्टियोसारकोमा की तुलना में प्राप्त करने के लिए अधिक सुलभ है, प्रेरित ऑस्टियोसारकोमा मॉडल का आवेदन सीमित है क्योंकि उत्प्रेरण कारक माइक्रोएन्वायरमेंट, रोगजनन और ओस्टियोसारकोमा10 की रोग संबंधी विशेषताओं को प्रभावित करेगा। ट्रांसजेनिक मॉडल कैंसर के रोगजनन को समझने में मदद कर रहे हैं क्योंकि वे मानव शारीरिक और रोग संबंधी वातावरण को बेहतर ढंग से अनुकरण कर सकते हैं; हालांकि, ट्रांसजेनिक पशु मॉडल में भी कठिनाई, दीर्घकालिक और ट्रांसजेनिक संशोधन की उच्च लागत के कारण उनकी सीमाएं हैं। इसके अलावा, यहां तक कि पी 53 और आरबी जीन संशोधन द्वारा उत्पन्न सबसे व्यापक रूप से स्वीकृत ट्रांसजेनिक पशु मॉडल में, सार्कोमा का केवल 13.6% चार अंग हड्डियों11,12 में हुआ।
प्रत्यारोपण हाल के वर्षों में अपने सरल पैंतरेबाज़ी, स्थिर ट्यूमर गठन दर और बेहतर समरूपता13 के कारण सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले प्राथमिक और दूर के मेटास्टैटिक कैंसर मॉडल-उत्पादक तरीकों में से एक है। प्रत्यारोपण में प्रत्यारोपण स्थलों के अनुसार हेटरोटोपिक प्रत्यारोपण और ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण शामिल हैं। Osteosarcoma heterotopic प्रत्यारोपण में, osteosarcoma कोशिकाओं को जानवरों के प्राथमिक osteosarcoma साइटों (हड्डी) के बाहर इंजेक्ट किया जाता है, आमतौर पर त्वचा के नीचे, चमड़े के नीचे14। यद्यपि हेटरोटोपिक प्रत्यारोपण जानवरों में सर्जरी करने की आवश्यकता के बिना सीधा है, जिन साइटों पर ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं को इंजेक्ट किया जाता है, वे वास्तविक मानव ऑस्टियोसारकोमा माइक्रोएन्वायरमेंट का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं। ऑस्टियोसारकोमा ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण तब होता है जब ऑस्टियोसारकोमा कोशिकाओं को जानवरों की हड्डियों में इंजेक्ट किया जाता है, जैसे कि टिबिया15,16। हेटरोटोपिक ग्राफ्ट की तुलना में, ऑर्थोटोपिक ओस्टियोसारकोमा ग्राफ्ट को एक छोटी इनक्यूबेशन अवधि, तेजी से विकास और मजबूत इरोसिव प्रकृति की विशेषता है; इसलिए, वे osteosarcoma से संबंधित अध्ययन17 के लिए आदर्श पशु मॉडल हैं।
सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले जानवर चूहे, कुत्ते और ज़ेबराफ़िश18,19 हैं। ऑस्टियोसारकोमा के सहज मॉडल का उपयोग आमतौर पर कैनाइन में किया जाता है क्योंकि ओस्टियोसारकोमा कैनाइन में सबसे आम ट्यूमर में से एक है। हालांकि, इस मॉडल का आवेदन लंबे समय तक ट्यूमर गठन समय, कम होने की दर, खराब समरूपता और स्थिरता के कारण सीमित है। ज़ेबराफ़िश का उपयोग अक्सर ट्रांसजेनिक या नॉकआउट ट्यूमर मॉडल के निर्माण के लिए किया जाता है क्योंकि उनके तेजी से प्रजनन20। लेकिन ज़ेब्राफ़िश जीन मानव जीन से अलग हैं, इसलिए उनके अनुप्रयोग सीमित हैं।
यह काम एथाइमिक चूहों में ऑस्टियोसारकोमा कोशिकाओं के इंट्राटिबिया इंजेक्शन के माध्यम से फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस के साथ टिबिया में प्राथमिक ओस्टियोसारकोमा के उत्पादन के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं, सावधानियों और प्रतिनिधि छवियों का वर्णन करता है। इस विधि को चिकित्सीय प्रभावकारिता मूल्यांकन के लिए माउस टिबिया में प्राथमिक ओस्टियोसारकोमा बनाने के लिए लागू किया गया था, जिसने एक उच्च पुनरुत्पादन21,22 दिखाया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
Osteosarcoma कोशिकाओं के ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन osteosarcoma कार्सिनोजेनेसिस और चिकित्सीय प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए विकास में विशिष्ट कारकों के कार्य और तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल है। ट्यू?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को (1) चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2018YFC1704300 और 2020YFE0201600), (2) नेशनल नेचर साइंस फाउंडेशन (81973877 और 82174408) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
| BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | animal |
| Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
| Bioluminescence imaging system | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | tracking the tumor growth and pulmonary metastasis, if the injection cell is labeled by luciferase |
| Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
| MEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
| Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
| 1ml syringes | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | drilling |
| 143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Trypan blue | Beyotime Biotechnology | ST798 | Staining cells to assess activity |
| vector (pLV-luciferase) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Plasmid |
| Lipofectamine 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027,Thermo fisher | Plasmid transfection reagent |
| X-ray imaging system | Brook (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | X-ray images were obtained to detect tumor growth |
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